Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ THÚY DIỆU MSV: 1101077 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ THÚY DIỆU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Th.S Trần Thị Lan Hương Th.S Tạ Mạnh Hùng Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa dược- ĐH Dược HN Trung tâm đánh giá TĐSH - VKN thuốc TW HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến Th.S Trần Thị Lan Hương - Giảng viên môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Th.S Tạ Mạnh Hùng - Giám đốc Trung tâm Tương đương sinh học Phó Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương tận tình bảo, hướng dẫn em thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Trung tâm Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, thầy cô anh, chị tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em suốt thời gian thực khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô, cán Trường Đại học Dược Hà Nội, người trang bị cho em nhiều kiến thức suốt trình học tập để em có thành ngày hôm Xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè - người bên động viên, cổ vũ giúp đỡ em sống Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên Trần Thị Thúy Diệu MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .2 1.1 Tổng quan Pantoprazol 1.1.1 Công thức hóa học 1.1.2 Tính chất hóa lý 1.1.3 Cơ chế tác dụng, dược động học, định PAN 1.1.4 Một số chế phẩm thị trường .3 1.1.5 Một số phương pháp định lượng PAN dịch sinh học 1.2 Tổng quan HPLC thẩm định phương pháp định lượng thuốc dịch sinh học 1.2.1 Tổng quan HPLC 1.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng thuốc dịch sinh học .9 CHƯƠNG 2: ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Điều kiện thực nghiệm .11 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.4 Phương pháp xử lí kết 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT .20 3.1 Kết xây dựng phương pháp định lượng .20 3.2 Kết thẩm định phương pháp phân tích 27 3.3 Bàn luận .40 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT PAN : Pantoprazol CV : Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation) HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) IS : Chất nội chuẩn (Internal standand ) LLOQ : Nồng độ giới hạn định lượng (Lower Limit of Quantification) ULOQ : Nồng độ giới hạn định lượng (Upper Limit of Quantification) QC : Mẫu kiểm tra chất lượng (Quality Control Samples) LQC : Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (Lower Quality Control Samples) MQC : Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (Middle Quality Control Samples) HQC : Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High Quality Control Samples) MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol SKĐ : Sắc ký đồ Cmax : Nồng độ đỉnh T1/2 : Thời gian bán thải UV–VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultra violet – Visble) US–FDA : Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ (United States of American Food and Drug Administration) EMA : Cơ quan quản lý thuốc Châu âu (European Medicine Agency) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Một số chế phẩm pantoprazol thị trường 1.2 Một số nghiên cứu định lượng pantoprazol dịch sinh học 2.1 Các chất chuẩn dùng nghiên cứu 11 2.2 Các hóa chất dùng nghiên cứu 11 2.3 Các mẫu huyết tương trắng nghiên cứu 12 2.4 Các thiết bị dùng nghiên cứu 12 2.5 Chuẩn bị đường chuẩn 14 2.6 Chuẩn bị mẫu kiểm tra 14 3.1 Kết đáp ứng mẫu trắng 28 3.2 Kết thẩm định đường chuẩn 29 3.3 Kết thẩm định giới hạn định lượng 30 3.4 Kết thẩm định độ đúng, độ xác ngày 31 3.5 Kết thẩm định độ đúng, độ xác khác ngày 32 3.6 Kết thẩm định tỷ lệ thu hồi nội chuẩn 33 3.7 Kết thẩm định tỷ lệ thu hồi pantoprazol 34 3.8 Độ ổn định dung dịch nội chuẩn thời gian ngắn 35 3.9 Độ ổn định dung dịch chuẩn pantoprazol gốc dài ngày 35 3.10 Độ ổn định mẫu huyết tương sau chu kỳ đông – rã 36 3.11 Độ ổn định mẫu huyết tương nhiệt độ phòng thời gian ngắn 37 3.12 Độ ổn định nồng độ 90 ng/mL nhiệt độ phòng thời gian dài 38 3.13 Độ ổn định nồng độ 3500 ng/mL nhiệt độ phòng thời gian dài 38 3.14 Độ ổn định mẫu auto – sampler 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Nội dung Trang 3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS PAN 20 3.2 SKĐ PAN omeprazol 21 3.3 SKĐ PAN rabeprazol 21 3.4 SKĐ PAN lansoprazol 22 3.5 SKĐ PAN IS với tỷ lệ pha động 30:70 23 3.6 SKĐ PAN IS với tỷ lệ pha động 36:64 23 3.7 SKĐ PAN IS pha động MeCN: đệm phosphat pH 7,3 (36:64) với tốc độ dòng 1,3 mL 24 SKĐ PAN IS pha động MeCN: đệm phosphat pH 7,3 3.8 (36:64) với tốc độ dòng 1,5 mL 24 3.9 Quy trình xử lý mẫu 25 SKĐ mẫu chuẩn PAN (4000 ng/ml) IS với quy trình xử lý mẫu 3.10 chọn 26 3.11 SKĐ mẫu huyết tương trắng 27 3.12 SKĐ mẫu huyết tương trắng có chứa nội chuẩn 27 3.13 SKĐ mẫu huyết tương trắng chứa PAN 27 3.14 SKĐ mẫu huyết tương trắng chứa IS PAN nồng độ 30 ng/ml 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Loét dày - tá tràng bệnh phổ biến nước ta giới Hiện nay, bệnh đứng đầu tỉ lệ mắc số bệnh đường tiêu hóa Trên giới, ước tính khoảng 10% dân số mắc bệnh lứa tuổi, không phân biệt giới tính, tỉ lệ mắc bệnh người lớn cao trẻ em hàng năm tăng khoảng 0,2% [18] Có nhiều nhóm thuốc điều trị loét dày - tá tràng nhóm thuốc kháng acid, nhóm thuốc kháng H2, nhóm thuốc ức chế bơm proton Trong đó, nhóm thuốc ức chế bơm proton tác dụng nhanh, hiệu quả, tỷ lệ làm lành vết loét đạt tới 95% sau tám tuần điều trị Thuốc ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, tiết pepsin, yếu tố nội dày co bóp dày[1] Do đó, nhóm thuốc sử dụng nhiều phác đồ điều trị loét dày - tá tràng Pantoprazol thuốc thuộc nhóm ức chế bơm proton, thuốc dung nạp tốt, để lại tác dụng phụ nên thuốc sử dụng phổ biến Việt Nam Để có liều sử dụng hợp lý cho đối tượng bệnh nhân việc kiểm soát nồng độ hoạt chất huyết tương cần thiết Ngoài ra, việc giám sát chất lượng thuốc đánh giá tương đương sinh học thuốc chứa pantoprazol vô quan trọng nhằm nâng cao chất lượng thuốc giúp bác sĩ lựa chọn thuốc an toàn, hiệu quả, kinh tế Tuy vậy, nước ta chưa có quy trình chuẩn, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để định lượng pantoprazol huyết tương Xuất phát từ yêu cầu thực tế với mong muốn xây dựng phương pháp xác định nồng độ pantoprazol huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị đánh giá tương đương sinh học chế phẩm chứa hoạt chất pantoprazol tiến hành thực đề tài : “Xây dựng phương pháp định lượng Pantoprazol huyết tương phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” với nội dung chính: Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol huyết tương phương pháp HPLC Thẩm định phương pháp xây dựng, đề quy trình phân tích thường quy để định lượng pantoprazol huyết tương theo tiêu chuẩn US-FDA EMA CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ PANTOPRAZOL 1.1.1 Công thức hóa học - Pantoprazol (PAN) có công thức phân tử : C16H14F2N3O4S - Khối lượng phân tử : 383,37 - Công thức cấu tạo : - Tên khoa học : 5- (Diflomethoxy) – – [( 3, 4- dimethoxypyridin – 2- yl) methanesulfinyl] – 1H- 1,3 – benzodiazole [9,11,12] 1.1.2 Tính chất hóa lý - Bột kết tinh trắng gần trắng - Khó tan nước, log P = 2,18 - Rất dễ bị phân hủy môi trường acid, thường thấy dạng muối natri ngậm 1,5 phân tử nước - Hấp thu UV có liên kết đôi liên hợp [3,12,14] 1.1.3 Cơ chế tác dụng, dược động học, định pantoprazol * Cơ chế tác dụng: Sau hấp thu, PAN tích lũy ống tiết acid tế bào thành dày Ở đây, gắn kết với nhóm sulfhydryl hệ enzyme H+/ K+ - ATPase bề mặt tiết gastrin tế bào vách, gây ức chế tiết acid tiết acid kích thích PAN ức chế tiết acid dày mà không kể đến chất kích thích (acetylcholin, histamin, gastrin…) [1,2,20] * Dược động học: - Hấp thu: PAN hấp thu nhanh Nồng độ đỉnh Cmax PAN 2400 ng/mL đạt sau khoảng – 2,5 dùng PAN liều 40mg chia liều dùng liều Thức ăn làm tăng thời gian hấp thu không làm thay đổi Cmax diện tích đường cong AUC PAN - Phân bố: 98% PAN gắn kết với protein huyết tương Thể tích phân bố khoảng 0,17 l/kg, phân bố chủ yếu dịch ngoại bào - Chuyển hoá: PAN chuyển hoá chủ yếu gan nhờ enzym CYP2C19 cytochrom P450 để thành demethylpantoprazol - Thải trừ: Chất chuyển hoá tiết chủ yếu qua nước tiểu (80%), lượng lại thải trừ qua mật phân T1/2 khoảng kéo dài suy gan, bệnh nhân xơ gan - giờ.Vì vậy, cần xem xét hiệu chỉnh liều cho bệnh nhân suy gan [1,2,14,20] * Chỉ định - Loét dày - tá tràng - Bệnh trào ngược dày - thực quản - Hội chứng tăng tiết acid (hội chứng Zollinger Ellison) - Dự phòng loét dày - tá tràng dùng thuốc chống viêm không steroid, stress [1,2,20] 1.1.4 Một số chế phẩm thị trường Các chế phẩm có chứa PAN thị trường chủ yếu dạng: bột pha tiêm truyền tĩnh mạch, viên nang tan ruột hàm lượng 40mg [1] Ngoài số dạng viên nén, viên giải phóng kéo dài đáp ứng nhu cầu đa dạng người sử dụng Một số chế phẩm chứa PAN thị trường trình bày cụ thể bảng 1.1 [19] Bảng 1.1: Một số chế phẩm PAN thị trường STT Dạng bào chế Viên nén bao tan ruột Bột đông khô pha tiêm Tên biệt dược H/lượng Nhà sản xuất Bio-panto 40mg Biodeal Laboratories Hasanloc 40mg Hasan- Dermapharm Pantoloc 40mg Nycomed Pantostad 40mg STADA- VN J.V SP Extream 40mg Shinpoong Daewoo Sozol 40mg Atlantic Pharma Pantoloc 40mg Nycomed Pantosec 40mg Cipla 31 Bảng 3.4: Kết thẩm định độ đúng, độ xác ngày Mẫu LQC (90,0 ng/mL) Tỷ số Độ MQC (1800,1 ng/mL) Tỷ số Độ HQC (3500,2 ng/mL) Tỷ số Nồng độ(a) diện Nồng độ(a) diện Nồng độ(a) (b) (b) đúng (ng/mL) tích pic (ng/mL) tích pic (ng/mL) (%) (%) PAN/IS PAN/IS PAN/IS diện tích pic Độ đúng(b) (%) 0,044 89,5 99,4 0,843 1706,8 94,8 1,597 3232,0 92,3 0,048 98,3 109,2 0,851 1722,1 95,6 1,607 3252,7 92,9 0,043 86,7 96,3 0,828 1675,9 93,1 1,586 3211,2 91,7 0,044 88,8 98,6 0,852 1724,3 95,8 1,608 3254,4 92,9 0,043 87,3 97,0 0.851 1722,2 95,6 1,605 3250,2 92,8 0,040 82,5 91,6 0,845 1710,7 95,0 1,651 3342,4 95,5 88,9 98,7 1710,3 95,0 3257,1 93,0 TB CV (%) 5,4 1,0 (a) tính từ phương trình hồi qui, (b) % so với nồng độ thực Kết cho thấy, phương pháp định lượng có độ nằm khoảng 91,6 – 109,2%, độ lệch nằm giới hạn cho phép ± 15%, độ lặp lại ngày với giá trị CV% nhỏ (1,0 – 5,4%), đáp ứng yêu cầu độ đúng, xác phương pháp phân tích dịch sinh học 3.2.4.2 Độ đúng, độ xác khác ngày Tiến hành phân tích mẫu LQC, MQC, HQC chuẩn bị tương tự xác định độ đúng, độ lặp lại ngày theo phương pháp xây dựng ngày khác Xác định nồng độ PAN mẫu QC dựa vào đường chuẩn tiến hành song song ngày Kết xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày phương pháp trình bày bảng 3.5 1,3 32 Bảng 3.5: Kết thẩm định độ đúng, độ xác khác ngày LQC ( 90 ng/mL) Ngày MQC ( 1800 ng/mL) HQC ( 3500 ng/mL) Nồng độ(a) Độ đúng(b) Nồng độ(a) Độ đúng(b) Nồng độ(a) Độ đúng(b) (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) 89,5 99,4 1706,8 94,8 3232,0 92,3 98,3 109,2 1722,1 95,6 3252,7 92,9 86,7 96,4 1675,9 93,1 3211,2 91,7 88,8 98,7 1724,3 95,8 3254,4 92,9 87,3 97,0 1722,2 95,6 3250,2 92,8 82,5 91,6 1710,7 95,0 3342,4 95,5 80,2 89,1 1849,2 102,6 3524,3 100,6 84,1 93,4 1818,9 101,0 3573,3 102,0 81,6 90,7 1804,3 100,2 3501,3 100,0 77,2 85,8 1776,3 98,6 3364,2 96,0 83,8 93,1 1835,2 101,9 3516,3 100,4 86,9 96,5 1859,1 103,2 3488,6 99,6 86,1 95,7 1774,8 98,6 3421,7 97,7 86,1 95,7 1727,6 96,0 3402,8 97,2 86,1 95,7 1760,2 97,8 3434,3 98,1 85,5 95,0 1803,0 100,1 3297,4 94,2 87,2 96,9 1752,4 97,3 3483,3 99,5 85,9 95,4 1759,0 97,7 3418,2 97,6 I II III TB 95,3 98,1 96,7 CV (%) 5,0 3,0 3,4 (a) tính từ phương trình hồi qui, (b) % so với nồng độ thực Kết thực nghiệm cho thấy nồng độ (90, 1800, 3500 ng/mL), phương pháp cho độ khoảng 85% đến 115%, độ lặp lại khác ngày với giá trị CV ≤ 15% (3,0 – 5,0%) chứng tỏ phương pháp nghiên cứu có độ đúng, độ xác cao, đáp ứng yêu cầu phương pháp dùng dịch sinh học 33 3.2.5 Tỷ lệ thu hồi phương pháp 3.2.5.1 Tỷ lệ thu hồi nội chuẩn Xử lý lô mẫu QC theo qui trình lựa chọn Tiến hành phân tích xác định diện tích pic IS huyết tương Song song, xác định diện tích pic IS mẫu chuẩn pha dung môi pha mẫu (không qua xử lý) Kết xác định tỷ lệ thu hồi IS trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6: Kết thẩm định tỷ lệ thu hồi IS Đáp ứng IS/huyết tương Đáp ứng IS/pha động (mAU.s) (mAU.s) 219153 138029 215987 137641 221362 137809 225837 140936 225289 140712 228284 138874 222756 142224 221527 139068 226001 142448 10 217320 139726 11 214449 143592 12 218248 143690 13 203578 139516 14 214774 139907 15 219806 139659 16 211146 141115 17 204469 140374 18 219947 139338 TB 218330 140259 CV (%) 3,1 1,3 STT Tỷ lệ thu hồi * 99,1 (*): Giá trị hiệu chỉnh theo hệ số pha loãng Kết thực nghiệm cho thấy, tỷ lệ thu hồi nội chuẩn đạt 99,1% (thỏa mãn điều kiện nằm khoảng 30 – 110%) CV nồng độ IS ≤ 15% 34 (3,1 1,3%) Do qui trình xử lý mẫu huyết tương nghiên cứu phù hợp để chiết tách chất nội chuẩn 3.2.5.2 Tỷ lệ thu hồi PAN Chuẩn bị lô mẫu QC mục 2.3.1 xử lý mẫu chuẩn PAN pha huyết tương theo phương pháp xây dựng Tiến hành sắc ký, xác định nồng độ PAN có mẫu Song song, định lượng mẫu chuẩn pha dung môi pha mẫu (không qua xử lý) Kết xác định tỷ lệ thu hồi PAN trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7: Kết thẩm định tỷ lệ thu hồi PAN Đáp ứng PAN (mAu.s) STT LQC (≈ 90 ng/mL) MQC (≈ 1800 ng/mL) HQC (≈ 3500 ng/mL) Huyết tương Pha động Huyết tương Pha động Huyết tương Pha động 9614 6664 187772 132853 325013 257581 10415 6742 188414 133227 345086 256564 9409 6785 187056 132899 348659 257966 9830 6848 185064 132993 339432 257805 9639 6665 182395 132449 328273 256979 9224 6787 184390 133243 363146 258886 TB 9689 6749 185849 132944 341602 257630 4,3 1,1 1,2 0,2 4,1 0,3 CV(%) Tỷ lệ thu hồi * (%) 91,4 89,0 84,4 (*): Giá trị hiệu chỉnh theo hệ số pha loãng Kết thực nghiệm cho thấy khoảng nồng độ (90, 1800, 3500 ng/mL), phương pháp cho hiệu suất chiết nằm khoảng 30 – 110% ( 91,4; 89,0; 84,4%), giá trị CV nồng độ PAN ≤ 15% (từ 0,2 – 4,3%) Do phương pháp xử lý mẫu xây dựng phù hợp để chiết tách PAN từ huyết tương 35 3.2.6 Độ ổn định 3.2.6.1 Độ ổn định dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn nhiệt độ phòng Pha dung dịch nội chuẩn gốc mục 2.3.1 tiến hành mục 2.3.3.7 Kết độ ổn định dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn nhiệt độ phòng trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8: Độ ổn định dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn Mẫu Đáp ứng IS ban đầu Đáp ứng IS sau 743160 738252 740169 750460 738216 750764 TB 740515 746492 CV (%) 0,3 1,0 Độ lệch so với ban đầu 0,8 Kết cho thấy, nồng độ dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn nhiệt độ phòng lệch so với nồng độ ban đầu 0,8% (< 2%), có CV 0,3%, 1,0 % ([...]... các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic Có 4 phương pháp thường được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn và phương pháp chuẩn hóa diện tích Do đặc điểm của nền mẫu huyết tương có chứa nhiều thành phần khác nhau nên các phương pháp định lượng hoạt chất trong. .. Tuy nhiên, phương pháp định lượng bằng HPLC vẫn được nhiều nghiên cứu sử dụng nhất do có nhiều ưu điểm Một số phương pháp định lượng PAN trong huyết tương bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.2 Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng PAN trong dịch sinh học Điều kiện sắc ký PP Mẫu 1 Huyết [17] tương chó 2 [6] Huyết tương người Xử lý mẫu Tủa protein IS Omeprazol bằng acetonitril Tủa protein bằng acetonitrilmethanol=...4 PMS -Pantoprazol 40mg Pharmascience Inc 3 Viên nén GPKD Proton-P 40 mg Aristopharma 4 Viên nén Nolpaza 40mg KRKA 1.1.5 Một số phương pháp định lượng pantoprazol trong dịch sinh học Hiện nay, định lượng PAN nguyên liệu có thể sử dụng phương pháp đo quang hoặc phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Định lượng PAN trong dịch sinh học có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như HPLC,... PAN, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng PAN trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS có sử dụng chất nội chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp phân tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm nghiệm của Việt Nam 1.2 TỔNG QUAN VỀ HPLC VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 1.2.1... định điều kiện sắc ký Khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC Shimadzu detector UV-VIS, với các điều kiện sắc ký khác nhau như: 15 - Lựa chọn bước sóng phát hiện - Lựa chọn cột sắc ký - Lựa chọn pha động - Lựa chọn tốc độ dòng - Lựa chọn chất nội chuẩn Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng PAN trong huyết tương bằng phương. .. Bình định mức, pipet class A Prolabo, Pháp 13 Hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC - Shimadzu gồm: Interface CBM - 2A; bơm cao áp LC - 20AT; bộ phận tiêm mẫu tự động SIL - 20AC; Detector DAD SPD M20A; buồng ổn nhiệt cột CTO - 20A; phần mềm điều khiển và xử lý kết quả LC Solution Shimadzu 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol trong huyết tương bằng HPLC: lựa chọn phương pháp. .. chiều cao ) pic của chất thử trên diện tích ( chiều cao ) pic của chất nội chuẩn rồi dựa vào đường chuẩn tìm nồng độ của chất thử [4,5] 1.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học 1.2.2.1 Khái niệm Thẩm định một phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp. .. định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15% 19 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ - Giá trị trung bình, độ đúng, độ lệch chuẩn tương đối, phương trình hồi quy, hệ số tương quan hồi quy xác định bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 - Nồng độ của PAN trong huyết tương được xác định dựa vào phương trình hồi quy biểu diễn mối tương quan giữa tỉ lệ diện tích pic và nồng độ của mỗi chất được xây dựng trong. .. chọn phương pháp chiết lỏng- lỏng với dung môi TBME để xử lý mẫu Sắc ký đồ chuẩn PAN và IS trong huyết tương được chiết bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung môi TBME được trình bày ở hình 3.10 sau: 26 Pantoprazol/ 5.430 mAU 70 290nm,4nm (1.00) 60 50 IS/8.796 40 30 20 10 0 -10 0.0 2.5 5.0 7.5 min Hình 3.10: SKĐ mẫu chuẩn PAN (4000 ng/ml) và IS 3.1.3 Qui trình phân tích pantoprazol trong huyết tương. .. tương bằng phương pháp HPLC với detector DAD 2.3.2.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lí mẫu, chiết tách PAN từ huyết tương trên các mẫu chuẩn PAN hòa tan trong huyết tương trắng bằng các phương pháp như: - Tủa protein với các tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ như: MeOH, MeCN, acid perclorid - Chiết lỏng - lỏng với các dung