Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong thuốc bằng HPLC

ĐẶT VẤN ĐỀNăm 1929, Alexander Fleming đã phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu, sử dụng kháng sinh. Cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật và nhu cầu trong thực tế nhiều dòng kháng sinh mạnh, có phổ tác dụng rộng xuất hiện như cephalosporin, macrolid, quinolon,.... Kháng sinh được xem như là vũ khí quan trọng nhất đểđối phó với các bệnh do vi khuẩn gây ra. Nhờ kháng sinh mà hàng loạt căn bệnh từng đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe và tính mạng loài người như nhiễm khuẩn như lao, viêm phổi, viêm màng não, lậu, giang mai… được điều trị và khống chế có hiệu quả.Tuy nhiên theo thống kê của WHO, vấn đề kháng thuốc hiện nay có xu hướng gia tăng và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển. Việt Nam là một trong những quốc gia có tình trạng kháng kháng sinh cao nhất trên thếgiới. Để phục vụ nhu cầu điều trị, chăm sóc sức khỏe người dân, trên thịtrường dược phẩm Việt Nam lưu hành rất nhiều kháng sinh mới ra đời như cephalosporin thế hệ 3, thế hệ 4,.... Trong đó, cefepim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 4 có phổ tác dụng rộng, hiệu quả trên nhiều vi khuẩn, được sử dụng điều trị các nhiễm khuẩn nặng nên việc đảm bảo chất lượng thuốc rất được quan tâm. Hiện nay, chưa có chuyên luận kiểm tra các chếphẩm chứa cefepim trong Dược điển Việt Nam. Một vài phương pháp định lượng cefepim trong chế phẩm được công bố nhưng việc áp dụng vào điều kiện kiểm nghiệm ở Việt Nam gặp nhiều khó khăn.Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong thuốc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu:1. Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong thuốc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.2. Thẩm định phương pháp xây dựng.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HUYỀN TRANG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM TRONG THUỐC BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HUYỀN TRANG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM TRONG THUỐC BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths. Phạm Lê Minh Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài, tôi xin chân thành cảm ơn những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới ThS. Phạm Lê Minh, người trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian, tâm huyết, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo và các kỹ thuật viên ở bộ môn Hóa phân tích đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian tôi làm thực nghiệm tại bộ môn. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Lê Thị Huyền Trang MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CEFEPIME 3 1.1.1 Công thức cấu tạo của cefepim 3 1.1.2 Tính chất lý hóa 3 1.1.3 Dược lý 4 1.1.4 Dược động học 5 1.1.5 Chỉ định 5 1.1.6 Tác dụng không mong muốn, chống chỉ định 6 1.1.7 Liều lượng, cách dùng 6 1.1.8 Một số chế phẩm 7 1.2 . MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM 8 1.3 . SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 9 1.3.1 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao 9 1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký 9 1.3.3 Cấu tạo của hệ thống HPLC 9 1.3.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký 12 1.3.5 Ứng dụng của HPLC 15 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 18 2.1.1 Nguyên vật liệu 18 2.1.2 Thiết bị 18 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong chế phẩm 18 2.2.2 Ứng dụng định lượng cefepim trong chế phẩm 21 2.2.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 22 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 23 3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM BẰNG HPLC 23 3.1.1. Chuẩn bị mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng, pha động 23 3.1.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 23 3.1.3. Tiến hành định lượng 26 3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 26 3.2.1 Tính chọn lọc – Độ đặc hiệu 26 3.2.2 Độ thích hợp của hệ thống 30 3.2.3 Khoảng tuyến tính 31 3.2.3 Độ chính xác 33 3.2.4 Độ đúng 34 3.3. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM TRONG CHẾ PHẨM 37 3.4. BÀN LUẬN 38 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 4.1. KẾT LUẬN 40 4.2. KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatogtaphy). mg Miligam ml Mililit PA Tinh khiết phân tích (Pure Analysis) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) USP 32 Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopoeia) UV- Vis Tử ngoại- Khả kiến (Ultraviolet - Visible) WHO Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization ) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Một số chế phẩm có chứa cefepim 7 1.2 Một số phương pháp định lượng cefepim bằng HPLC 8 1.3 Một số phương pháp định lượng cefepim bằng quang phổ UV 8 3.1 Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký 31 3.2 Cách pha dung dịch chuẩn và kết quả khảo sát độ tuyến tính 32 3.3 Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp 34 3.4 Cách pha các dung dịch khảo sát độ đúng 35 3.5 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 36 3.6 Kết quả định lượng cefepim trong chế phẩm 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 1.1 Công thức cấu tạo của cefepim 3 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại của cefepim 24 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng 27 3.3 Sắc ký đồ mẫu cefepim chuẩn 0,5 mg/ml 27 3.4 Sắc ký đồ mẫu cefepim thử 0,5 mg/ml 28 3.5 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn của cefepim 28 3.6 Độ tinh khiết của pic sắc ký của cefepim 29 3.7 Chồng phổ cefepim của dung dịch chuẩn và thử 30 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic của cefepim 33 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1929, Alexander Fleming đã phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu, sử dụng kháng sinh. Cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật và nhu cầu trong thực tế nhiều dòng kháng sinh mạnh, có phổ tác dụng rộng xuất hiện như cephalosporin, macrolid, quinolon, Kháng sinh được xem như là vũ khí quan trọng nhất để đối phó với các bệnh do vi khuẩn gây ra. Nhờ kháng sinh mà hàng loạt căn bệnh từng đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe và tính mạng loài người như nhiễm khuẩn như lao, viêm phổi, viêm màng não, lậu, giang mai… được điều trị và khống chế có hiệu quả. Tuy nhiên theo thống kê của WHO, vấn đề kháng thuốc hiện nay có xu hướng gia tăng và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển. Việt Nam là một trong những quốc gia có tình trạng kháng kháng sinh cao nhất trên thế giới. Để phục vụ nhu cầu điều trị, chăm sóc sức khỏe người dân, trên thị trường dược phẩm Việt Nam lưu hành rất nhiều kháng sinh mới ra đời như cephalosporin thế hệ 3, thế hệ 4, Trong đó, cefepim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 4 có phổ tác dụng rộng, hiệu quả trên nhiều vi khuẩn, được sử dụng điều trị các nhiễm khuẩn nặng nên việc đảm bảo chất lượng thuốc rất được quan tâm. Hiện nay, chưa có chuyên luận kiểm tra các chế phẩm chứa cefepim trong Dược điển Việt Nam. Một vài phương pháp định lượng cefepim trong chế phẩm được công bố nhưng việc áp dụng vào điều kiện kiểm nghiệm ở Việt Nam gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong thuốc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu: 1. Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong thuốc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2. Thẩm định phương pháp xây dựng. 2 3. Áp dụng định lượng một số chế phẩm có chứa cefepim đang lưu hành ở Việt Nam. [...]... Tiến hành định lượng Chuẩn bị pha động, cho hệ thống chạy ổn định với pha động Tiêm lần lượt dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn Ghi lại diện tích pic thu được của các mẫu 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Để đảm bảo phương pháp định lượng đã xây dựng ở trên thích hợp để định lượng cefepim trong chế phẩm thuốc, chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp Gồm... Tazobactam 4 Maxipime Bột pha tiêm 3 tiêm Ltd., India Cefepim Bột pha Lupin laboratories +Tazobactam tiêm Ltd., India Cefepim 8 1.8 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM 1.8.1 Phương pháp định lượng cefepim bằng HPLC Bảng 1.2: Một số phương pháp định lượng cefepim bằng HPLC Tài Cột sắc ký Pha động Thể tích Detector Tốc độ liệu tiêm C18 (4,6 х 250 mm, 25 µm) [16] C18 (4,6 х 250 mm, 5 µm) [17] C18 (3,9 mm... Hàm lượng % cefepim trong chất chuẩn K: Khối lượng bột thuốc trung bình chứa 1g cefepim trong chế phẩm 2.2.3 Phương pháp xử lý, đánh giá kết quả Một số công thức tính toán:  Giá trị trung bình n X X  i 1 i n (2.2)  Độ lệch chuẩn n (X SD = i 1 i  X )2 (n  1) (2.3)  Độ lệch chuẩn tương đối S  100 (2.4) RSD = X 23 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM BẰNG... 1.3.5 Ứng dụng của HPLC [3], [7] 1.3.5.1 Định tính Thời gian lưu của chất thử và chất chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký tương ứng với nhau 1.3.5.2 Định lượng Việc định lượng các chất bằng HPLC có thể dựa vào so sánh chiều cao của đỉnh pic hoặc so sánh diện tích pic của chất cần xác định với một hay nhiều mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ Một số phương pháp định lượng hay dùng:  Phương pháp chuẩn ngoại:... RSD của hàm lượng mỗi mẫu thu được sau 6 lần phân tích độc lập Yêu cầu RSD ≤ 2% 2.2.2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng Cefepim trong chế phẩm đang lưu hành Hàm lượng % cefepim trong chế phẩm so với hàm lượng ghi trên nhãn tính theo công thức: 𝑆𝑡× 𝑚𝑐× 𝑃 × 𝐾 (2.1) 𝑆𝑐 × 𝑚𝑏 Trong đó: St, Sc: Diện tích pic tương ứng của mẫu thử, mẫu chuẩn %HL = mc: Khối lượng chất chuẩn mb: Khối lượng bột của... làm bằng thủy tinh đôi khi bằng thép không gỉ Dung môi cần lọc qua màng lọc 0,45 µm và đuổi khí hòa tan trong dung môi (thường sử dụng máy siêu âm) Phương pháp rửa giải thông thường chỉ cần 1 bình dung môi Phương pháp rửa giải gradient cần nhiều bình chứa các dung môi khác nhau 1.3.3.3 Hệ tiêm mẫu Có nhiều phương pháp tiêm mẫu: Phương pháp phổ biến dùng van tiêm có vòng chứa mẫu có dung tích xác định, ... 2ml/ph 1.8.2 Phương pháp khác định lượng cefepim Bảng 1.3: Một số phương pháp định lượng cefepim bằng Quang phổ UV Tài liệu [13] Nhà nghiên cứu Patel Chahana A, Patel Harsha U., Patel Chhaganbhai C [14] Mehul Patel, Jagdish Kakadiya, Nehal Shah Thiết bị Máy quang phổ Shimadzu UV-1800 , cuvet thạch anh 1cm Máy quang phổ Shimadzu UV-1800 , cuvet thạch anh 1cm Dung môi, tác nhân Hòa tan bằng nước , tác... lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent Technology 1200  Cân phân tích Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettigen Germany Te214 S  Máy siêu âm Ultrasonic LC60H  Máy đo pH Eutech Intruments pH 510  Máy lọc hút chân không Supelco 5- 8068  Bình định mức, cốc có mỏ, pipet, bơm tiêm, lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 µm 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong chế phẩm 2.2.1.2... dần và nằm trong khoảng tuyến tính Tiến hành sắc ký, ghi lại diện tích, chiều cao pic Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích (hoặc chiều cao) pic Dựa vào phương trình tính nồng độ chất thử  Phương pháp chuẩn nội: Thêm một lượng bằng nhau một chất chuẩn thứ hai (được gọi là chất chuẩn nội) vào trong cả mẫu thử và mẫu chuẩn, tiến hành sắc ký trong cùng... Thêm chính xác các lượng chất chuẩn đã biết nồng độ vào cùng một lượng mẫu thử, tiến hành sắc ký Xây dựng phương trình đường thẳng thể hiện mối tương quan giữa nồng độ và diện tích (hoặc đường cao) pic Nồng độ dung dịch thử là giao của đường thẳng tuyến tính với trục hoành  Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm . tiến hành đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong thuốc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu: 1. Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong thuốc bằng sắc ký lỏng. Thiết bị 18 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong chế phẩm 18 2.2.2 Ứng dụng định lượng cefepim trong chế phẩm 21 2.2.3 Phương pháp xử lý và đánh. 8 1.8. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM 1.8.1. Phương pháp định lượng cefepim bằng HPLC Bảng 1.2: Một số phương pháp định lượng cefepim bằng HPLC Tài liệu Cột sắc ký Pha động