Xây dựng phương pháp định lượng loratadin và pseudoephedrin trong huyết tương chó bằng UPLC MS MS

phase and lipid rafts in model and biological membranes", Curr Opin Colloid Interface So'., 8(6), p 459-468 Morand K, Bartoletti AC, Bochot A, Barratt G, Brandely ML, Chast F (2007), Liposomal amphotericin B eye drops to treat fungal keratitis: physico-chemical and formulation stability, Int J Pharm., 344(1-2), p 150-153 Richard T Proffit, Jill Adler-Moore,Su-Ming Chiang (1999), Amphotericin B liposome preparation, patent USA Rojanapanthu Pleumchitt, Sarisuta Narong ,Chaturon Korakot (2003), "Physicochemical properties of amphotericin B liposomes prepared by reverse-phase evaporation method", Drug Dev.Ind.Pàm., 29(1), p 31-37 Singodia D, Verma A, Khare P, Dube A, Mitra K, Mishra PR (2012), Investigations on feasibility of in situ development of amphotericin B liposomes for industrial applications,! Liposome Res., 22(1), p 8-17 Thomas L Leimke, David A Williams, Victotia F Roche and S William Zito (2013), Foye's principle of medicinal chemistry, Wolter Kluver/Lippincot William & Wilkins, 7th edition, p 1469 Torchilin Vladimir, Weissig Volkmar (2003), Liposomes: A practical approach, OUP Oxford, p 27-4 Xây dựng phương pháp định lượng Loratadin Pseudoephedrin huyết tương chó UPLC-MS/MS Đinh Thị Hải Bình', Nguyễn Thị Kim Oanh^ Nguyễn Thanh HảP, Trịnh Văn Lẩu'' Lê Thị Quế^ Nguyễn Thị Kiểu Anh^ 'Trường Cao đãng Dược Hỏi Dương, ^KhoaDược, Trường Đợi học Y Thái Bình, ^Khoa YDược, Đọi học Quốcgia Hà Nội, ^Hội Dược điển Việt Ham, ^Trường Đại học Dược HàMội SUMMARY An UPLC-M5/MS method was developed and validated for the determination o f loratadine and pseudoephedrine sufate in dog plasma The chromatographic cor)ditions are as follows: column: Shimpark UPLC C18 (50 mm X 3.0 mm; 2.1 ụm); mobile phase: acetonitrile -0.05% formic acid (70:30 v/vj; flow rate o f200 ụl/min; injection volume o f 25 ụl; internal standard is domperidone;positive electrospray ionization; detection: MS/MS with m/z o f259.17; n 7.06 and 175.08 for loratadine, pseudoephedrine and domperidone, respectively Loratadine and pseudoephedrine were extracted from plasma samples with a mixture o f diethyl ether - chloroform (8:2 v/v) It was proved that the method was stable, accurate, precise, very sensitive and suitable for determination o f loratadine and pseudoephedrine in plasma sample Từkhoá: Loratadin, pseudoephedrin, UPLC-MS/MS, huyết tương Đặt vấn đề Loratadin (LOR) thuốc kháng histamin hệ II có tác dụng làm giảm triệu chứng viêm mũi dị ứng giải phóng histamin, có thời gian bán thải dài Pseudoephedrin (PSE) chất có tác dụng co mạch làm giảm xung huyết hữu hiệu, thời gian bán thải ngắn Việc kết hợp chất chê' phẩm tạo nên tác dụng chữa viêm mũi dị ứng hiệu [1], đặc biệt bào chế dạng viên phóng thích có kiểm soát hiệu điểu trị tăng rõ rệt Trong nghiên cứu phát triển dạng sản phẩm viên bao phóng thích có kiểm soát chứa hai dược chất này, bên cạnh đánh giá tương đương bào chế (giải phóng hoạt chất in vitro) việc đánh giá sinh khả dụng in vivo thể sống chế phẩm nghiên cứu so với chế phẩm đối chiếu cắn thiết, bước đánh giá nống độ thuốc dịch sinh học Trên giới, có số nghiên cứu định lượng PSE LOR huyết tương [3],[4],[5], [6] công bố, Việt Nam chưa có công bổ đăng tải Bài báo trình bày kết xây dựng phương pháp định lượng đồng thời LOR PSE huyết tương sắc ký lỏng siêu hiệu cao kết nối với khối phổ (UPLC-MS/MS), phương pháp có khả ứng dụng đánh giá sinh khả dụng chế phẩm viên phóng thích có kiểm soát chứa hai thành phần LOR PSE động vật (chó) Hóa chất, thiết bị phương pháp nghiên cứu Hóa chất, động vật thí nghiệm - Chất chuẩn: Loratadin hàm lượng 99,24%, độ ẩm 0,02%; Pseudoephedrin hydroclorid hàm lượng 100%, độ ẩm 0,01%; Domperidol hàm lượng 99,44% tính theo nguyên trạng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung cấp - Các dung môi, hóa chất thuộc loại dùng cho HPLC PA (Merck - Đức) - Huyết tương trắng: lấy từ chó khỏe mạnh chưa dùng thuốc - Động vật thí nghiệm: Chó đực, khỏe mạnh, 10 ± 0,5 kg - Mẫu thử: huyết tương chó sau uống viên nén Clarinase repetabs tablets (Schering-Plough), số lô sản xuất 2JRPG80D01, hạn sử dụng 23.08.2014, hàm lượng ghi nhãn Pseudoephedrin Sulfat 120 mg Loratadin mg Thiết bị -Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Waters XevoTQD - Waters (Mỹ); - Các thiết bị dụng cụ khác: cân phân tích Sartorius CP224S (d=0,1 mg), Đức Máy ly tâm lạnh Sartorius sigma - 16 K, Đức Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP - 236, Ý Tủ lạnh sâu MDF -192, Đức Tất thiết bị dụng cụ đểu chuẩn hóa theo quỵ định ISO/ lEC 17025 năm 2005 Phương pháp nghiên cứu - Các dung dịch chuẩn gốc: cân xác lượng chất chuẩn hòa tan thể tích xác methanol để dung dịch chuẩn gốc LOR, PSE có nồng độ xác khoảng 250 ụg/mL (Các dung dịch gốc pha riêng) Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng MeOH thành nồng độ thích hợp cho thêm huyết tương trắng vào ta thu mẫu huyết tương chứa thời LOR PSE có nổng độ từ 0,2/10 50/2500 ng/ ml (LOR/PSE) - Dung dịch chuẩn nội (IS): cân xác lượng domperidon, hòa tan thể tích xác methanol để dung dịch có nồng độ xác khoảng 250 ụg/ml Sau pha loãng MeOH đến nồng độ khoảng 125 |jg/ml - Sử dụng phương pháp kết tủa protein chiết lỏng - lỏng xử lý mẫu để chiết tách LOR PSE mẫu huyết tương - Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu cao kết nối với khối phổ (UPLC-MS/MS) định lượng LOR PSE huyết tương Điều kiện khối phổ sắr ký lựa chọn sau thực hiện: tối ưu hóa điều kiện khối phổ, khảo sát loại cột tách khác nhau, loại pha động có thành phần, tỉ lệ khác - Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn FDA tiêu: tính chọn lọcđặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ xác, giới hạn định lượng dưới, độ ổn định - Xác định nổng độ PSE LOR huyết tương chó sau uống chế phẩm viên phóng thích có kiểm soát chứa loratadin mg pseudoephedrin 120 mg Tính kết dựa vào đường chuẩn xây dựng ngày phân tích với hệ số tương quan r > 0,99 Kết nghiên cứu Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích Tối ưu hóa điều kiện khối phổ Pha dung dịch chuẩn LOR PSE với nồng độ ng/mL MeOH Tiêm dung dịch chuẩn vào hệ thống khối phổ thông qua nguồn ion hóa với dòng pha động Lựa chọn chế độ phân tích khối phổ lẩn quét toàn phổ để tìm ion có cường độ tín hiệu cao nhất, tươnq ứng với ion mẹ chất phân tích từ xác địni I m ảnh ion m ẹ với giá trị m/z LOR, PSE IS 383,17; 166,04 426,17 Sau xác định ion mẹ, tiến hành điểu chỉnh để tối ưu điểu kiện nguồn ion hóa với hai thông số hiệu điện mao quản hiệu điện cone để cường độ ion mẹ lớn ổn định Kết lựa chọn giá trị tối ưu với hiệu điện mao quản 4,0 KV; Hiệu điện cone lẩn lưcrt 46V; 20 V 54 V với LOR, PSE IS Việc xác định nồng độ LOR PSE tiến hành dựa mảnh Kết với PSE, mức phân mảnh 18 V cho mảnh ion m/z có giá trị 117,06 cho cường độ tín hiệu lớn ổn định nhất, với LOR giá trị 28 V tương ứng ion m/z 259,17 với IS 28 V, ion m/z 175,08 Khảo sát chương trình sắc ký Sử dụng cột sắc ký có pha tĩnh C18 hãng khác nhau, qui cách khác cột Themo Hypersil GOLD C18 (50 mm X 2,1 mm; 1,9 |jm), octadecylsilan Acquity UPLC- BEH C18 (50 X 2,1 m m ; 1,7 |jm) Shimpark UPLC C18 (50 mm X 3,0 mm; 2,1 um), ba hệ dung môi pha động acetonitril: dung dịch amoni acetat 10 mM (50:50), acetonitril; dung dịch acid acetic 0,1% (80:20), acetonitril: dung dịch acid formic 0,05% (70:30), ba mức lưu lượng dòng pha động (200, 400 500 |jl/phút) ba mức thể tích tiêm mẫu (5,10 20 fil) Kết phân tích cột Themo Hypersil GOLD C18 pic tách khỏi tốt chưa đạt độ phân giải đường nền, cột Acquity UPLCBEH C18 pic xuất sớm không ổn định Khi phân tích cột Shimpark UPLC C18 pic LOR, PSE IS cho đáp ứng tương đối tốt, hình dáng pic cân đối, thời gian lưu ngán Khảo sát với hệ pha động cho thấy, hệ pha động gổm acetonitril: dung dịch acid formic 0,05% cho pic LOR, PSE IS có hình dạng cân đối, đáp ứng pic lần sắc ký ổn định hẳn so với phân tích với hai hệ pha động lại Tốc độ dòng pha động 200 nl/phút thể tích tiêm mẫu 10 nl hợp lý cho phép phân tích với thời gian lưu ngắn (khoảng phút), hình dạng pic cân đối, đáp ứng pic đảm bảo yêu cầu định lượng Từ kết khảo sát, điểu kiện phân tích lựa chọn là: cột sắc ký Shimpark UPLC C18 (50 mm X 3,0 mm; 2,1 |am); nhiệt độ cột 30°C; pha động acetonitril: dung dịch acid formic 0,05% (70:30); lưu lượng dòng 200 Ịjl/phút; thể tích tiêm mẫu 10 |al Kiểu khối phổ MS/MS, ion mẹ/ ion LOR, PSE IS có m/z lắn lượt 383,17/259,17; 166,04/117,06 426,17/175,08 Khảo sát phương pháp xử lý mâu Chuẩn bị mẫu huyết tương tựtạo chứa chuẩn LOR, PSE IS nồng độ lẩn lượt 50 ng/mL, 500 ng/ mL 200 ng/mL Tiến hành xử lý mẫu cách tủa protein chiết lỏng - lỏng Khi dùng tác nhân gây tủa protein khác acid percloric, acid tricloacetic, acid trifluoroacetic dung môi hữu methanol, acetonitril Kết cường độ tín hiệu thu mẫu không ổn định, pic LOR bị doãng, chưa đạt độ phân giải đường Tiếp tục khảo sát cách dùng acetonitril tủa protein, sau chiết dicloromethan, kết cho thấy thời gian xử lý mẫu kéo dài trình trải qua hai bước thời gian bay dicloromethan tương đối lâu, không phù hợp với việc phân tích nhiều mẫu ngày Với phương pháp chiết lỏng - lỏng dùng hỗn hợp dung môi diethyl ether: cloroform (8:2), kết cho thấy hệ dung môi khắc phục nhược điểm chiết dung môi riêng rẽ (với cloroform thường dễ tạo nhũ tương bể mặt phân cách, nằm lớp gây khó khăn tách lấy dung môi, với diethyl ether cho tỷ lệ thu hồi thấp) Khảo sát lượng dung môi sử dụng, thời gian lắc, kiềm hoá không kiểm hoá mẫu thử, từ xác định quy trình xử lý mẫu sau: lấy ml huyết tương, thêm 100 ụl dung dịch IS, lắc xoáy 30 giây Thêm 0,5 ml dung dịch amoniac 0,1 M, lắc xoáy 30 giây Thêm ml hỗn hợp diethyl ether: cloroform (8:2) Lắc xoáy 10 phút Ly tâm 3000 vòng/phút phút Lấy 3,5 ml dung môi hữu lớp trên, cô dòng khí nitơ 40°c tới cắn Hòa tan cắn 1,00 ml pha động tiêm sắc ký Thẩm định phương pháp phân tích Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn US- FDA [7], Tính chọn lọc phương pháp đánh giá dựa vào so sánh thời gian lưu, pic chất phân tích IS phải nhận diện rõ ràng có hình dạng cân đối Đáp ứng pic mẫu trắng so với mẫu chuẩn (mẫu LLOQ) thời gian lưu chất phân - ề tích không 20%, thời gian lưu IS không 5% Khoảng nồng độ tuyến tính phương pháp xác định dựa mối tương quan hổi quy nồng độ LOR, PSE tỷ lệ diện tích pic LOR, PSE chuẩn nội Độ độ xác phương pháp thực mức nồng độ LQC, MQC HQC, mức nồng độ tiến hành lán song song Nổng độ ứng với mức LQC, MQC HQC LOR/ PSE lẩn lượt 0,6/30 ng/ml, 25/1250 ng/ml, 40/2000 ng/ ml Giới hạn định lượng phương pháp dựa vào pic chất phân tích nhận diện rõ ràng, hình dạng cân đối có đáp ứng lẩn đáp ứng mẫu trắng thời gian lưu chất phân tích, độ nằm khoảng 80 -120% so với nồng độ thực độ xác có RSD không 20% Kết trình bày hìnhl bảng LQC01 0.20 0.40 0.60 0.80 11» 1.20 1,40 1,60 1,80 2.1X1 LQC01 100 2.20 2.40 M RM oí3ChannelsES+ 426.17 > 175-08 (D om f«ttin ) 2,60 I go 100 0.06 0^1 3.00 3,20 M RM o(3ChannelíES+ m i7 > S (L o la « w ) 4.41e3 02 2.80 2.18 Ab Ba MRMof3ChannetsẼS^ 426.17 > 175.06 (Oomperidon) 099 MO 2- 0,998 Đáp ứng pic mẫu LLOQ/ mẫu trắng > LQC Độ MQC -1 % HQC LQC Độ xác MQC RS0< 15% HQC LQC Tỉ lệ thu hổi MQC HQC -1 % (RSD < 15%) 5,03% 5,83% 8,52% 4,83% 90,93% (RSD = ,5 % ) 40,67% (RSD = 8,6% ) 84,18% (RSD = 9,9% ) 51,23% (RSD = 8,8% ) 93,28% (RSD = 4,6% ) 53,42% (RSD = 2,7% ) ‘giá trị nhỏ nhót, ‘’giá trị l ề nhát, ‘giá trị trung bình Độ ổn định mẫu thử đánh giá điểu kiện bảo quản nhiệt độ -40°c, mẫu thử đựng ống nghiệm thủy tinh nút xoáy, sau 15 ngày bảo quản nhiệt độ phòng sau Xác định lượng chất phân tích giảm sau thời gian bảo quản so với lượng chất phân tích mẫu chuẩn bị Tiến hành mức nổng độ LQC HQC LOR/ PSE lẩn lượt 0,6/30 ng/ml 40/2000 ng/ ml Kết trình bày bi ng 1.60 BÀI NGHIÊN CỨU Báng Két quờ khảo sát độ ồn định cùa mâu (n = 6) chát phân tích M ẫu đểở n h iêtđ ô phòng sau LOR M ẫuđểở-40"Csau 15 ngày LOR PSE Điểu kiện bảo quản Mẫu HQC Mẫu LQC % giảm so với ban đáu Nóng độ ban đáu (ng/ml) Nống độ sau bảo quản (ng/ml) % giảm so với ban đáu RSD (% ) Nóng độ ban đáu (ng/ml) Nóng độ sau bảo quản (ng/ml) 0,63 0,61 3,17 4,9 41,36 40,13 2,97 3,2 1885,5 4,40 5.5 PSE 29,6 1972,4 RSD (% ) 28,09 5,10 3,5 0,63 0,57 9,52 6,5 41,36 39,52 4,45 6,4 28,81 28,56 0,87 2,1 1972,4 1919,5 2,68 1,9 Kết bảng 1, hình cho thấy phương pháp có tính chọn lọc cao với LOR PSE với giá trị m/z ion mẹ/ion mảnh đổi với LOR, PSE IS lẩn lượt 383,17/259,17; 166,04/117,06 426,17/175,08 Khoảng nống độ tuyến tính xây dựng rộng với hệ số tương quan đạt yêu cẩu LOR 0,2 - 50 ng/ml (r - 0,9983), PSE 10 - 2550 ng/ml (r = 0,9995), dự đoán bao phủ toàn nổng độ mẫu huyết tương nghiên cứu sinh khả dụng Giới hạn định lượng nhỏ với LOR PSE lẩn lượt 0,2 ng/ ml 10 ng/ml, độ cao với LOR đạt từ 102,06% -107,60%, với PSE: 92,62% đến 102,30%, độ xác tốt với giá trị RSD LOR 10% PSE 6% Tỷ lệ thu hồi hoạt chất ba khoảng nồng độ đạt yêu cau ổn định: IS (DOM): xấp xỉ 97%, LOR: 93% PSE 53% Hoạt chất ổn định điểu kiện bảo quản nhiệt độ phòng sau 15 ngày -40°c Các kết thẩm định đạt theo yêu cẩu FDA Bước đầu ứng dụng định lượng Loratadin Pseudoephedrin mẫu thực Cho chó uống viên Clarinase repertabs với 50 ml nước Lấy 3,0 ml máu tĩnh mạch cổ vào ống chống đông chứa heparin thời điểm trước uống thuốc, sau uống thuốc 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 7; 9; 11; 24; 30; 35; 48 Lắc nhẹ Ly tâm 3000 vòng/ phút 10 phút, lấy huyết tương bảo quản -40°c tới phân tích Xử lý mẫu tiến hành sắc ký theo phương pháp xây dựng Dựa vào đường chuẩn xây dựng ngày phân tích (với r > 0,99) tính nồng độ LOR PSE mẫu thực Kết quệ'được trình bày hình bảng pseud o ep h ed rin 2500 60 th òi gian (giờ) Bòng ỉ Một sỗ thông số DĐHtrên chó LOR PSE A U C „_ Thông số c „ (n g / m l) U ( g ìờ ) AUC„.« {ng/ml*giờ) AUCo, (ng/ml*giờ) LOR 28,68 2,5 184,43 189,68 97,2 6,3 PSE 2148,90 12053,61 12115,90 99,5 3,9 A Ư C (|_„ J ĩ,„ ( g iờ ) Bàn luận LC-MS/MS dùng định lượng thuốc dịch sinh học nâng cao tính chọn lọc, độ nhạy phương pháp phân tích Kết định lượng đảm bảo độ pic chất phân tích chưa tách hoàn toàn khỏi pic khác giá trị đáp ứng pic chất phân tích ứng với tỉ số m/z riêng chất không chung điểu kiện phát detector thông thường khác Giới hạn định lượng nhỏ (0,2 ng/ml với LOR 10 ng/ml với PSE) phù hợp xây dựng đường cong nống độ - thời gian đánh giá sinh khả dụng thuốc Việc kết nối UPLC MS/MS giúp cho giảm thiểu thời gian phân tích mẫu 2,2 phút (giảm khoảng lẩn) so khoảng 15 phút sử dụng HPLC - MS/MS nên tiêu tổn dung môi, đỡ ô nhiễm môi trường kinh tế Xử lý mẫu cách chiết lỏng - lỏng với hỗn hợp dung môi diethyl ether: cloroform (8:2) sau kiểm hóa huyết tương dung dịch amoniac 0,1 M cho hiệu suất chiết cao, ổn định (DOM: 97%, LOR: 93% PSE 53%) so với nghiên cứu [3] dung môi chiết ethyl ether, khôny có trình kiềm hóa chuyển hoạt chất dạng trung tính nên hiệu suất chiết thấp (LOR: 63% PSE 40%) Việc sử dụng chất chuẩn nội domperidon phân tích đống thời LOR PSE giúp đơn giản hóa quy trình phân tích so với nghiên cứu nhà khoa học Trung Quốc sử dụng hai chất chuẩn nội diazepam cho LOR phenylpropanolamin cho PSE [6] Kết phân tích LOR PSE 14 mẫu thực sau cho chó uống viên phóng thích có kiểm soát chứa loratadin mg pseudoephedrin Sulfat 120 mg vòng 48 chứng minh phù hợp phương pháp xây dựng Nồng độ huyết tương LOR nằm khoảng 0,2 ng/ml 28,7 ng/ml PSE 10 ng/ml - 2148,9 ng/ml đểu nằm khoảng nồng độ tuyến tính đá khảo sát Thời gian bán thải dài với LOR 6,3 PSE 3,9 nên thời gian lấy mẫu vòng 48 phù hợp cho nghiên cứu, điểu minh chứng giá trị AUC(^^g/AUC|^ đểu lớn 97% hai chất Mặc dù tỉ lệ thành phần viên PSE/LOR 24 (120/5) tỉ lệ nồng độ huyết tương 74 (2148,9/28,68) viên nén Clarinase Repertab chứa hai thành phẩn LOR hàm lượng mg PSE 120 mg, LOR Vi lượng PSE (60 mg) thiết kế giải phóng bình thường, '/2 lượng PSE thiết kế giải phóng kéo dài nên nghiên cứu có ý nghĩa vể mặt dược động học Kết luận Đã xây dựng phương pháp định lượng loratadin pseudoephedrin huyết tương chó sắc ký lỏng siêu hiệu cao kết nối với khối phổ (UPLC-MS/MS) có độ xác cao, độ tốt, khoảng tuyến tính rộng, tính chọn lọc cao, thời gian phân tích nhanh với quy trình xử lý mẫu đơn giản Kết nghiên cứu khả thi để ứng dụng định lượng hai dược chất LOR PSE huyết tương chó sau uống chế phẩm viên phóng thích có kiểm soát chứa hai thành phẩn TÀI LIỆU THAM KHÀO Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia ViêtNam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 2130 - 2136 Ge QH, Zhou z, Zhi XJ, etal.(2007), "Simutaneous determination of pseudoephedrin and chlorpheniramine in human plasma by HPLCu v detection methods", Journal ofAOACInternational, Volume 93, Number 3, May 2010, pp.891 - 903 Jianguo Sun, Guạngi Wang, Wei Wang, Shuai Zhao, Yi Gu, Jinwen Zhang, Mingwen Huang, Fen Shao, Hao Li, Qi Zhang, Haitang Xie (2005), "Simultaneous determination of loratadine and pseudoephedrine sulfat in human plasma by liquid chromatography - electrospray mass spectrometry for pharmacokinetic stud\es", Journal o f Pharmaceutical and Biomedical Analysis,wiume 39, pp 217 - 224 Laurian Vlase, Silvia Imre, Dana Muntean, Sorin E Leucuta (2007), "Determination of loratadin and its active metabolite in human plasma by high - performance liquid chromatography with mass spectrometry detection", Journal o f Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Volume 44, Issue 3,27 July 2007, pp.652- 657 Macek J.et al (2002), "Rapid determination of pseudoephedrin in human plasma by high - performance liquid chromatography", Journal o f Chromatography B, 766, pp.289- 294 F.Zeeshan, (2008), "Simultaneous Determination of Loratadine and Pseudoephedrine Using High Performance Liquid Chromatography Method", 22"'' MSPP scientific meeting 2008, Oral 48 U.S Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evalution and Research (2001), Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation Chiết tách Enzym Protease ngoại bào từ Bacillus subtììỉs natto Đàm Thanh Xuân, Đinh Thị Thanh Thảo, Đinh Thu Hương, Lê Ngọc Khánh Trường Đại học Dược Hà Nội SUMMARY Study on extracellular protease enzyme extractiori from the cultured medium o f Bacillus subtilis natto Results show that 60% ammonium sulfate saturation concentration is the optimal concentration to precipitate enzyme with highest activity o f proteose (172.54 nKat) arid also prevent the present o f other enzymes in the B subtilis nano culture medium (amylase and cellulose) Electrophoresis results o f some segments obtained after purified with column chromatography and gel filtration through Sephadex G - 75 showed that the highest protease activity segment might contain nattokinase enzyme with a molecular weight in the range o f 27-28 KDa and also capable o f fibrinolytic action Từ khóa: Bacillus subtilis natto, enzym ngoại bào, protease Đặt vấn đề Bệnh tim mạch trở thành vấn để thời gia tăng bệnh cộng đồng với phát triển xã hội Hiện nay, thuốc tiêu huyết khối thị trường Urokinase, Streptokinase, Alteplase, sử dụng chủ yếu cấp cứu tai biến, chi phí đắt tiền gây nhiều tác dụng phụ Nattokinase enzym có khả nàng tiêu huyết khối lên men nhờ vi khuẩn Bacillussubtilisnatto [2], Nhiểu nghiên cứu chứng minh khả làm giảm lượng fibrinogen huyết tương Nattokinase Nghiên cứu nhằm mục tiêu tách chiết tinh chế enzym protease từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto, xác định tính chất enzym thu trọng lượng phân tử, hoạt tính protease, khả tiêu fibrin để hướng tới việc chủ động tạo nguồn nguyên liệu enzym nattokinase phương pháp lên men sinh học Nguyên liệu, thiết bị phương pháp nghiên cúu Nguyên liệu Chủng Bacillus subtilis natto - nguồn gốc Nhật Bản nuôi cấy lưu giữ Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Pepton, cao thịt Merck; Sephadex G75 Sigma; casein, tinh bột, thạch, CMC số hóa chất cẩn thiết khác đạt tiêu chuẩn phân tích Enzynn nattokinase Đài Loan (20.000 FU/g) Thiết bị Tủ cấy, tủ ấm nuôi vi sinh vật, máy lắc ổn nhiệt, máy ly tâm ... vể mặt dược động học Kết luận Đã xây dựng phương pháp định lượng loratadin pseudoephedrin huyết tương chó sắc ký lỏng siêu hiệu cao kết nối với khối phổ (UPLC- MS/ MS) có độ xác cao, độ tốt, khoảng... nghiên cứu định lượng PSE LOR huyết tương [3],[4],[5], [6] công bố, Việt Nam chưa có công bổ đăng tải Bài báo trình bày kết xây dựng phương pháp định lượng đồng thời LOR PSE huyết tương sắc ký... dụng phương pháp kết tủa protein chiết lỏng - lỏng xử lý mẫu để chiết tách LOR PSE mẫu huyết tương - Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu cao kết nối với khối phổ (UPLC- MS/ MS) định lượng