Chuẩn bị pha động, cho hệ thống chạy ổn định với pha động.
Tiêm lần lượt dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn.
Ghi lại diện tích pic thu được của các mẫu.
3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG.
Để đảm bảo phương pháp định lượng đã xây dựng ở trên thích hợp để định lượng cefepim trong chế phẩm thuốc, chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp. Gồm các chỉ tiêu: Tính chọn lọc – Độ đặc hiệu Độ thích hợp của hệ thống sắc ký Độ tuyến tính Độ đúng Độ chính xác 3.2.1. Tính chọn lọc – Độ đặc hiệu
Mục đích: Thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể phân biệt rõ chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác trong mẫu.
Tiến hành:
Chuẩn bị mẫu trắng, mẫu cefepim chuẩn (0,5 mg/ml), mẫu cefepim thử (0,5 mg/ml) như mục 3.1.1, mẫu cefepim thử thêm chuẩn như bảng 3.4.
Tiến hành tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã lựa chọn.
Ghi lại sắc ký đồ. Kết quả:
1. Mẫu trắng
Hình 3.2: Sắc ký đồ mẫu trắng
2. Mẫu dung dịch cefepimchuẩn 0,5 mg/ml
3. Mẫu dung dịch cefepimthử 0,5 mg/ml
Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu cefepim thử 0,5 mg/ml
4. Mẫu dung dịch cefepim thử thêm chuẩn
Hình 3.5: Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn của cefepim
Đối với các hệ thống sắc ký có sử dụng detector mảng diod có thể xác định tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh khiết của pic hoặc so sánh phổ của chất chuẩn và chất thử.
Độ tinh khiết: 999,986
Hình 3.6: Độ tinh khiết của pic sắc ký của cefepim
Tiến hành chồng phổ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn, thu được kết quả:
Hệ số Match 999,998
Hình 3.7 : Chồng phổ cefepim của dung dịch chuẩn và thử.
Nhận xét:
Trên hình 3.2 ta thấy trong khoảng thời gian phân tích 8 phút của mẫu trắng không xuất hiện pic.
Trên hình 3.3, 3.4, 3.5 ta thấy trong mẫu dung dịch cefepim chuẩn, cefepim thử, và mẫu cefepim thử thêm chuẩn đều cho 1 pic có thời gian lưu tR= 4,63 phút.
Trên hình 3.6, độ tinh khiết của pic đạt 999,986. Trên hình 3.7, hệ số phù hợp đạt 999,998.
Điều này chứng tỏ pic trên sắc ký đồ là của cefepim, phương pháp định lượng có độ đặc hiệu cao.
3.2.2. Độ thích hợp của hệ thống.
Nguyên tắc: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch mẫu chuẩn cefepim vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Độ thích hợp của hệ thống được thể hiện thông qua số đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu, diện tích pic.
Tiến hành:
Tiêm mẫu qua hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn, ghi lại diện tích pic, thời gian lưu, hệ số đối xứng.
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký
STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s) Hệ số bất đối xứng 1 4,629 19863,6 0,814 2 4,630 19860,7 0,811 3 4,631 19858,7 0,814 4 4,631 19822,4 0,812 5 4,635 19863,0 0,811 6 4,632 19817,6 0,813 Trung bình 4,6313 19847,67 RSD 0,04% 0,11% Nhận xét:
Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic đều nhỏ hơn 2%.
Các giá trị của hệ số bất đối xứng0,8 ≤AF≤ 1,5.
Như vậy, chương trình đã chọn sử dụng để định lượng cefepim trong chế phẩm là phù hợp.
3.2.3. Khoảng tuyến tính
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của cefepim trong khoảng nồng độ biến thiên từ 0,25mg/ml đến 0,7 mg/ml.
Tiến hành:
Hút chính xác các thể tích dung dịch cefepim chuẩn 1mg/ml đã chuẩn bị ở mục 3.1.1. cho vào bình định mức 10,0 ml như bảng 3.2, thêm dung môi pha động vừa đủ đến vạch thu được dung dịch có nồng độ từ 0,25 mg/ml đến 0,7 mg/ml. Lắc đều.
Tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã lựa chọn.
Ghi lại giá trị diện tích pic tương ứng với các nồng độ chất chuẩn cefepim.
Kết quả khảo sát độ tuyến tính:
Bảng 3.2: Cách pha dung dịch chuẩn và kết quả khảo sát độ tuyến tính Nồng độ (mg/ml) 0,25 0,375 0,5 0,625 0,7 Thể tích dd cefepim (ml) 2,5 3,75 5,0 6,25 7,0 Thể tích dd pha động(ml)
Thêm vừa đủ dung dịch pha động vào bình định mức 10,0 ml.
Diện tích pic (mAU.s)
10123,28 15028,45 19840,43 24511,37 27940,51
Kết quả Phương trình hồi quy: y= 39152,63x + 304,02
nồng độ (mg/ml)
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic của cefepim
Nhận xét:
Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát, diện tích pic thu được tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch thể hiện qua đường thẳng hồi quy y=39152,63 x + 304,02 và hệ số tương quan R= 0,9997.
Như vậy, phương pháp tuyến tính trong khoảng nồng độ 0,25 mg/ml đến 0,7 mg/ml.
3.2.4. Độ chính xác
Nguyên tắc: Độ chính xác của một phương pháp phân tích được xác định bằng cách định lượng nhiều lần các dung dịch thử cùng một mẫu với số lượng đủ để xác định tính toán thống kê độ lệch chuẩn hay độ lệch chuẩn tương đối.
Trong HPLC tiến hành định lượng 6 lần, tính độ lệch chuẩn tương đối RSD, yêu cầu RSD ≤ 2%. Tiến hành: y = 39,152.6259x + 304.0213 R² = 0.9994 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử như phần 3.1.1.
Tiêm mẫu qua hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn, ghi lại diện tích pic.
Kết quả khảo sát độ chính xác:
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp
STT Khối lượng (g) Diện tích pic
(mAU.s) Hàm lượng % 1 0,0482 19582,37 99,40 2 0,0486 20615,5 103,78 3 0,0485 20389,07 102,61 4 0,0483 19870,5 100,65 5 0,0484 20138,67 101,80 6 0,0483 19827,35 100,44 Trung bình 0,0483 101,45 RSD 1,57%
Mẫu chuẩn: SC = 19840,43 (mAU.s), hàm lượng 82,62%.
Nhận xét:
Kết quả thẩm định độ chính xác của phương pháp cho thấy trong điều kiện sắc ký đã chọn, độ lệch chuẩn tương đối là 1,57% < 2%. Như vậy phương pháp có độ chính xác tốt.
3.2.5. Độ đúng
Nguyên tắc: Độ đúng được tính toán dựa trên tỷ lệ phần trăm phục hồi trong định lượng khi thêm một lượng chất tan đã biết cho vào mẫu đo, hoặc
dựa vào sự sai biệt giữa trị số trung bình và giá trị thực chấp nhận cùng với khoảng tin cậy.
Tiến hành:
Dung dịch thử 1mg/ml làm tương tự như phần 3.1.1. Pha dung dịch chuẩn 0,5 mg/ml tự như phần 3.1.1.
Thêm vào mẫu thử một lượng chất chuẩn 0,5 mg/ml tương ứng khoảng 10%, 20%, 30% so với lượng hoạt chất có sẵn như bảng 3.4. Thêm đủ thể tích bằng dung dịch pha động, lắc đều. Mỗi nồng độ làm 3 mẫu.
Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Ghi lại diện tích pic.
Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.4 : Cách pha các dung dịch khảo sát độ đúng
STT Thể tích mẫu thử 1mg/ml (ml) Thể tích mẫu chuẩn 0,5mg/ml (ml) Thêm dung dịch pha động vừa đủ vào bình định mức 10,0 ml. 10% 5 1 20% 5 2 30% 5 3
Bảng 3.5 : Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp STT Lượng thêm vào Diện tích pic (mAU.s) Lượng chuẩn thêm vào (mg/ml) Lượng tìm lại (mg/ml) % tìm lại 1.1 10% 21857.46 0,05 0,0508 101,66 1.2 21870,63 0,05 0,0512 102,33 1.3 21811,16 0,05 0,0497 99,33 Trung bình 101,11 RSD 1,56% 2.1 20% 23785,27 0,1 0,0994 99,41 2.2 23736,33 0,1 0,0982 98,18 2.3 23809,43 0,1 0,1000 100,02 Trung bình 99,20 RSD 0,94% 3.1 30% 25897,73 0,15 0,1527 101,77 3.2 25938,16 0,15 0,1537 102,45 3.3 25742,33 0,15 0,1487 99,16 Trung bình 101,13 RSD 1,72 %
% Thu hồi trung bình = 100,48% RSD = 1,10 %
Nhận xét:
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp cho kết quả lượng chất tìm lại nằm trong khoảng từ 98% đến 102% chứng tỏ phương pháp có độ đúng
cao, đảm bảo phép phân tích tốt khi xác định hàm lượng cefepim trong chế phẩm.