Xây dựng phương pháp định lượng imipenem và meropenem trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1201277 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG IMIPENEM VÀ MEROPENEM TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1201277 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG IMIPENEM VÀ MEROPENEM TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Vũ Ngân Bình Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian hoàn thành khóa luận, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô Vũ Ngân Bình – người tận tình hướng dẫn, bảo thao tác trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn học viên cao học Nông Thị Thanh Phương, Nguyễn Thị Thu Thủy tạo điều kiện cho tiếp cận mẫu huyết tương bệnh thực tế Hơn nữa, xin cảm ơn thầy Lê Đình Chi, cô Phạm Thị Thanh Hà, thầy Ngô Minh Thúy toàn thể thầy cô, anh chị kỹ thuật viên môn Hóa phân tích – Độc chất trường đại học Dược Hà Nội, cán Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia nhiệt tình giải đáp, giúp đỡ trình làm nghiên cứu Đồng thời xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô, ban giám hiệu trường đại học Dược Hà Nội tận tâm giảng dạy, tạo điều kiện học tập tốt cho năm năm học vừa qua Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè bên cạnh động viên tinh thần để hoàn thành khóa lụận Do thiếu sót kinh nghiệm thời gian thực nên đề tài không tránh khỏi nhiều thiếu sót Tôi mong nhận góp ý thầy cô bạn bè để khóa luận hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội ngày 25 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Hương MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………… …1 CHƯƠNG TỔNG QUAN………………………………………………… 1.1 Tổng quan nhóm kháng sinh carbapenem .3 1.1.1 Nguồn gốc .3 1.1.2 Dược động học 1.1.3 Phổ tác dụng 1.1.4 Tính chất lý hóa 1.1.5 Liên quan thông số PK/PD đến hoạt tính diệt khuẩn kháng sinh nhóm carbapenem 1.1.6 Một số phương pháp phân tích nghiên cứu để định lượng imipenem meropenem huyết tương .7 1.2 1.2.1 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .10 Nguyên tắc 10 1.2.2 Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao 10 1.2.3 Tổng quan phân tích thuốc dịch sinh học .11 CHƯƠNG HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… ………………………………………………… …… 13 2.1 Hóa chất, thiết bị .13 2.1.1 Hóa chất 13 2.1.2 Thiết bị 13 2.2 Nội dung, đối tượng phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Nội dung nghiên cứu .14 2.2.2 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.4 Cách tiến hành thẩm định tiêu chí 15 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………… 18 3.1 Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng imipenem meropenem huyết tương .18 3.1.1 Quy trình xử lý mẫu 19 3.1.2 Lựa chọn cột sắc ký 23 3.1.3 Lựa chọn thành phần pha động 23 3.1.4 Lựa chọn chế độ gradient pha động .23 3.1.5 Lựa chọn tốc độ dòng 25 3.1.6 Lựa chọn bước sóng 26 3.1.7 Điều kiện sắc ký xây dựng 27 3.2 Thẩm định phương pháp 27 3.2.1 Chuẩn bị dung dịch chạy sắc ký 27 3.2.2 Thẩm định phương pháp .29 3.3 Ứng dụng phương pháp HPLC xây dựng để định lượng imipenem meropenem huyết tương bệnh nhân 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………… 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các thông số dược động học imipenem meropenem Bảng 1.2 Tóm tắt nghiên cứu thực định lượng nồng độ carbapenem máu Bảng 3.1 Pha dung dịch chuẩn 28 Bảng 3.2 Kết khảo sát độ phù hợp hệ thống phương pháp 29 Bảng 3.3 Kết khảo sát tính tuyến tính imipenmem 33 Bảng 3.4 Kết khảo sát tính tuyến tính meropenem 34 Bảng 3.5 Kết khảo sát LLOQ Imipenem Meropenem 36 Bảng 3.6 Kết độ đúng, độ xác ngày imipenem meropenem 38 Bảng 3.7 Tóm tắt khoảng dao động độ đúng, độ xác ngày hai kháng sinh 39 Bảng 3.8 Kết độ đúng, độ xác khác ngày 40 Bảng 3.9 Kết khảo sát độ ổn định hai carbapenem sau ba chu kỳ đông rã 41 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ ổn định ngày hai carbapenem 42 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ ổn định dài ngày hai carbapenem 43 Bảng 3.12 Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi imipenem meropenem 46 Bảng 3.13 Kết định lượng số mẫu máu bệnh nhân dùng imipenem 47 Bảng 3.14 Kết định lượng mẫu máu bệnh nhân dùng meropenem 48 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo imipenem .4 Hình 1.2 Công thức cấu tạo meropenem Hình 3.1 Quy trình xử lý mẫu carbapenem huyết tương trắng .20 Hình 3.2 Tóm tắt quy trình xử lý mẫu carbapenem huyết tương bệnh 22 Hình 3.3 Sắc ký đồ chế độ gradient (1) 24 Hình 3.4 Sắc ký đồ chế độ gradient (2) 24 Hình 3.5 Sắc ký đồ chế độ gradient (3) 25 Hình 3.6 Phổ UV imipenem 26 Hình 3.7 Phổ UV meropenem 26 Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng .31 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng thêm imipenem (a) meropenem (b) 31 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng thêm imipenem meropenem 32 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu chuẩn cilastatin pha dung dịch MOPS 32 Hình 3.12 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan tỉ số diện tích pic imipenem/meropenem nồng độ imipenem 33 Hình 3.13 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan tỉ số diện tích pic meropenem/imipenem nồng độ meropenem 34 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu huyết tương bệnh dùng imipenem 48 Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu huyết tương bệnh dùng meropenem .49 DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng anh Nghĩa tiếng việt DHP – Dehydropeptidase – ES External Standard Chuẩn ngoại IS Internal Standard Chuẩn nội HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography HQC High Quality Control Mẫu chuẩn nồng độ cao LQC Low Quality Control Mẫu chuẩn nồng độ thấp LLOQ Lower Limit of Quantification Giới hạn định lượng MIC Minimum Inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu Concentration MOPS 3-morpholinopropanesulfonic MQC Medium Quality Control Mẫu chuẩn nồng độ trung bình MS Mass Spectrometry Khối phổ PD Pharmacodynamic Dược lực học PK Pharmacokinetic Dược động học Ppm Part per million Nồng độ phần triệu QC Quality Control Mẫu chuẩn RSD (%) Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn Giá trị trung bình TB T/MIC Time above MIC Thời gian nồng độ thuốc lớn nồng độ ức chế tối thiểu UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng sinh nhóm thuốc quan trọng hàng đầu nay, đặc biệt nước nhiệt đới với loại nhiễm khuẩn đa dạng nguy hiểm Việt Nam Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý dẫn đến hệ lụy xuất loạt chủng vi khuẩn kháng thuốc nhiều loại kháng sinh không sử dụng bị đề kháng nhiều Nhiều nhóm kháng sinh quý aminoglycosid, cephalosporin… bị đề kháng với tỷ lệ đáng báo động [6] Các kháng sinh xem phòng tuyến cuối người với vi khuẩn colistin, carbapenem xuất nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc [7,9] Hiện nay, carbapenem, hay sử dụng imipenem meropenem, xem lựa chọn cuối để điều trị chủng vi khuẩn đa kháng lựa chọn hàng đầu điều trị kinh nghiệm khoa điều trị tích cực (ICU) Để tránh tượng đề kháng carbapenem, cần sử dụng phác đồ kháng sinh hợp lý để tối ưu hóa tác dụng thuốc giảm đề kháng vi khuẩn Carbapenem nhóm kháng sinh phụ thuộc thời gian, tức hiệu lực tác dụng kháng sinh phụ thuộc khoảng thời gian nồng độ thuốc máu cao nồng độ ức chế tối thiểu (T/MIC) [8] Mô hình dược động học thuốc với cá thể bệnh nhân, đặc biệt bệnh nhân nặng bệnh nhân suy thận, bệnh nhân bỏng nặng…có dao động lớn so với quần thể thông thường [18] Vì vậy, việc giám sát nồng độ thuốc máu bệnh nhân sử dụng carbapenem đặc biệt nhóm bệnh nhân có thay đổi nhiều thông dược động học đóng vai trò quan trọng thành công chiến lược điều trị kháng sinh Hiện nay, Việt Nam có phương pháp định lượng imipenem, meropenem ertapenem sắc ký lỏng hiệu cao áp dụng phân tích thường quy [10] Tuy nhiên, phương pháp số điểm cải thiện để thuận lợi cho trình phân tích thời gian phân tích mẫu tương đối dài Xuất phát từ yêu cầu thực tế lâm sàng cần xác định nồng độ imipenem meropenem huyết tương để xây dựng mô hình dược động học thuốc tương ứng với cá thể bệnh nhân, cải tiến phương pháp để rút ngắn thời gian phân tích Đề tài “Xây dựng phương định lượng imipenem meropenem huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao” thực với hai mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng imipenem meropenem huyết tương sắc ký lỏng hiệu Ứng dụng phương pháp định lượng nồng độ imipenem meropenem huyết tương bệnh nhân sử dụng kháng sinh Nhận xét: kết cho thấy nồng độ kháng sinh mẫu nồng độ thấp, trung bình, cao bảo quản nhiệt độ phòng 8h lại khoảng 86% – 93% so với nồng độ ban đầu với imipenem 93% - 98% với meropenem chứng tỏ kháng sinh bền trình xử lý mẫu ngày  Độ ổn định dài ngày Cách tiến hành: Độ ổn định mẫu bảo quản dài ngày xác định nồng độ LQC, MQC, HQC kháng sinh, nồng độ xác định mẫu độc lập Mẫu bảo quản tủ lạnh âm sâu -80oC Mẫu định lượng thời điểm ban đầu, sau ngày, sau 14 ngày sau 21 ngày So sánh kết định lượng so với thời điểm ban đầu, nồng độ kháng sinh xác định dựa vào đường chuẩn ngày Bảng 3.11 Kết khảo sát độ ổn định dài ngày hai carbapenem Imipenem LQC (1 ppm) MQC (20 ppm) HQC (40 ppm) 88,6 115,9 114,5 89,4 101,7 113,8 92,9 105,5 102,7 TB (%) 90,3 107,7 110,3 RSD (%) 2,6 6,8 6,03 82,3 81,0 86,7 84,6 84,3 83,0 83,1 80,6 85,8 TB (%) 83,3 82,0 85,2 RSD (%) 1,4 2,5 2,3 Ngày 50,5 59,2 53,0 14 62,4 61,1 50,7 49,2 64,1 56,7 TB (%) 54,0 61,5 53,5 RSD (%) 13,5 4,0 5,6 Ngày Ngày 43 LQC (1 ppm) MQC (20 ppm) HQC (40 ppm) 99,9 94,8 93,9 100,6 96,9 96,5 94,5 90,7 97,1 98,3 94,2 95,8 3,4 3,4 1,7 87,3 86,6 86,7 87,1 91,1 86,3 93,2 95,5 92,7 TB (%) 89,2 91,1 88,6 RSD (%) Ngày 14 3,9 4,7 4,1 82,0 83,6 76,7 75,9 80,2 81,1 80,2 76,0 76,9 TB (%) 79,4 79,9 78,2 RSD (%) Ngày 21 4,0 4,8 3,2 75,2 68,3 76,8 82,9 77,2 70,9 81,0 79,2 77,9 TB (%) 79,7 74,9 75,2 RSD (%) 5,0 7,7 5,0 Meropenem Ngày TB (%) RSD (%) Ngày 3 Nhận xét: vòng ngày bảo quản tủ lạnh âm sâu -80oC, hai kháng sinh lại 80% so với nồng độ ban đầu, sau 14 ngày, imipenem lại 50% meropenem lại gần 80% so với nồng độ ban đầu Do kháng sinh sau lấy mẫu bảo quản vòng ngày để định lượng 44 3.3.3.7 Tỷ lệ thu hồi carbapenem từ dịch sinh học Cách tiến hành: Pha dung dịch carbapenem dung dịch bảo quản MOPS huyết tương theo quy trình trên, tiến hành chạy sắc ký so sánh tỷ lệ diện tích pic hai carbapenem dung dịch MOPS huyết tương xử lý 45 Bảng 3.12 Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi imipenem meropenem S pic sau xử lý mẫu (mAu.s) S pic pha MOPS (mAu.s) Tỷ lệ thu hồi (%) Imipenem 377,8 237,7 62,9 372,7 228,2 61,2 355,6 236,3 66,4 378,4 205,9 54,4 355,5 217,6 61,2 480,6 237,2 49,4 362,0 191,4 52,9 351,5 224 63,7 344,1 243,1 70,7 TB 60,3 RSD 11,3 Meropenem 52,4 30,3 57,8 57 30,8 54,4 46,6 31,4 67,4 TB 59,7 RSD 11,5 812,7 566,9 69,8 824,6 566,4 68,7 899 599,8 66,7 TB 68,4 RSD 2,3 1637 1208,9 73,9 1511,4 1291,4 85,4 1499,8 1161,4 77,4 TB 78,9 RSD 7,5 46 Nhận xét: không thêm chuẩn nội, tỷ lệ thu hồi thấp (từ 49,4% – 70,7% với imipenem 54,4% – 85,4% với meropenem), tỷ lệ thu hồi nồng độ chênh lệch không 15% Việc thêm chuẩn nội giảm thiểu sai số hao hụt mẫu sau trình xử lý mẫu phức tạp Từ kết thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp HPLC xây dựng để định lượng imipenem meropenem huyết tương đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích dịch sinh học theo tiêu chí FDA Phương pháp áp dụng để định lượng nồng độ kháng sinh huyết tương bệnh nhân sử dụng kháng sinh 3.3 Ứng dụng phương pháp HPLC xây dựng để định lượng imipenem meropenem huyết tương bệnh nhân Phương pháp định lượng xây dựng áp dụng phân tích mẫu máu bệnh nhân bỏng sử dụng imipenem đường tĩnh mạch Bệnh viện Bỏng bệnh nhân sử dụng meropenem bệnh viện đa khoa thành phố Việt Trì.Mẫu huyết tương bệnh sử dụng lấy từ hai nghiên cứu dược động học môn Dược lý – Dược lâm sàng trường đại học Dược Hà Nội chấp nhận hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học hai nghiên cứu Kết định lượng số mẫu máu bệnh nhân trình bày bảng 3.13 Bảng 3.13 Kết định lượng số mẫu máu bệnh nhân dùng imipenem Bệnh nhân Thời điểm Thời điểm 6,74 3,18 19,09 2,01 12,25 2,95 8,71 8,31 8,72 1,77 12,46 1,95 5,36 0,64 11,28 1,34 47 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu huyết tương bệnh dùng imipenem Bảng 3.14 Kết định lượng mẫu máu bệnh nhân dùng meropenem Thời điểm 19,69 14,50 4,39 49,39 33,95 16,10 33,31 21,43 10,48 24,28 30,05 14,52 17,67 13,99 10,58 31,77 47,95 31,28 30,34 29,37 18,84 32,56 49,23 31,48 Mẫu bệnh nhân 48 Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu huyết tương bệnh dùng meropenem 49 BÀN LUẬN Phương pháp xây dựng rút ngắn thời gian lưu hai kháng sinh so với nghiên cứu trước đó, giúp giảm thời gian phân tích mẫu tượng kéo đuôi pic thời gian lưu dài Đồng thời, việc sử dụng kênh pha động methanol đơn giản so với việc dùng methanol 40% nước nghiên cứu trước Lựa chọn phương pháp chuẩn nội giúp giảm thiểu sai số mẫu trình xử lý, dịch sinh học phải xử lý qua nhiều công đoạn, mẫu hao hụt lớn Việc chọn chuẩn nội hai kháng sinh cần định lượng cho phép tối giản hóa việc xử lý mẫu sai số bệnh nhân không dùng đồng thời hai kháng sinh Kháng sinh carbapenem chọn làm chuẩn nội đáp ứng yêu cầu chất chuẩn nội: chất chuẩn nội tách hoàn toàn khỏi chất cần phân tích điều kiện sắc ký, có cấu trúc hóa học tương tự chất thử, không phản ứng với thành phần mẫu thử dễ kiếm Mẫu huyết tương bệnh có mẫu phức tạp, sử dụng nhiều loại thuốc, lựa chọn đảm bảo chất chuẩn nội chất phân tích có độ phân giải tốt không bị ảnh hưởng pic tạp có huyết tương Pha động sử dụng dung môi độc tốn kém, phương pháp áp dụng thường quy để định lượng nồng độ kháng sinh máu, phục vụ công tác giám sát nồng độ thuốc máu nghiên cứu dược động học, dược lực học để tối ưu hóa liệu pháp điều trị kháng sinh carbapenem Phương pháp áp dụng mẫu huyết tương bệnh thực tế sử dụng kháng sinh cho kết phù hợp với liệu dược động học thuốc y văn Nồng độ thuốc bệnh nhân thực dao động lớn cá thể khác cho thấy tầm quan trọng việc giám sát nồng độ thuốc máu để cá thể hóa điều trị Các nồng độ định lượng huyết tương bệnh thực tế nồng độ lý thuyết nằm khoảng tuyến tính đường chuẩn, khoảng nồng đường chuẩn xây dựng hợp lý để định lượng nồng độ thuốc thực tế 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Đã xây dựng phương pháp định lượng imipenem meropenem huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao Điều kiện triển khai sắc ký:  Cột Apollo C8 (150 x 4,6 mm, 5µm)  Pha động: đệm phosphat 0,05 M; pH 7,4 methanol với chế độ gradient, tốc độ dòng 1mL/phút  Detector UV bước sóng 298 nm thể tích tiêm mẫu 50 µL  Thời gian chạy sắc ký 12 phút Phương pháp HPLC xây dựng thẩm định tiêu chí FDA với độ chọn lọc tốt, độ tuyến tính cao với r > 0,999, khoảng nồng độ từ 0,5 đến 50 ppm với hai kháng sinh Phương pháp có độ xác giới hạn cho phép Các carbapenem chứng minh ổn định thời gian phân tích, sau chu kỳ đông – rã đông ổn định vòng ngày bảo quản tủ lạnh âm sâu -80 o C Đã áp dụng phương pháp xây dựng để định nồng độ imipenem meropenem huyết tương số bệnh nhân sử dụng kháng sinh Đề xuất Từ kết nghiên cứu thu được, đề xuất sau: Áp dụng phương pháp xây dựng việc định lượng nồng độ kháng sinh imipenem meropenem huyết tương để thực giám sát nồng độ thuốc máu (TDM) nghiên cứu dược động học, dược lực học kháng sinh carbapenem, nhóm kháng sinh quý cần sử dụng thận trọng để đảm bảo hiệu điều trị giảm đề kháng 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Bộ y tế (2007), Dược lý tập 2, NXB y học, tr.153 Bộ y tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam tr.1799 Bộ y tế (2012), Hóa phân tích tập 2, NXB y học, tr.168 – 185 Bộ y tế (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB y học, tr.85 – 110 Lương Quốc Huy (2007), Xây dựng phương pháp định lượng imipenem huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao, Luận án tốt nghiệp dược sĩ, Đại Học Dược Hà Nội Nguyễn Văn Kính (2010), Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Nam, Global Antibiotic Resistance Partnership – nhóm nghiên cứu quốc gia Việt Nam, tr IV Phạm Hùng Vân nhóm nghiên cứu MIDAS (2009), Nghiên cứu đa trung tâm tình hình đề kháng imipenem meropenem trực khuẩn Gram (-) dễ mọc kết 16 bệnh viện Việt Nam, tr – Robert C Owens Jr (Dược sĩ lâm sàng chuyên ngành nhiễm khuẩn, Maine Medical Center Portland) Andrew F.Slow (Bác sĩ chăm sóc tích cực, Washington Hospital Center, Washington DC) Nguyễn Thị Vân Anh, Nguyễn Hoàng Anh (2010), “Hiệu chỉnh liều kháng sinh: chiến thuật dược động học dược lực học”, Trung tâm DI & ADR quốc gia Trần Khánh Linh, Lê Thị Liên, Trần Thị Bích Phượng, Lê Hà Tầm Dương, Cao Thị Bảo Vân (2016) “Phát vi khuẩn kháng hầu hết kháng sinh kể Carbapenem Colistin số bệnh viện Thành phố Hồ Chí Minh”, Tạp chí y học dự phòng, tập XXVI, tr.34 10 Trần Mạnh Thông, Phạm Thị Thanh Hà, Nguyễn Thị Kiều Anh, Nguyễn Thanh Hiền, Quyễn Quốc Kính, Nguyễn Hoàng Anh (2012), “Xây dựng phương pháp định lượng ba kháng sinh huyết tương HPLC”, Tạp chí nghiên cứu Dược thông tin thuốc số 1/2012, tr.12 – 16 i B Tiếng Anh 11 E Daillya, R Bouquié, G Deslandes, P Jolliet, R Le Flochc (2011), “A liquid chromatography assay for a quantification of doripenem, ertapenem, imipenem, meropenem concentrations in human plasma: Application to a clinical pharmacokinetic study”, Journal of Chromatography B, pp 1138 – 1139 12 A D Deshpande, K G Baheti and N R Chatterjee (2004), “Degradation of betalactam antibiotics”, Institute of Pharmaceutical Sciences and Research, India, pp 1684 13 Food and Drug Administration – United State (2001), Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation 14 Rei Kato, Xiao-Pen Lee, Takeshi Kumazawa, Masaya Fujishiro, Junichi Sato, Toshiko Sawaguchi, Akemi Marumo, Mikako Ueshima Takeshi Aoki, Masahiro Murakami, Yohei Sasaki, Takuro Furuya, Keizo Sato (2016), “High throughput analysis of carbapenems in human plasma”, Journal of The Showa University society, pp.1 – 15 Guanyang Lin, Haiyan Zhang, Feng Xue, Wenjuan Li, Naihua Liu, Lianguo Chen, Xianqin Wang, Renai Xu & Jianshe Ma (2011), “Determination of Meropenem in Rabbit Plasma by LC–MS/MS”, Latin American Journal of Pharmacy (formerly Acta Farmacéutica Bonaerense) pp.1895 – 1899 16 Tiphaine Legrand, Stéphanie Chhun, Elisabeth Rey, Benoît Blanchet, JeanRalph Zahar, Fanny Lanternier, Gérard Pons, Vincent Jullien (2008), “Simultaneous determination of three carbapenem antibiotics in plasma by HPLC with ultraviolet detection”, Journal of Chromatography B, pp.552 – 555 17 The Merck Index (2009), Merck & Co 18 Johan W Mouton, Daan J Touw, Alphonsus M Horrevorts1 and Alexander A.T.M.M Vinks (2000) “Comparative Pharmacokinetics of the Carbapenems”, Drug dispostion, pp.196 ii 19 Steen Hasen Stig Pedersen – Bjergaard Knut Rasmussen (2012), Introduction to Pharmaceutical Chemical Analysis, pp.460 – 467 20 Rigo-Bonnin R, Juvany-Roig R, Leiva-Badosa E, Sabater-Riera J, PérezFernández XL, Cárdenas-Campos P, Sospedra-Martínez E, Colom H, Alía P (2014), “Measurement of meropenem concentration in different human biological fluids by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry”, Laboratori Clínic Department, Hospital Universitari de Bellvitge, Feixa Llarga s/n, 08907 L'Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Spain 21 British National Formulary 67 (2014), Royal Pharmaceutical Society,pp.368 22 Koal T, Deters M, Resch K, Kaever V (2006), “Quantification of the carbapenem antibiotic ertapenem in human plasma by a validated liquid chromatography-mass spectrometry method”, Hannover Medical School, Institute of Pharmacology, Carl-Neuberg-Strasse 1, D-30625 Hannover, Germany, pp.240 – 244 23 Omar Samir Tabbouche, M.Sc., Pharm.D and Itab Soukkariyyeh, B.Pharm (2014), “First-order derivative ultraviolet spectrophotometry of imipeneme cilastatin formulations”, Journal of Taibah University Medical Sciences, pp.178 – 181 24 Marie-Cle´mence Verdier, Olivier Tribut, Pierre Tattevin, Yves Le Tulzo, Christian Michelet, and Danie`le Bentue´-Ferrer1 (2011), Simultaneous Determination of 12 -Lactam Antibiotics in Human Plasma by High-Performance Liquid Chromatography with UV Detection: Application to Therapeutic Drug Monitoring, Antimicrobial agents and chemotherapy p.4873–4879 25 George G Zhanel, Ryan Wiebe, Leanne Dilay, Kristjan Thomson, Ethan Rubinstein, Daryl J Hoban, Ayman M Noreddin and James A Karlowsky (2007), “Comparative Review of the Carbapenems”, Drug, 67(7), p.1034 C Tài liệu internet 26 https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/7456, ngày truy cập 05/05/2017 27 https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/11215, ngày truy cập 05/05/2017 iii PHỤ LỤC Pha dung dịch ổn định MOPS 2,64% Cân xác khoảng 2,64g MOPS, hòa tan hoàn toàn 100mL dung dịch bình định mức nước cất siêu Điều chỉnh đến pH 6,8 dung dịch NaOH 1N Pha dung dịch chuẩn carbapenem dung dịch MOPS Căn vào thành phần biệt dược: TIENAM®, MERREM® xác định khối lượng bột thuốc tương đương 10mg kháng sinh sau:  21,2mg TIENAM® tương đương 10mg imipenem  13,5mg MERREM® tương đương 10mg meropenem  Pha dung dịch chuẩn gốc 1mg/mL kháng sinh cách hòa tan lượng bột xác tương đương khoảng 5mg với Imipenem 10mg với meropenem vào bình định mức 5mL dung dịch MOPS  Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng với dung dịch MOPS để dung dịch chuẩn nồng độ cần thiết gồm dung dịch chuẩn 10ppm 100ppm Pha dung dịch chuẩn nội (IS)  Khi định lượng Imipenem Meropenem 20ppm dùng làm chuẩn nội  Khi định lượng Meropenem Imipenem 20ppm dùng làm chuẩn nội Pha pha động  Kênh A: đệm phosphat 0,05 M; pH = 7,4 Pha 2L dung dịch đệm cách sau:  Cân xác khoảng 2,4g KH2PO4 23,68g K2HPO4.3H2O  Hòa tan 2L nước cất hai lần  Chỉnh pH = 7,4 dung dịch acid phosphoric  Lọc qua màng lọc 0,45µm  Siêu âm đuổi khí 10 phút  Kênh B : Methanol tiêu chuẩn HPLC iv Quy trình xử lý mẫu carbapenem huyết tương trắng 200 µl HT Thêm 200 µl dd Carbapenem Thêm 100 µl chẩn nội 500 µl HT+ kháng sinh Lắc xoáy 30 giây (1000 vòng/phút) Để yên phút 500 µl HT+ks trộn Thêm 500 µl Acetonitril Dịch li tâm+ cặn protein Lắc xoáy 30 giây, để yên phút Ly tâm 15 phút (9000 vòng/phút) Hút 500 µl dịch, cho vào vial 500µl dịch ly tâm Bay dung môi dòng N2 Nhiệt độ phòng Cắn Hòa tan lại 200µl dd MOPS 200 µl dịch chạy HPLC v Quy trình xử lý mẫu carbapenem huyết tương bệnh 400 µl HT bệnh + MOPS Thêm 100 µl chẩn nội 500 µl HT+ kháng sinh Lắc xoáy 30 giây(1000 vòng/phút) Để yên phút 500 µl HT+ks trộn Thêm 500 µl Acetonitril Lắc xoáy 30 giây, để yên phút Li tâm 9000 vòng/phút 15 Dịch li tâm+ cặn protein phút Hút 500 µl dịch, cho vào vial 500µl dịch ly tâm Bay dung môi dòng N2 Nhiệt độ phòng Cắn Hòa tan lại 200µl dd MOPS 200 µl dịch chạy HPLC vi ... pháp để rút ngắn thời gian phân tích Đề tài Xây dựng phương định lượng imipenem meropenem huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao thực với hai mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng imipenem. .. lượng sắc ký lỏng hiệu cao Tất phương pháp định lượng sắc ký dựa nguyên tắc: Nồng độ chất phân tích tỷ lệ với chiều cao diện tích pic sắc ký đồ Có bốn phương pháp hay sử dụng sắc ký: phương pháp. .. HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1201277 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG IMIPENEM VÀ MEROPENEM TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: