Xây dựng phương pháp định lượng polydatin trong rễ cây cốt khí củ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ NGỌC DUY Mã sinh viên: 1201083 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYDATIN TRONG RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ NGỌC DUY 1201083 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYDATIN TRONG RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths Phạm Lê Minh ThS Nguyễn Thị Hà Ly Nơi thực hiện: Khoa Hóa Phân Tich- Tiêu Chuẩn Viện Dược Liệu HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Bản khóa luận thực hoàn thành Viện Dược Liệu với hướng dẫn ThS Phạm Lê Minh ThS Nguyễn Thị Hà Ly Em xin chân thành cảm ơn ThS Phạm Lê Minh định hướng nghiên cứu góp ý giúp em hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Hà Ly hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thùy Linh tận tình chỉ bảo giúp đỡ em quá trình làm khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Dược Liệu, PGS.TS Phương Thiện Thương, TS Nguyễn Thị Phương, Ds Hoàng Đình Quân, Ds Vũ Ngọc Khánh, Ds Bùi Thị Khánh Linh, chị Hoàng Thị Tuyết các cán khoa Hóa phân tích tiêu chuẩn, Viện Viện Dược Liệu tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè bên em, chia sẻ khó khăn, động viên giúp đỡ em thời gian em thực khóa luận Do thời gian thực đề tài có hạn nên không tránh thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy cô các bạn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Lê Ngọc Duy MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan cốt khí củ (Reynoutria Japonica Houtt.) 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Ứng dụng y học cổ truyền 1.1.5 Thành phần hóa học 1.1.6 Tác dụng sinh học 10 1.2 Tổng quan polydatin 11 1.2.1 Nguồn gốc 11 1.2.2 Công thức cấu tạo 11 1.2.3 Tính chất hóa lý 11 1.2.4 Tác dụng sinh học 11 1.2.5 Các phương pháp phân tích PD rễ cốt khí củ 13 1.3 Tổng quan phương pháp HPLC 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 17 2.1.1 Nguyên vật liệu 17 2.1.2 Hóa chất dung môi 17 2.1.3 Thiết bị dùng nghiên cứu 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng polydatin bằng HPLC 18 2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 18 2.2.3 Phân tích mẫu thực 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử 18 2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 19 2.3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 19 2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 19 2.3.5 Phân tích mẫu thực 23 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 24 3.1.1 Lựa chọn bước sóng phân tích 24 3.1.2 Khảo sát dung môi pha động 24 3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 26 3.2.1 Khảo sát phương pháp chiết 26 3.2.2 Khảo sát dung môi chiết 27 3.2.3 Khảo sát số lần chiết 28 3.2.4 Quy trình xử lý mẫu lựa chọn 29 3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 30 3.3.1 Tính chọn lọc phương pháp 30 3.3.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 30 3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn 31 3.3.4 Tính thích hợp hệ thống 33 3.3.5 Độ lặp lại 33 3.3.6 Độ 34 3.4 Kết định lượng polydatin số mẫu rễ cốt khí củ 36 3.5 Bàn luận 37 3.5.1 Đối tượng nghiên cứu 37 3.5.2 Quy trình xử lý mẫu 37 3.5.3 Phương pháp định lượng 38 3.5.4 Kết phân tích mẫu cốt khí củ thực 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh tên khoa học Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril Adr Adramicin Adramicin ALT Alanine amiontransferase AOAC AST DĐHK Association of Official Analytical Hiệp hội nhà hóa Communities phân tích thống Aspartate aminotransferase Hong Kong Chinese Materia Medica Standards Dược điển Hồng Kông DĐTQ Chinese pharmacopoeia Dược diển Trung Quốc DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid EtOH Ethanol Ethanol GSH Glutathione Glutathion GST Glutathiol S- transferases HPLC HPLCFLD HPLCPDA HPTLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography cao High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography fluorescence cao ghép nối detector detection huỳnh quang High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography photodiode array cao ghép nối detector detetion mảng iod High performance thin layer Săc ký lớp mỏng hiệu chromatography cao IL Interleukin Interleukin LC- Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng ghép khối MS/MS mass spectrometry phổ lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng mARN Messenger acid ribonucleic ARN thông tin MDA Malondialdehyde MeOH Methanol MPO Myeloperoxidase PD Polydatin Polydatin R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn Sterol regulartory element-binding Yếu tố phiên mã điều hòa protein-1c sterol TC Total cholesterol Cholesterol toàn phần TG Triglyceride Triglycerid TNF-α Tumor necrosic factor alpha SREBP-1c Methanol Yếu tố hoại tử khối u alpha DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Mẫu cốt khí củ 17 Bảng 3.1 Các cực đại hấp thụ polydatin 24 Bảng 3.2 Chương trình dung môi 25 Bảng 3.3 Kết khảo sát phương pháp chiết 26 Bảng 3.4 Kết khảo sát dung môi chiết 27 Bảng 3.5 Kết khảo sát tỷ lệ dung môi 28 Bảng 3.6 Kết khảo sát số lần chiết 28 Bảng 3.7 Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích pic PD 32 Bảng 3.8 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống 33 Bảng 3.9 Kết đánh giá độ lặp lại 34 Bảng 3.10 Kết thẩm định độ phương pháp 35 Bảng 3.11 Kết định lượng PD số mẫu cốt khí củ 36 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cành rễ cốt khí củ Hình 1.2 Khung mạch cacbon nhóm chất stilben Hình 1.3 CTCT số hợp chất stilben có cốt khí củ Hình 1.4 Khung mạch cacbon hợp chất anthranoid Hình 1.5 CTCT số hợp chất anthranoid rễ cốt khí củ Hình 1.6 CTCT số hợp chất phenolic flavonoid rễ cốt khí củ 10 Hình 1.7 CTCT polydatin 11 Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS polydatin 24 Hình 3.2 Sắc kí đồ PD mẫu thử chương trình dung môi 25 Hình 3.3 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu lựa chọn 29 Hình 3.4 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc phương pháp HPLC-UV 30 Hình 3.5 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ 31 Hình 3.6 Đường chuẩn PD 32 51 Zhao Ke-Seng, Jin Chunhua, et al (2003), "The mechanism of Polydantin in shock treatment", Clin Hemorheol Microcirc, 29, pp 211217 52 Zhao Rui-zhi, Liu Shaojun, et al (2005), "Rapid Quantitative HPTLC Analysis, on One Plate, of Emodin, Resveratrol, and Polydatin in the Chinese Herb Polygonum cuspidatum", Chromatographia, 61, pp 311– 314 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Phụ lục 2: Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết Phụ lục 3: Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết Phụ lục 4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Phụ lục 5: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng Phụ lục 6: Sắc ký đồ định lượng mẫu thử Phụ lục 1: Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Phụ lục 2: Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết Phụ lục 3: Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết Phụ lục 4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Phụ lục 5: sắc ký đồ thẩm định độ đúng Phụ lục 6: Sắc ký đồ định lượng mẫu thử ... xác chất lượng dược liệu cốt khí củ Việt Nam [1] Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng polydatin rễ cốt khí củ Chỉ có nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng resveratrol... luận cốt khí củ DĐVN thực đề tài “XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYDATIN TRONG RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO với hai mục tiêu sau: - Xây dựng phương pháp định. .. quy định hàm lượng polydatin không thấp 0,15% [14] Dược Điển Hồng Kông cũng quy định hàm lượng polydatin resveratrol tiêu chí định lượng để đánh giá chất lượng mẫu dược liệu cốt khí củ (yêu