Xây dựng phương pháp định lượng acid p coumaric trong thân cây ý dĩ

ĐẶT VẤN ĐỀ Ý dĩ là loài cây bản địa của Việt Nam, từ lâu đã được trồng như một cây thuốc quý và cây tinh bột nhiều bổ dưỡng. Hầu hết các nghiên cứu trong nước và trên thế giới về Ý dĩ mới chỉ tập trung trên hạt là bộ phận được dùng phổ biến nhất. Bên cạnh hạt Ý dĩ, thân cây cũng được một số người dân sử dụng để điều trị đái tháo đường và là một thành phần trong bài thuốc điều trị sỏi tiết niệu. Tác dụng điều trị sỏi tiết niệu của thân cây Ý dĩ đã được chứng minh trên cả mô hình in vitro và in vivo. Từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat thân cây Ý dĩ, nhóm nhiên cứu của chúng tôi đã phân lập được acid p coumaric là một thành phần có tác dụng ức chế mạnh sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro với giá trị IC50 là 2,35 mM 13. Tuy nhiên hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào để xác định hàm lượng acid pcoumaric trong thân cây Ý dĩ. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “ Xây dựng phương pháp định lượng acid pcoumaric trong thân cây Ý dĩ ” với hai mục tiêu sau: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid pcoumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng acid p coumaric trong một số mẫu thân cây Ý dĩ.

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cám ơn sâu sắc nhất đến TS.Nguyễn Quỳnh Chi, TS.Phương Thiện Thương và DS.Nguyễn Thị Thảo là những thầy cô

đã trực tiếp hướng dẫn tận tình giúp em hoàn thành khóa luận này

Em cũng xin được gửi lời cám ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị

kỹ thuật viên của bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội và phòng hóa phân tích Viện Dược Liệu đã giúp đỡ em trong quá trình làm thực nghiệm

Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến tất cả các thầy cô của trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm học vừa qua

Em cũng xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè – những người thường xuyên động viên và tạo điều kiện cho em trong thời gian qua Em xin chân thành cám ơn các quý vị đại biểu và các bạn đã đến tham dự buổi bảo vệ

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Phạm Phương Thảo

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây Ý dĩ 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.1.3 Bộ phận dùng, chế biến, công dụng theo y học cổ truyền 4

1.1.4.Thành phần hóa học của cây Ý dĩ 4

1.1.5 Tác dụng dược lí 6

1.2 Tổng quan về acid p-coumaric 7

1.2.1 Công thức cấu tạo 7

1.2.2 Tính chất hóa lý 8

1.2.3 Nguồn gốc 8

1.2.3 Các phương pháp định lượng acid p-coumaric trên thế giới 8

1.2.4 Tác dụng sinh học 9

1.2.5 Vai trò của acid p-coumaric trong Ý dĩ 9

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 10

2.1.1 Nguyên vật liệu 10

2.1.2 Hoá chất và dung môi 11

2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 12

2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC 12

2.3.2 Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để xác định hàm lượng acid p-coumaric trong các mẫu thân cây Ý dĩ 14

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 15

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng phương pháp HPLC 15

3.1.1 Khảo sát quá trình xử lí mẫu 15

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc kí 16

3.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích 22

3.2 Kết quả định lượng acid p-coumaric trên các mẫu thân Ý dĩ 28

3.3 Bàn luận 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AS: Hệ số đối xứng pic

CE-MS: Capillary Electrophoresis with Mass Spectrometry

COD: Calci oxalat dihydrat

COM: Calci oxalat monohydrat

DAD: Detector mảng Diod (Diode-Array Detector)

ESI-MS: Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry

EtOAc: Ethyl acetat

HPLC:Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

tR: Thời gian lưu

UV: Ultra violet

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các mẫu nguyên liệu để định lượng………

Bảng 3.1: Các thông số HPLC của hệ dung môi 1 và hệ dung môi 2…………

Bảng 3.2: Chương trình dung môi 1 cho chế độ rửa giải gradient ………

Bảng 3.3: Chương trình dung môi 2 cho chế độ rửa giải gradient………

Bảng 3.4: Các thông số HPLC của chương trình dung môi 1 và 2………

Bảng 3.5: Các thông số HPLC của hệ acid 1 và hệ acid 2………

Bảng 3.6: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD………

Bảng 3.7: Kết qủa khảo sát khoảng tuyến tính………

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát đường chuẩn………

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống………

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu 3…………

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi……… ………

Bảng 3.12: Kết quả định lượng acid p-coumaric trong một số mẫu Ý dĩ……

Bảng 3.13: Hàm lượng trung bình (kl/kl) của acid p-coumaric trong các mẫu Ý dĩ………

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của acid acid p-coumaric………

Hình 2.1: Cây Ý dĩ………

Hình 3.1: Sắc kí đồ hệ dung môi 1………

Hình 3.2: Sắc kí đồ hệ dung môi 2………

Hình 3.3: Sắc kí đồ chương trình dung môi 1………

Hình 3.4: Sắc kí đồ chương trình dung môi 2………

Hình 3.5: Sắc kí đồ của hệ acid 1………

Hình 3.6: Sắc kí đồ của hệ acid 2………

Hình 3.7: Sắc kí đồ HPLC của mẫu dược liệu 3 và mẫu acid p-coumaric đối chiếu………

Hình 3.8: Đường chuẩn và phương trình hồi quy acid p-coumaric………

Hình 3.9: Sắc kí đồ HPLC của mẫu dược liệu 1,2,3 và mẫu acid p-coumaric đối chiếu………

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ý dĩ là loài cây bản địa của Việt Nam, từ lâu đã được trồng như một cây thuốc quý và cây tinh bột nhiều bổ dưỡng Hầu hết các nghiên cứu trong nước và trên thế giới về Ý dĩ mới chỉ tập trung trên hạt là bộ phận được dùng phổ biến nhất Bên cạnh hạt Ý dĩ, thân cây cũng được một số người dân sử dụng để điều trị đái tháo đường và là một thành phần trong bài thuốc điều trị sỏi tiết niệu Tác dụng điều trị sỏi tiết niệu của thân cây Ý dĩ đã được chứng

minh trên cả mô hình in vitro và in vivo Từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat

thân cây Ý dĩ, nhóm nhiên cứu của chúng tôi đã phân lập được acid coumaric là một thành phần có tác dụng ức chế mạnh sự hình thành tinh thể

p-calci oxalat in vitro với giá trị IC50 là 2,35 mM [13] Tuy nhiên hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào để xác định hàm lượng acid p-coumaric trong thân

cây Ý dĩ Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “ Xây dựng phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ ” với hai mục tiêu sau:

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC

- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng acid coumaric trong một số mẫu thân cây Ý dĩ

p-Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Ý dĩ

rõ, gân giữa to Hoa đơn tính cùng gốc mọc ở kẽ lá thành bông, hoa đực mọc phía trên, hoa cái phía dưới Hoa đực có 3 nhị Quả có mày cứng bao bọc [1],[4]

Ý dĩ mọc tự nhiên phân bố rải rác ở một số tỉnh miền núi phía bắc như Lào Cai, Hà Giang, Lai Châu…Cây thường mọc gần nguồn nước, dọc bờ khe suối ở cửa rừng hay trong thung lũng Ý dĩ trồng thường không cố định theo khu vực Vào đầu những năm 90, cây được trồng nhiều ở Kon Tum, Đồng Nai…Từ năm 1995-1997 ở Sơn La (Mộc Châu), Hòa Bình (Mai Châu) và Hà Tây…Việt Nam là nước trồng nhiều Ý dĩ trong khu vực trong những năm 80

và 90 Ý dĩ của Việt Nam thường xuyên được xuất ra thị trường thế giới [10],[12]

Ở Việt Nam xác định Ý dĩ có 4 thứ sau [5],[8] :

- Coix lachryma – jobi L.var lachryma –jobi L: Cườm gạo

Cây cỏ, thân có đường kính 8-10 mm Lá phẳng, cuống dài 40-50 cm, rộng 4-5 cm, gân giữa to, gân bên rất mảnh, bẹ nhẵn, lưỡi nhỏ 1mm Cụm hoa

ở ngọn nhánh Bông chét đực ở trên dài 6-7 cm Nhị vàng Bông chét cái ở

dưới có bao hình bầu, dài 8-9 mm, đường kính 6 mm, khi chín nâu đen rồi trắng, rất cứng Thứ này mọc ở các vùng đất hoang đến vùng nước lợ

- Coix lachryma – jobi L.var mayuen Stapf : Ý dĩ, Bo bo

Đây là thứ Ý dĩ được quy định trong dược điển Việt Nam IV, dược điển Trung Quốc Cây cỏ, thân phân nhánh, nhẵn, to, xốp, cao 1-2 m Lá phẳng thuôn dài, hình tim ở gốc, gân nhọn đầu, dài 10-50 cm gân giữa lớn nổi rõ, gân bên rất mảnh, bẹ lá nhẵn kéo dài, thường rất rộng Cụm hoa là bông, mọc thẳng đứng có cuống Hoa đơn tính cùng gốc Bông chét đực mọc chụm 2-3 chiếc 1 chỗ trên cuống chung mảnh, có mày cứng bao bọc Bông chét cái hình bầu dục, lá bắc rất dày, cứng màu trắng nhạt hay xanh xám Quả hình cầu hay bầu dục, có vỏ dạng giấy hay hóa cứng Ở Việt Nam, cây mọc hoang và cũng được trồng, thường gặp ở các bờ nước, nơi đất ẩm ven rừng, ven đường Ra hoa từ tháng 7 đến tháng 12

- Coix lachryma – jobi L.var puellarum Balansa: Bo bo dại, cườm gạo

Cây cỏ, cao trên 50 cm, phân nhánh nhiều, ruột xốp, nhẵn Lá mềm, phẳng, mép nhăn nheo, đầu nhọn, gốc hình tim, gân mảnh nổi rõ cả 2 mặt, bẹ

lá nhẵn, thuôn dài Cụm hoa ở nách lá hay ngọn thân Bông chét đực ở trên đỉnh hợp với cuống chung, xếp sát nhau, mày cứng, bóng Bông chét cái có lá bắc cứng bao bọc, màu trắng tím, bóng Quả có lá bắc phát triển ôm lấy toàn

bộ phần bên trong nhỏ bé hình cầu, bóng, cứng rắn Cây mọc hoang ở ven đồi, thấp ẩm, ven bờ nước hoặc ở trên các rẫy Ra hoa quả gần như quanh năm

- Coix lachryma – jobi L.var stenocarpa Oliv

Cây cỏ, sống trên cạn hay dưới nước Lá có phiến, dài 30-90 cm, rộng

2-4 cm, mặt trên có lông, cuống không lông Hoa mọc ở kẽ lá, với bông chét đực màu xanh Bông chét đực mọc chụm 3 chiếc một chỗ trên cùng cuống chung mảnh Quả cứng màu vàng hay nâu

1.1.3 Bộ phận dùng, chế biến, công dụng theo y học cổ truyền

- Hạt: hình trứng dài 5-8 mm đường kính 2-5 mm, mặt ngoài màu trắng đục đôi khi còn sót lại màng vỏ chưa loại hết, mặt trong có rãnh hình máng Chất cứng, không mùi, vị ngọt hơi thơm và chứa nhiều tinh bột.Thu hoạch từ tháng

12 đến tháng 1 Cắt về đập lấy quả (thường gọi là hạt) đem phơi khô, loại bỏ

quả lép rồi xay xát lấy hạt [1]

Theo Y học cổ truyền hạt Ý dĩ có vị ngọt, nhạt, tính hơi hàn quy vào 5 kinh tỳ, vị, phế, can, đại tràng với công năng chủ trị sau:

+ Lợi thủy: dùng để trị các bệnh phù thũng, tiểu tiện khó, đái buốt

+Kiện tỳ hóa thấp: dùng để trị bệnh tỳ hư, tiêu hóa kém, tiết tả (hạt sao vàng) +Trừ phong thấp: dùng để trị đau nhức xương khớp

+Giải độc tiêu viêm: dùng trong viêm ruột thừa, trứng cá, mụn nhọt

Liều dùng từ 20-50g [2]

- Rễ: dùng để chữa viêm nhiễm đường niệu, sỏi thận, thủy thũng, phong thấp, đau xương, trẻ em ỉa chảy, bạch đới, rối loạn kinh nguyệt, bế kinh [5], [12]

- Lá, thân: ít được sử dụng [1]

1.1.4.Thành phần hóa học của cây Ý dĩ

1.1.4.1 Các nghiên cứu nước ngoài

Các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào thành phần hóa học của hạt Ý dĩ Bên cạnh tinh bột, đã tìm thấy trong hạt Ý dĩ một số thành phần sau:

- Coixenolid :

Tymosin Ukita và cộng sự [46] đã tách chiết được coixenolid từ dịch

chiết aceton của hạt Ý dĩ (Coix lachryma – jobi L.var mayuen) Bột nhân hạt

Ý dĩ được chiết với aceton ở nhiệt độ phòng Sau đó đem phân lập và tinh chế bằng sắc kí cột silicagel thu được hợp chất có công thức: C38H70O4, n20

D = 1,4705, [α]20

D= 00 Hợp chất này được gọi là coixenolid

- Coixan :

Takahashi và cộng sự [45] đã phân lập được coixan A, B, C từ dịch

chiết hạt cây Ý dĩ (Coix lachryma – jobi L.var mayuen) Bột nhân hạt Ý dĩ

được chiết với nước ở nhiệt độ phòng, sau đó tiến hành sắc kí cột để tách riêng các hợp chất coixan A, B, C Cấu trúc coixan A, B, C được xác định bằng các phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân

- Các hợp chất có tính acid :

Numata M và cộng sự [37] từ dịch chiết aceton nhân hạt Ý dĩ đã tìm thấy các hợp chất có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của khối u trên chuột Các thành phần này được tách riêng bằng sắc kí cột silicagel và được xác định cấu trúc bằng phương pháp phân tích: quang phổ hồng ngoại, sắc kí khí Các thành phần này được xác định là 4 acid béo: acid palmitic, acid steatic, acid oleic và acid linoleic

- Các hợp chất lactam :

Ming-Yi Lee và cộng sự [32] đã tìm ra 5 hợp chất lactam có tác dụng ức chế tế bào ung thư từ dịch chiết methanol hạt Ý dĩ: coixspirolactam A, coixspirolactam B, coixspirolactam C, coix lactam và methyl dioxindole-3- acetat

-Một số hợp chất khác được phân lập từ hạt Ý dĩ [25] :

eriodictyol, các ceramid (2S, 3S, 4R)-2-[(20R-20- hydroxytetracosanoyl-amino]-1,3,4- octadecanetriol và acid p-coumaric

Từ rễ cây Ý dĩ cũng đã phân lập được một số thành phần sau:

- Benzoxazinon :

Otsuka và cộng sự [39] đã phân lập được coixol và 5 hợp chất benzoxazinon từ phân đoạn chlorofom của dịch chiết methanol rễ cây Ý dĩ

(Coix lachryma-jobi L.var ma-yuen) bao gồm:

2-hydroxy-7-methoxy-1,4(2H)- benzoxain-3-one; 2-O-β-D- glucopyranoside; 4-hydroxy-7-methoxy-1,4(2H)- benzoxazin-3-one; 2-O-β- glucopyranosyl-

2-O-β-glucopyranosyl-4,7-dimethoxy-1,4 (2H)- benzoxazin-3-one và 2-O-β- hydroxy-1,4 (2H)- benzoxazin-3-one

glucopyranosyl-7 Các hợp chất phenolic và adenosin :

Otsuka và cộng sự [38] đã phân lập được 4 hợp chất phenolic và adenosin từ phân đoạn chloroform của dịch chiết methanol rễ cây Ý dĩ: 4- ketopinoresinol; threo và erythro-1-C-syringylglycerol; 2,6-dimetoxy-p-hydroquinone 1-O-β-d-glucopyranoside

1.1.4.2 Các nghiên cứu trong nước

Gần đây nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã phân lập và xác định được cấu trúc của 7 chất trong đó:

+ Sáu chất được phân lập từ phân đoạn dịch chiết chloroform thân cây Ý

dĩ, theo định hướng tác dụng hạ đường huyết bao gồm: stigmast-4-en-3-on,

β-sitosterol và stigmasterol, (E)-ethyl-3-(4-hydroxyphenyl) acrylat, 4-hydroxy

benzaldehyd và acid isovanilic [7],[9]

+ Một chất là acid p-coumaric, là thành phần chính trong phân đoạn ethyl acetat, phân đoạn có tác dụng ức chế mạnh nhất sự hình thành tinh thể calci

oxalat in vitro [14]

1.1.5 Tác dụng dược lí

1.1.5.1 Các nghiên cứu ở nước ngoài

Đa phần các nghiên cứu về tác dụng dược lí của Ý dĩ trên thế giới chủ yếu tập trung trên hạt Hạt Ý dĩ đã được nghiên cứu với các định hướng sinh học khác nhau như: tác dụng chống ung thư [15],[18],[33],[43], tác dụng chống dị ứng [16],[17], tác dụng chống viêm [25],[26], tác dụng trên chuyển hóa lipid [24],[28], tác dụng hạ đường huyết [22],[24], tác dụng chống oxy hóa [30], tác dụng giãn cơ, chống co giật [21] và tác dụng trên hệ miễn dịch [47]

1.1.5.2 Các nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu về tác dụng dược lí của thân cây Ý dĩ chủ yếu tập trung theo hai định hướng: tác dụng hạ đường huyết và tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu

- Tác dụng hạ đường huyết: dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 80% thân cây Ý dĩ có tác dụng hạ đường huyết trên chuột gây đái tháo đường thực nghiệm bằng streptozocin Các nghiên cứu cũng đã chứng minh trong các phân đoạn dịch chiết, phân đoạn chloroform là phân đoạn có tác dụng hạ

đường huyết mạnh nhất [11]

- Tác dụng trên sỏi tiết niệu:

+ Tác dụng in vitro: dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ thể hiện tác dụng ức chế tinh thể calci oxalat in vitro trên mô hình bản nhọn 96 giếng theo phương

pháp được mô tả bởi Gohel và Wong [20] Tác dụng ức chế này tăng dần theo nồng độ, đồng thời khi có mặt dịch chiết Ý dĩ các tinh thể calci oxalat chuyển

từ dạng COM sang dạng COD là dạng dễ đào thải hơn [13]

+ Tác dụng in vivo: dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ thể hiện tác dụng ức chế tinh thể calci oxalat in vivo, làm giảm rõ rệt các đám sỏi lắng đọng tại thận so

với lô chứng bệnh trên chuột cống trắng với mô hình gây sỏi thực nghiệm bằng ethylen glycol [13]

1.2 Tổng quan về acid p-coumaric

1.2.1 Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của acid acid p-coumaric

-Công thức phân tử: C9H8O3

-Khối lượng phân tử: 164,16 g.mol-1

-Tên khoa học: (E)- 3- (4-hydroxyphenyl)- 2- propenoic acid

1.2.3 Nguồn gốc

Acid p-coumaric là một acid hữu cơ được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm như: lạc, đậu xanh, cà chua, cà rốt, tỏi, rượu vang, giấm và lúa mạch Ngoài ra acid p-coumaric cũng đã được phân lập từ hạt Ý dĩ [25]

1.2.3 Các phương pháp định lượng acid p-coumaric trên thế giới

Acid p-coumaric có mặt khá phổ biến trong thực vật Trên thế giới đã

có các nghiên cứu áp dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector mảng diod (DAD) [34], phương pháp phun mù điện tử ( ESI-MS) [36] và một số phương pháp kết hợp giữa HPLC và ESI-MS, CE-MS [23],[41], để tiến hành định lượng acid p-coumaric trên các mẫu thực tế Các phương pháp này đã được áp dụng để định lượng acid p-coumaric

trong một số thực phẩm như: dầu ôliu [36], một số loài đậu (Phaseolus

vulgaris L.) [34], nho [41], lúa mạch và ngũ cốc [35], lạc (Arachis hypogaea

L.) [31], quả thuộc họ Citrus [23]

1.2.4 Tác dụng sinh học

Trên thế giới đã tập trung nghiên cứu về tác dụng sinh học của acid coumaric với các định hướng sau: tác dụng ngăn ngừa phì đại cơ tim [42], tác dụng chống oxy hóa [27],[44], tác dụng diệt khuẩn [25],[48], tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào [29], tác dụng chống dị ứng [17]

p-1.2.5 Vai trò của acid p-coumaric trong Ý dĩ

Nghiên cứu của Đỗ Thị Yến và cộng sự [14] đã phân lập được acid coumaric là thành phần chính trong phân đoạn dịch chiết ethylacetat của thân cây Ý dĩ có tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu mạnh nhất Ở nồng độ ≥ 1

p-mM, acid p-coumaric thể hiện tác dụng ức chế hình thành sỏi rõ rệt, tác dụng này tăng dần theo nồng độ Phần trăm ức chế tối đa đạt được là 72,0% ở nồng

độ 10 mM Tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat của acid coumaric mạnh hơn chứng dương natri citrat, với giá trị IC50 là 2,35 mM (khoảng tin cậy 95%: 1,47-3,10) so với 9,61 mM (khoảng tin cậy 95%: 8,29-11,16) của natri citrat [13] Như vậy acid p-coumaric là một thành phần có tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat trong thân cây Ý dĩ

p-Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu

Nguyên liệu là thân cây Ý Dĩ, được thu hái tại 2 địa điểm là Từ Liêm,

Hà Nội và Phú Lương, Thái Nguyên vào tháng 11 năm 2013 Dược liệu được sấy khô, tán nhỏ, bảo quản trong túi nilon buộc kín để nơi khô ráo Mẫu dược liệu 1, 2 được PGS.TS Trần Văn Ơn- Bộ môn Thực Vật- Trường Đại học

Dược Hà Nội giám định tên khoa học lần lượt là: Coix lachryma – jobi L.var

lachryma –jobi L và Coix lachryma – jobi L.var mayuen Stapf Mẫu dược

liệu 3 được TS.Trần Thế Bách- Phòng Thực Vật- Viện sinh thái và tài nguyên

sinh vật định tên khoa học là: Coix lachryma – jobi L.var lachryma –jobi L

Họ lúa (Poaceae) Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng thực vật, Viện sinh thái và

tài nguyên sinh vật và Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội

Hình 2.1 Cây Ý dĩ

Bảng 2.1: Các mẫu nguyên liệu để định lượng

STT Nơi thu hái

Thời gian lấy

Bộ phận dùng

Ký hiệu mẫu

Tên khoa học

1 Phú

Lương-Thái Nguyên 11/2013 Thân M1

Coix lachryma – jobi L

.var lachryma –jobi L

2 Phú Lương-

Thái Nguyên 11/2013 Thân M2

Coix lachryma – jobi L

.var mayuen Stapf

3 Từ Liêm-

Hà Nội 11/2013 Thân M3

Coix lachryma – jobi L

.var lachryma –jobi L

2.1.2 Hoá chất và dung môi

- Chất chuẩn: acid p-coumaric của hãng Sigma- Aldrich với hàm lượng

99,6%

- Methanol, nước cất, acid phosphoric, acid formic đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC

- Dung môi: methanol, ethyl acetat, toluen, acid formic… dùng cho chiết xuất

và sắc kí đạt tiêu chuẩn phân tích

2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Cân phân tích Precisa XT

Máy cất quay Buchi Rotavapor R-200

Tủ sấy Binder

Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC-LC 10A (Shimadzu)

Đèn tử ngoại Vilbez Lourmat (hai bước sóng λ = 254 nm và λ = 366 nm) Máy đo độ ẩm Sartorius

Pipet vạch, pipet pasteur, pipet chính xác, bình gạn…

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để xác định hàm lượng acid coumaric trong các mẫu thân cây Ý dĩ

p-2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC

2.3.1.1 Khảo sát quá trình xử lí mẫu

Dựa vào độ tan của acid p-coumaric để lựa chọn dung môi chiết xuất cho phù hợp Sau đó tiến hành khảo sát quá trình xử lí mẫu tiếp theo để loại tạp chất trong dịch chiết

2.3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc kí

Phép phân tích được thực hiện trên hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột,

bộ trộn dung môi và detector UV-VIS

Điều kiện khảo sát ban đầu được tiến hành dựa trên kết quả định lượng

acid p-coumaric bằng phương pháp HPLC trong cây Leptadinia reticulate của

Geetha và cộng sự [19] Tiến hành khảo sát điều kiện sắc kí trên cột tách Ascentis C18 (250mm x 4,6 mm; 5µm); pha động gồm MeOH phối hợp với acid formic 1% hoặc acid phosphoric 0,01% theo các tỷ lệ khác nhau; khảo sát chương trình dung môi rửa giải đẳng dòng (isocratic elution) hoặc rửa giải gradient (gradient elution)

Các kết quả thu được ứng với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu (tR) của chất phân tích, độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS) Phương pháp đánh giá dựa trên lí thuyết Van Deemter sao cho RS ≥ 1,5;

AS nằm trong khoảng từ 0,8-1,5 Thời gian lưu (tR) của các chất phân tích không quá lớn nhưng phải đảm bảo tách xa nhau [3],[6]

2.3.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích

Sau khi khảo sát quá trình xử lí mẫu và các điều kiện sắc kí, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric bằng HPLC trong Ý dĩ:

 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà

hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền

- Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà

hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu của nền

Để xác định LOD, ta phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích và xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N) (S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền, S/N = 2-3) Giới hạn định lượng LOQ = 3,3x LOD [6]

 Xây dựng đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính

Tiến hành chuẩn bị và phân tích 7 mẫu chuẩn có nồng độ là 0,635; 1,27; 2,54; 6,35; 12,7; 25,4; 63,5 Xây dựng phương trình hồi quy giữa diện tích pic

và nồng độ acid p-coumaric có trong mẫu chuẩn Từ các thông số thu được tính toán hệ số tương quan R2, yêu cầu R2 ≥ 0,99 [6] Xác định độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ acid p-coumaric định lượng được với nồng độ thực

 Tính thích hợp hệ thống

Tính thích hợp hệ thống được dùng để xác định chắc chắn rằng độ phân giải và độ lặp lại của hệ thống sắc kí đủ để tiến hành quá trình phân tích Pha

một mẫu chuẩn có nồng độ thích hợp, tiến hành sắc kí 6 lần với điều kiện đã lựa chọn Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic yêu cầu là RSD ≤ 2% [6]

 Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại của phương pháp là mức độ phù hợp giữa các kết quả kiểm nghiệm cá thể khi phương pháp được áp dụng lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dược liệu và tính độ lệch chuẩn tương đối, với yêu cầu RSD ≤ 2% [6]

2.3.2 Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để xác định hàm lượng acid p-coumaric trong các mẫu thân cây Ý dĩ

Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để định lượng acid p-coumaric trong thân 3 mẫu Ý dĩ, mỗi mẫu được định lượng 3 lần, lấy kết quả trung bình

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng phương pháp HPLC

3.1.1 Khảo sát quá trình xử lí mẫu

Dựa vào độ tan của acid p-coumaric, tiến hành khảo sát quá trình chiết xuất với 2 dung môi: methanol 80% và ethyl acetat Cách tiến hành như sau: cân 5g dược liệu, chiết hồi lưu với MeOH 80% hoặc EtOAc (2 lần, mỗi lần trong 1 giờ) Gộp dịch chiết, cất quay đến cắn Cắn được sơ bộ kiểm tra sự có mặt của acid p-coumaric bằng sắc kí lớp mỏng, hệ dung môi khai triển: Toluen: EtOAc: HCOOH (4:2:1) với chất đối chiếu là acid p-coumaric Kết quả cho thấy với cả 2 dung môi này đều chiết được acid p-coumaric, tuy nhiên trong điều kiện sắc kí đã được khai triển nhận thấy dịch chiết còn chứa rất nhiều tạp chất

Do đó chúng tôi tiếp tục tiến hành loại tạp từ dịch chiết MeOH 80% ban đầu bằng phương pháp chiết lỏng- lỏng với dung môi EtOAc Kết quả cho thấy, sau khi chiết lại bằng EtOAc, dịch chiết đã loại bỏ được nhiều tạp chất

Quy trình xử lí mẫu cuối cùng được lựa chọn như sau:

Cân chính xác khoảng 5g dược liệu đem chiết hồi lưu với MeOH 80% (2 lần, mỗi lần trong 1 giờ), gộp dịch chiết lại định mức vào bình 50 ml, hút chính xác 25 ml dịch chiết rồi đem cất quay đến cắn Hòa tan cắn trong 10ml nước rồi đem chiết với EtOAc cho đến khi mất màu Dịch chiết được loại nước bằng Na2SO4 khan Sau đó đem cô đặc đến cắn, hòa tan vào MeOH, định mức vào bình 25 ml rồi lọc (bỏ 5ml dịch lọc đầu) để được dung dịch tiêm sắc kí

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc kí

Chuẩn bị mẫu chuẩn: Chuẩn bị dung dịch acid p-coumaric chuẩn trong MeOH có nồng độ 1,27 mg/ml Sau đó pha loãng mẫu thành nồng độ 0,127 mg/ml

Chương trình sắc kí lỏng được khảo sát ban đầu dựa trên các điều kiện sắc kí đã được khai triển bởi Geetha và cộng sự [19]:

3.1.2.1 Khảo sát thành phần dung môi pha động

Thử nghiệm được tiến hành với 2 hệ dung môi sau:

- Hệ dung môi 1: MeOH- acid formic 1% (5:5)

- Hệ dung môi 2: MeOH- acid formic 1% (6:4)

Kết quả sắc kí đồ HPLC với các hệ dung môi 1 và 2 được trình bày ở hình 3.1 và 3.2 :

Hình 3.1: Sắc kí đồ hệ dung môi 1 Hình 3.2: Sắc kí đồ hệ dung môi 2

Các thông số đo được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Các thông số HPLC của hệ dung môi 1 và hệ dung môi 2

chất Có thể do chương trình rửa giải đẳng dòng không đủ khả năng để tách các chất Do đó cần thay đổi chương trình dung môi sang chế độ rửa giải gradient với thành phần dung môi pha động gồm MeOH và acid formic 1%

3.1.2.2 Khảo sát chương trình dung môi

Tiến hành khảo sát chương trình dung môi cho chế độ rửa giải gradient

Hệ dung môi: gồm 2 kênh

Kênh A: pha nước chứa acid formic 1%

Kênh B: MeOH

Khảo sát 2 chương trình dung môi sau:

- Chương trình dung môi 1:

Bảng 3.2: Chương trình dung môi 1 cho chế độ rửa giải gradient

t (phút) 0-5 5-10 10-15 15-20 20-25 25-30 30-35

MeOH (%) 10-40 40-50 50 50-60 60 60-100 100

- Chương trình dung môi 2:

Bảng 3.3: Chương trình dung môi 2 cho chế độ rửa giải gradient

t (phút) 0-5 5-8 8-15 15-20 20-25 25-30 30-35

MeOH (%) 10-50 50-55 55 55-60 60 60-100 100

Kết quả sắc kí đồ với các chương trình dung môi 1 và chương trình dung môi 2 được trình bày ở hình 3.3 và 3.4:

(Do sau khi chạy thử chương trình dung môi 1 nhận thấy tín hiệu của pic sắc

kí hơi cao, tiến hành chạy chương trình dung môi 2 với thể tích tiêm mẫu giảm một nửa (V= 5µl) để bảo vệ cột, tránh gây tắc cột)