phase and lipid rafts in model and biological nnembranes", Curr Opin Colloid Interface ScL, 8(6), p 459-468 Morand K, Bartoletti AC, Bochot A, Barratt G, Brandely ML, Chast F (2007), Liposomal amphotericin Beye drops to treat fungal keratitis: physico-chemical and formulation stability, IntJ Pharm., 344(1-2), p 150-153 Richard T Proffit, Jill Adler-Moore,Su-Ming Chiang 0999), Amphotericin B liposome preparation, patent USA Rojanapanthu Pleumchitt, Sarisuta Narong ,Chaturon Korakot (2003), "Physicochemical properties of amphotericin B liposomes prepared by reverse-phase evaporation method", Drug Dev.Ind.Pàm., 29(1 ), p 31-37 Singodia D, Verma A, Khare P, Dube A, Mitra K, Mishra PR (2012), Investigations on feasibility of in situ development of amphotericin B liposomes for industrial applications, J Liposome Res., 22(1), p 8-17 Thomas L Leimke, David A Williams, Victotia F Roche and S William Zito (2013), Foye's principle of medicinal chemistry, Wolter Kluver/Lippincot William & Wilkins, 7th edition, p 1469 Torchilin Vladimir, Weissig Volkmar (2003), Liposomes: A practical approach, OUP Oxford, p 27-4 Xây dựng phương pháp định lượng Loratadin Pseudoephedrin huyết tương chó UPLC-MS/MS Đinh Thị Hải Bình', Nguyễn Thị KimOanh^ Nguyễn Thanh Hải^ Trịnh Văn Lẩu“' LêThị Quế^ Nguyễn Thị Kiểu Anh^ ’ Trường Caođẳng DượcHải Dương, ^KhoaDược, TrườngĐọi học YThái Bình, ^Khoơ YDược, Đại họcQuốcgia HàNội, ‘'Hội Dượcđiển ViệtNam, hrườĩíg Đại họcDượcHàNội SUMMARY An UPLC-MS/MS method was developed and validated for the determination o f loratadine and pseudoephedrine sufate in dog plasma The chromatographic conditions are as follows: column: Shimpark UPLC (5 mm X 3.0 mm; 2.1 ụm); mobile phase: acetonitrile -0.05% formic acid (70:30 v/v); flow rate o f200fjl/m in; injection volume o f25 ụl; internal standard is domperidone; positive electrospray ionization; detection: MS/MS with m/z o f259.17; 117.06 and 175.08 for loratadine, pseudoephedrine and domperidone, respectively Loratadine and pseudoephedrine were extracted from plasma samples with a mixture o f diethyl ether - chloroform (8:2 v/v) It was proved that the method was stable, accurate, precise, very sensitive and suitable for determination o f loratadine and pseudoephedrine in plasma sample Từkhoá: Loratadin, pseudoephedrin, UPLC-MS/MS, huyết tương Đật vấn đề Loratadin (LOR) thuốc kháng histamin hệ II có tác dụng làm giảm triệu chứng viêm mũi dị ứng giải phóng histamin, có thời gian bán thải dài Pseudoephedrin (PSE) chất có tác dụng co mạch làm giảm xung huyết hữu hiệu, thời gian bán thải ngắn Việc kết hợp chất chế phẩm tạo nên tác dụng chữa viêm mũi dị ứng hiệu [1], đặc biệt bào chế dạng viên phóng thích có kiểm soát hiệu điểu trị tăng rõ rệt.Trong nghiên cứu pháttriển dạng sản phẩm viên bao phóng thích có kiểm soát chứa hai dược chất này, bên cạnh đánh giá tương đương bào chế (giải phóng hoạt chất in vitro) việc đánh giá sinh khả dụng in vivo thể sống chế phẩm nghiên cứu so với chế phẩm đối chiếu cẩn thiết, bước đánh giá nồng độ thuốc ầ dịch sinh học Trên giới, có số nghiên cứu định lượng PSE LOR huyết tương [3],[4],[5], [6] công bố, Việt Nam chưa có công bố đăng tải Bài báo trình bày kết xây dựng phương pháp định lượng đồng thời LOR PSE huyết tương sắc ký lỏng siêu hiệu cao kết nối với khối phổ (UPLC-MS/MS), phương pháp có khả ứng dụng đánh giá sinh khả dụng chế phẩm viên phóng thích có kiểm soát chứa hai thành phẩn LOR PSEtrên động vật (chó) Hóa chất, th iế t bị phương pháp nghiên cứu Hóa chất, động vật thí nghiệm - Chất chuẩn; Loratadin hàm lượng 99,24%, độ ẩm 0,02%; Pseudoephedrin hydroclorid hàm lượng 100%, độ ẩm 0,01 %; Domperidol hàm lượng 99,44% tính theo nguyên trạng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung cấp - Các dung môi, hóa chất thuộc loại dùng cho HPLC PA (Merck-Đức) - Huyết tương trắng: lấy từ chó khỏe mạnh chưa dùng thuốc - Động vật thí nghiệm: Chó đực, khỏe mạnh, 10 ± 0,5 kg - Mẫu thử: huyết tương chó sau uống viên nén Clarinase repetabs tablets (Schering-Plough), số lô sản xuất 2JRPG80D01, hạn sử dụng 23.08.2014, hàm lượng ghi nhãn Pseudoephedrin Sulfat 120 mg Loratadin mg Thiết bị - Hệ thong sắc ký lỏng khối phổ Waters Xevo TQD - Waters (Mỹ); - Các thiết bị dụng cụ khác: cân phân tích Sartorius CP224S (d=0,1 mg), Đức Máy ly tâm lạnh Sartorius sigma -16 K, Đức Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP - 236, Ý Tủ lạnh sâu MDF -192, Đức Tất thiết bị dụng cụ chuẩn hóa theo quy định ISO/ lEC 17025 năm 2005 Phương pháp nghiên cứu - Các dung dịch chuẩn gốc: cân xác lượng chất chuẩn hòa tan thể tích xác methanol để dung dịch chuẩn gốc LOR, PSE có nồng độ xác khoảng 250 ụg/mL (Các dung dịch gốc pha riêng) Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng MeOH thành nổng độ thích hợp cho thêm huyết tương trắng vào ta thu mẫu huyết tương chứa thời LOR PSEcó nổng độ từ 0,2/10 50/2500 ng/ ml (LOR/PSE) - Dung dịch chuẩn nội (15): cân xác lượng domperidon, hòa tan thể tích xác methanol để dung dịch có nồng độ xác khoảng 250 |jg/ml Sau pha loãng MeOH đến nổng độ khoảng 125 |jg/ml - Sử dụng phương pháp kết tủa protein chiết lỏng - lỏng xử lý mẫu để chiết tách LOR PSEtrong mẫu huyết tương - Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu cao kết nối với khối phổ (UPLC-MS/MS) định lượng LOR PSEtrong huyết tương Điểu kiện khối phổ sắc ký lựa chọn sau thực hiện: tối ưu hóa điểu kiện khối phổ, khảo sát loại cột tách khác nhau, loại pha động có thành phẩn, tỉ lệ khác - Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn FDA tiêu: tính chọn lọcđặc hiệu, khoảng nổng độ tuyến tính, độ đúng, độ xác, giới hạn định lượng dưới, độ ổn định -Xác định nồng độ PSEvà LORtrong huyết tương chó sau uống chế phẩm viên phóng thích có kiểm soát chứa loratadin mg pseudoephedrin 120 mg Tính kết dựa vào đường chuẩn xây dựng ngày phân tích với hệ số tương quan r > 0,99 Kết nghiên cứu Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích Tối ưu hóa điểu kiện khối phổ Pha dung dịch chuẩn LOR PSE với nồng độ Hg/mL MeOH Tiêm dung dịch chuẩn vào hệ thống khối phổ thông qua nguổn ion hóa với dòng pha động Lựa chọn chế độ phân tích khối phổ lẩn quét toàn phổ để tìm ion có cường độ tín hiệu cao nhất, tương ứng với ion mẹ chất phân tích từ xác định mảnh ion mẹ với giá trị m/z LOR, PSE IS lẩn lượt 383,17; 166,04 426,17 , BÀI NGHIÊN CỨU ‘i A Sau xác định ion mẹ, tiến hành điểu chỉnh để tối ưu điều kiện nguồn ion hóa với hai thông số hiệu điện mao quản hiệu điện cone để cường độ ion mẹ lớn ổn định Kết lựa chọn giá trị tối ưu với hiệu điện mao quản 4,0 KV; Hiệu điện cone lẩn lượt 46V; 20 V 54 V với LOR, PSE IS Việc xác định nổng độ LORvà PSEđược tiến hành dựa mảnh Kết với PSE, mức phân mảnh 18 V cho mảnh ion m/z có giá trị 117,06 cho cường độ tín hiệu lớn ổn định nhất, với LOR giá trị 28 V tương ứng ion m/z 259,17 với IS 28 V, ion m/z 175,08 Khảo sớt chương trình sâc ký Sử dụng cột sắc ký có pha tĩnh C18 hãng khác nhau, qui cách khác nhưcột Themo Hỵpersil GOLD C18 (50 tnm X 2,1 mm; 1,9 |jm), octadecylsilan Acquity UPLC- BEH C18 (50 X 2,1 mm; 1,7 |jm) Shimpark UPLC C18 (50 mm X 3,0 mm; 2,1 |jm), ba hệ dung môi pha động acetonitril: dung dịch amoni acetat 10 mM (50:50), acetonitril; dung dịch acid acetic 0,1% (80:20), acetonitril: dung dịch acid formic 0,05% (70:30), ba mức lưu lượng dòng pha động (200,400 500 ụl/phút) ba mức thể tích tiêm mẫu (5,10 20 |al) Kết phân tích cột Themo Hypersil GOLD Cl pic tách khỏi tốt chưa đạt độ phân giải đường nền, cột Acquity UPLCBEH C18 pic xuất sớm không ổn định Khi phân tích cột Shimpark UPLC C18 pic LOR, PSE IS cho đáp ứng tương đối tốt, hình dáng pic cân đối, thời gian lưu ngắn Khảo sát với hệ pha động cho thấy, hệ pha động gồm acetonitril: dung dịch acid formic 0,05% cho pic LOR, PSE IS có hình dạng cân đối, đáp ứng pic lắn sắc ký ổn định hẳn so với phân tích với hai hệ pha động lại Tốc độ dòng pha động 200 |jl/phút thể tích tiêm mẫu 10 HÍ hợp lý cho phép phân tích với thời gian lưu ngắn (khoảng phút), hình dạng pic cân đối, đáp ứng pic đảm bảo yêu cẩu định lượng Từ kết khảo sát, điều kiện phân tích lựa chọn là: cột sắc ký Shimpark UPLC C18 (50 mm X 3,0 mm; 2,1 |am); nhiệt độ cột 30“C; pha động acetonitril: dung dịch acid formic 0,05% (70:30); lưu lượng dòng 200 nl/phút; thể tích tiêm mẫu 10 |jl Kiểu khối phổ MS/MS, ion mẹ/ ion LOR, PSE IS có m/z lẩn lượt 383,17/259,17; 166,04/117,06 426,17/175,08 Khảo sát phương pháp xử lý mâu Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn LOR, PSEvà IS nổng độ lẩn lượt 50 ng/mL, 500 ng/ mL 200 ng/mL Tiến hành xử lý mẫu cách tủa protein chiết lỏng - lỏng Khi dùng tác nhân gây tủa protein khác acid percloric, acid tricloacetic, acid trifluoroacetic dung môi hữu methanol, acetonitril Kết cường độ tín hiệu thu mẫu không ổn định, pic LOR bị doãng, chưa đạt độ phân giải đường Tiếp tục khảo sát cách dùng acetonitril tủa protein, sau chiết dicloromethan, kết cho thấy thời gian xử lý mẫu kéo dài trình trải qua hai bước thời gian bay dicloromethan tương đối lâu, không phù hợp với việc phân tích nhiểu mẫu ngày Với phương pháp chiết lỏng - lỏng dùng hỗn hợp dung môi diethyl ether: cloroform (8:2), kết cho thấy hệ dung môi khắc phục nhược điểm chiết dung môi riêng rẽ (với cloroform thường dễ tạo nhũ tương bể mặt phân cách, nằm lớp gây khó khăn tách lấy dung môi, với diethyl ether cho tỷ lệ thu hồi thấp) Khảo sát lượng dung môi sử dụng, thời gian lắc, kiểm hoá không kiểm hoá mẫu thử, từ xác định quy trình xử lý mẫu sau: lấy ml huyết tương, thêm 100 |jl dung dịch IS, lắc xoáy 30 giây Thêm 0,5 ml dung dịch amoniac 0,1 M, lắc xoáy 30 giây Thêm ml hỗn hợp diethyl ether: cloroform (8:2) Lắc xoáy 10 phút Ly tâm 3000 vòng/phút phút Lấy 3,5 ml dung môi hữu lớp trên, cô dòng khí nitơ 40°c tới cắn Hòa tan cắn 1,00 ml pha động tiêm sắc ký Thẩm định phương pháp phân tích Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn US- FDA [7], Tính chọn lọc phương pháp đánh giá dựa vào so sánh thời gian lưu, pic chất phân tích IS phải nhận diện rõ ràng có hình dạng cân đối Đáp ứng pic mẫu trắng so với mẫu chuẩn (mẫu LLOQ) thời gian lưu chất phân đ tích không 20%, thời gian lưu IS không 5% Khoảng nồng độ tuyến tính phương pháp xác định dựa mối tương quan hổi quy nồng độ LOR, PSEvà tỷ lệ diện tích pic LOR, PSEvà chuẩn nội Độ độ xác phương pháp thực mức nồng độ LQC, MQC HQC, mức nồng độ tiến hành lần song song Nồng độ ứng với mức LQC, MQC HQC LOR/ PSE lẩn lượt 0,6/30 ng/ml, 25/1250 ng/ml, W 00 ng/ ml Giới hạn định lượng phương pháp dựa vào pic chất phân tích nhận diện rõ ràng, hình dạng cân đối có đáp ứng lẩn đáp ứng mẫu trắng thời gian lưu chất phân tích, độ nằm khoảng 80 -120% so với nổng độ thực độ xác có RSD không 20% Kết trình bày hìnhl bảng MRM of Channels ES+ 426.17 > 175.08 (Domperidon) 2.41e5 Aa 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 LQC01 100^ 2.20 2.40 2.60 2.18 Ab 3.ÌX) 3.20 MRMof Chaméis ES+ 383.17 > 259.17 (LoraM ne) 4.41e3 Ba MRM of Channels ES+ 426.17 > 175.08 (Domp (Domperkton) 0,991^0 KXK ■' 0.20 0.40 0.60 0.80 1.ÌX) 1.20 1.40 1.60 1.80 2.(X) 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 2.80 MRM of Channels ES+ 383.17 > 259.17 (Loratadine) 682 lũ O ị 2«2J7 0.20 0.40 0.60 0.80 Ì1 ÌS 1.40 m Ĩ.M 2.00 X 2.40 2.M LQC01 0.88 Ạ ^ 3.00 3.20 MRMof3CtiannelsES+ 166.04 >117.06 (Pseudoephednne) 3,77e4 Ac I r 0.20 2.M Ofin nsn 1(10 I?n 140 Ifin Ifin 7hn 770 ?4fi ?.fi0 ?ftn 3,no s?n 0.40 0.60 0.80 l.ix) 1.20 1,40 1.60 1.80 2.(X) 2.20 2.40 2.60 1.40 1.« 180 2.in íá 2.« 160 2,78 2.90 2.80 BL1 3,10 3^3 3.00 3.20 MRM of Channels ES+ 10Ữ]' I # ' La ,I « 0,6,0 DM, t.* ia » li» 3Ì0 /1 Bẩng I Tóm tằ k ă thẩm finh phương pthóp Chỉ tiêu Giới hdnchấ||nhận LOR K h o a n r ih l độ tuyến tính 0,2 -10 ng/ml 10-2500ng/m l PhiẩHg trinh hổi quy y = 0,0044x-0,0261 y = 0,0164x + 0,0065 r = 0,9983 r = 0,9995 0,2 ng/ml lO ng/m l 91,13%a-113,33%b 103,53%c 94,27%a-114,2%b 102,3%c 97,57%a-113,54%b 107,6%c 90,18%a-112,95%b 99,11%c 8674%a-111,67%b 102,06%c 85,36%a-100,63%b 92,62%c 6,47% 6,24% Độ tuyến tính Hệ số tương quan Giới hạn địnhliéng r > 0,998 Đap ứng pỉc mẫu LLOQ/ mẫu trắng > LQC Độ MQC 85-115% HQC LQC Độ xác MQC RSD ... vể mặt dược động học Kết luận Đả xây dựng phương pháp định lượng loratadin pseudoephedrin huyết tương chó sắc ký lỏng siêu hiệu cao kết nối với khối phổ (UPLC- MS/ MS) có độ xác cao, độ tốt, khoảng... dụng phương pháp kết tủa protein chiết lỏng - lỏng xử lý mẫu để chiết tách LOR PSEtrong mẫu huyết tương - Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu cao kết nối với khối phổ (UPLC- MS/ MS) định lượng. .. nghiên cứu định lượng PSE LOR huyết tương [3],[4],[5], [6] công bố, Việt Nam chưa có công bố đăng tải Bài báo trình bày kết xây dựng phương pháp định lượng đồng thời LOR PSE huyết tương sắc ký