Thẩm định phương pháp định lượng đồng trong huyết tương bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử tại bệnh viện nhi trung ương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG PHẠM THU HIỀN H P THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG KỸ THUẬT QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ U TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG H LUẬN VĂN LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601 HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG PHẠM THU HIỀN H P THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG TRONG HUYẾT TƯƠNG U BẰNG KỸ THUẬT QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG H LUẬN VĂN LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: TS TRẦN THỊ CHI MAI TS BÙI THỊ NGỌC HÀ HÀ NỘI - 2022 H P H U i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương Đồng 1.1.1 Nguồn gốc, vai trò, hấp thu phân bố đồng thể 1.1.2 Các bệnh lý rối loạn chuyển hóa đồng thường gặp 1.1.3 Xét nghiệm đồng huyết tương 1.2 Các phương pháp định lượng đồng dịch sinh học 1.2.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử H P 1.2.2 Ứng dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện định lượng Đồng mẫu sinh học 1.3 Thẩm định phương pháp 1.3.1 Khái niệm thẩm định phương pháp 1.3.2 Nội dung thẩm định phương pháp 1.4 So sánh phương pháp xét nghiệm U 1.4.1 Mẫu bệnh phẩm và thời gian thực hiện thử nghiệm 1.4.2 Các phương pháp phân tích liệu H 1.5 Tình hình nghiên cứu và ngoài nước 1.5.1 Trên thế giới 1.5.2 Tại Việt Nam CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Thời gian nghiên cứu 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 2.2 Chất liệu nghiên cứu 2.2.1 Trang thiết bị hóa chất 2.2.2 Chất liệu nghiên cứu 2.3 Nguyên lý quy trình kỹ thuật phương pháp định lượng đồng huyết tương ii 2.3.1 Nguyên lý kỹ thuật phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lị điện 2.3.2 Quy trình kỹ thuật định lượng đồng huyết tương phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện 2.4 Thiết kế nghiên cứu 2.4.1 Thẩm định phương pháp định lượng Đồng máu quang phổ hấp thụ nguyên tử 2.4.2 So sánh độ tương đồng kết định lượng đồng huyết tương phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với phương pháp đo màu 2.5 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu H P 2.6 Biến số nghiên cứu 2.7 Kỹ thuật công cụ thu thập thông tin 2.8 Sai số khống chế sai số 2.9 Quản lý phân tích số liệu 2.10 Đạo đức nghiên cứu U CHƯƠNG DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thẩm định phương pháp định lượng Đồng máu phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử H 3.1.1 Giới hạn trắng, giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp 3.1.2 Khoảng tuyến tính phương pháp 3.1.3 Độ chụm phương pháp 3.2.4 Độ phương pháp 3.2 Kết so sánh phương pháp TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích đồng mẫu sinh học .10 Bảng 2.1 Bảng thiết kế thử nghiệm cách xác định độ chụm .29 Bảng 2.2 Độ lệch chuẩn tương đối cho phép độ chụmtùy theo mức nồng độ .29 Bảng 2.3 Cách xác định độ 30 Bảng 2.4 Tiêu chuẩn độ thu hồi cho phép mức nồng độ khác 31 Bảng 3.1 Kết xác định LOB, LOD LOQ phương pháp 34 Bảng 3.2 Đánh giá khoảng tuyến tính phương pháp 34 Bảng 3.3 Đánh giá độ chụm phương pháp 35 Bảng 3.4 Độ thu hồi mẫu QC 36 Bảng 3.5 Độ thu hồi mẫu thêm chuẩn 37 H P H U iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Các biểu bệnh nhân Wilson .6 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn kết đánh giá khoảng tuyến tính phương pháp 35 Hình 3.2 Độ thu hồi mẫu QC 36 Hình 3.3 Biểu đồ khác biệt so sánh kết định lượng đồng huyết tương hai phương pháp 38 Hình 3.4 Biểu đồ Passing- Bablock so sánh kết định lượng đồng huyết tương hai phương pháp 40 H P H U v TÓM TẮT Định lượng đồng huyết tương xét nghiệm hỗ trợ chẩn đoán thiếu hụt đồng, ngộ độc đồng, bệnh lý di truyền liên quan đến rối loạn chuyển hóa đồng Đề tài tiến hành với hai mục tiêu: 1) Đánh giá phương pháp định lượng đồng huyết tương kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện máy AA-7000 Shimadzu 2) So sánh độ tương đồng kết định lượng đồng huyết tương phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với phương pháp đo màu Nghiên cứu thực nghiệm phòng xét nghiệm với chất liệu nghiên cứu là mẫu chứng Whole blood control - ClinCheck mức Recipe và 40 mẫu huyết H P tương bệnh nhân Tiến hành các thực nghiệm đánh giá giới hạn trắng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính, độ chụm độ xác của phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử và thực nghiệm so sánh độ tương đồng kết định lượng đồng huyết tương phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với phương pháp đo màu theo các hướng dẫn của CLSI Số liệu được thu U thập và xử lý excel và phần mềm Method validator Philip Marquez Giới hạn trắng LOB, giới hạn phát LOD và giới hạn định lượng LOQ xác định 0,44; 1,06 và 2,0 µmol/L Khoảng tuyến tính phương H pháp - 50 µmol/L Độ lặp lại độ tái lặp đạt tiêu chuẩn AOAC Độ thu hồi mẫu QC mức nồng độ độ thu hồi mẫu thật thêm chất chuẩn đạt tiêu chuẩn AOAC Kết quả so sánh phương pháp hai máy AA7000 AU5800 phương pháp đồ thị khác biệt Altman- Bland phương pháp phân tích hồi quy Passing- Babloc cho thấy hai phương pháp không tương đồng, nhiên kết quả xét nghiệm giữa máy có mối tương quan chặt với phương trình tương quan y = 0,947x + 0,046, hệ số tương quan r = 0,996 Phương pháp định lượng đồng huyết tương quang phổ hấp thụ nguyên tử áp dụng thực hành thường quy ĐẶT VẤN ĐỀ Đồng nguyên tố vi lượng cần thiết cho hoạt động quan trình trao đổi chất người Trong thể, đồng tồn chủ yếu gan, phần thận, mắt, não số quan khác Trong máu phần lớn đồng tồn dạng ceruloplasmin phần lại gắn với protein máu, phần nhỏ đồng tồn trạng thái tự Đồng cofactor nhiều loại enzym, có vai trị quan trọng thể điều hịa chuyển hóa sắt, hình thành mơ liên kết, sản sinh lượng mức độ tế bào sản xuất melanin (- sắc tố tạo màu da)(1) Đồng bổ sung vào thể thông qua chế độ ăn uống, hấp thu ruột non gan đào thải lượng dư thừa qua đường mật xuống ruột, để đào thải qua H P phân phần nhỏ đào thải qua nước tiểu Cơ thể ln có chế đảm bảo trì nồng độ đồng máu cân phù hợp Tuy nhiên thay đổi bất thường chế độ dinh dưỡng biến đổi chức protein chuyển hóa tác động đến q trình hấp thu, điều hòa, đào thải đồng thể dấn đến bệnh lý thiếu hụt dư thừa thể U Hai bệnh di truyền liên quan đến rối loạn chuyển hóa đồng thường gặp người bệnh Menkes bệnh Wilson Bệnh Menkes hay gọi hội chứng tóc dị thường Menkes, bệnh rối loạn di truyền gặp liên quan đến thiếu hụt H đồng Các biểu bệnh bao gồm tóc thưa, màu đỏ hoe, dễ gãy chậm phát triển, suy giảm hệ thần kinh yếu co giật, gây chết bệnh nhân 10 tuổi(2) Ngược lại, Wilson bệnh gây nên ứ đọng dư thừa đồng nhiều quan với biểu lâm sàng đa dạng thường gặp tổn thương gan, não mắt(1) Định lượng đồng huyết tương xét nghiệm hỗ trợ chẩn đoán thiếu hụt đồng, ngộ độc đồng, bệnh lý di truyền liên quan đến rối loạn chuyển hóa đồng Để định lượng đồng mẫu dịch sinh học, có nhiều phương pháp áp dụng như: phương pháp đo màu, phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), phương pháp khối phổ cảm ứng plasma (ICP-MS), phương pháp quang phổ phát xạ cảm ứng plasma (ICP-OES) Giá trị sử dụng tính xác phương pháp khác nhau, phương pháp phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) phương pháp hay dùng phòng xét nghiệm lâm sàng giới Tuy nhiên Việt Nam phương pháp sử dụng phòng xét nghiệm bệnh viện hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử ứng dụng chủ yếu phân tích kim loại- xét nghiệm khơng làm thường quy phịng xét nghiệm thơng thường Hơn nữa, phương pháp phân tích kim loại máy quang phổ hấp thụ nguyên tử phương pháp thương mại thị trường, đòi hỏi phòng xét nghiệm phải tự phát triển phương pháp, yêu cầu nhân lực cần đào tạo chuyên sâu Theo hiểu biết chúng tôi, Việt Nam chưa có phịng xét nghiệm lâm sàng thực xét nghiệm định lượng đồng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Hiện tại, khoa Hóa sinh- Bệnh viện Nhi Trung ương định lượng đồng huyết tương phương pháp đo màu máy hóa sinh tự động Phương H P pháp có ưu điểm đơn giản, tự động hóa hoàn toàn, thời gian trả kết nhanh; nhiên hạn chế độ lặp lại không tốt, gây trường hợp kết cao giả tạo Do khoa xây dựng quy trình định lượng đờng huyết tương phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Phương pháp dựa nguyên lý hấp thụ lượng đồng tự trạng thái chiếu chùm U tia xạ qua đám đồng mơi trường hấp thụ Để đưa phương pháp vào thực hành thường quy, cần tiến hành thẩm định xác định thông số kỹ thuật, so sánh với phương pháp đo quang sử dụng H 56 11 Ortner HM, Bulska E, Rohr U, Schlemmer G, Weinbruch S, Welz B Modifiers and coatings in graphite furnace atomic absorption spectrometry - mechanisms of action (A tutorial review) Spectrochimica Acta Part B 2002;57:1835-1853 12 Carey RN, George H, Hartmann AE, et al User Demonstration of Performance for Precision and Accuracy; Approved Guideline CLSI document EP15-A Vol 21 No 25 Philadelphia, PA: Clinical Laboratory Standard Institute; 2005 13 Thẩm Định Phương Pháp Trong Phân Tích Hóa Học & Vi Sinh Vật (NXB Khoa Học Kỹ Thuật 2010) - Ds Trần Cao Sơn, 103 Trang.pdf Accessed April 27, 2021 14 Westgard JO Basic method validation 3rd edition Westgard QC, Inc; 2009 H P 15 Clinical Laboratory Standard Institute User verification of performance for precision and trueness Approved guideline, 2nd edition, CLSI document EP15-A2 2005;25(17) 16 Tholen DW, Kroll M, Astles JR, et al Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures: A statistical approache; Approved U guideline CLSI document EP06-A Vol.23 No.16 Philadelphia, PA: Clinical Laboratory Standard Institute; 2003 17 Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN H 6910-5: 2002 (ISO 5725-5: 1998), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo - Phần 5: Các phương pháp khác xác định độ chụm phương pháp đo tiêu chuẩn Hà Nội: Bộ Khoa học Công nghệ; 2002 18 Carey RN, Middle JG, Durham AP, et al User verification of Precision and Estimation of Bias; Approved guideline 3rd edition, CLSI document EP15A3, Vol.34 No.12 Philadelphia, PA: Clinical Laboratory Standard Institute; 2014 19 Trần Thị Chi Mai Thẩm định phương pháp phòng xét nghiệm y khoa Tạp chí Y học Việt Nam 2018; Tập 470 (Số chuyên đề): 18-28 20 Jame O Westgard Basic method validation Westgard Quality Corporation 1999: 91- 102 57 21 Philippe Marquis, Service de biochimie Centre hospitalier, Metz – France Comparison of analytical methods in clinical chemistry 22 Budd JR, Durham AP, Gwise TE, et al Measurement procedure comparison and bias estimation using patient samples; Approved guideline 3rd edition, CLSI document EP09-A3, Vol.33 No.11 Philadelphia, PA: Clinical Laboratory Standard Institute; 2010 23 The Comparison of Methods Experiment - Westgard , accessed: 04/05/2021 24 Park J., Lee S., Kim Y cộng (2018) Comparison of Four Automated Carcinoembryonic Antigen Immunoassays: ADVIA Centaur XP, H P ARCHITECT I2000sr, Elecsys E170, and Unicel Dxi800 Ann Lab Med, 38(4), 355-361 25 Statistical analysis in method comparison studies part one , accessed: 04/05/2021 U 26 Linnet K Evaluation of regression procedures for methods comparison studies Clin Chem 1993; 39: 424- 432 27 Burd E.M (2010) Validation of Laboratory-Developed Molecular Assays for H Infectious Diseases Clin Microbiol Rev, 23(3), 550-576 28 National Committee for Clinical Laboratory Standard Method comparison and bias estimation using patient samples, approved guideline, second edition NCCLS publication EP9-A2 Volume 22, Number 19 29 Deming W.E (1943), Statistical adjustment of data, Wiley, Oxford, England 30 CLSI EP09-A3 - Measurement Procedure Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved Guideline - Third Edition , accessed: 12/05/2021 31 Bablock W, Passing H Application of statistical procedures in analytical instruments testing J Automat Chem 1985; 7: 74- 79 32 Passing H, Bablock W A new biometrical procedure for testing the equality of measurements from two different analytical methods Application of linear 58 regression procedures for method comparison studies in clinical chemistry, Part I J Clin Chem Biochem 1983, 21: 709- 720 33 Passing H, Bablock W et al A general regression procedure for method transformation Application of linear regression procedures for method comparison studies in clinical chemistry, Part III J Clin Chem Biochem 1988, 26: 783- 790 34 Z Ouyang, Z Chen, H Mou (2010) Determination of copper by Flame Atomic Absorption Spectrometry using Flow Injection On-line Preconcentration with Double Micro-columns Reviews in Analytical Chemistry pub.1019098065 35 Harvey Spector, Sheldon Glusman, Peter Jatlow (1970) “Direct determination H P of copper in urine by atomic absorption spectrophotometry.” 36 Arthur F Ward, Douglas G Mitchell, Murray Kahl (1974) Determination of Copper in Plasma and Serum by Use of a Microsampling Cup in Atomic Absorption Spectrometry Clinical Chemistry, Volume 20, Issue 9, 1199–1203, U Pages 37 N B Roberts, D Fairclough, S McLoughlin (1985) Measurement of copper, zinc and magnesium in serum and urine by DC plasma emission spectrometry Ann Clin Biochem.( Pt 5):533-8 38 Direct H determination of copper in urine by atomic absorption spectrophotometry :Harvey Spector, Sheldon Glusman, Peter Jatlow (1970) 39 Nguyễn Thị Minh Hạnh, Trần Thị Chi Mai, Nguyễn Thị Huệ, Phạm Thu Hiền Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng chì máu phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Tạp Chí Nghiên Cứu Học 2020;4(128):10–8 40 Lê Kim Dung Thẩm định phương pháp định lượng đồng niệu máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Shimadzu 7000 Khóa luận tốt nghiệp; 2017 41 Clinical and laboratory standards institute Verification of comparability of patient result within one health care system, approved guideline CLSI document C54-A 2010 Volume 28 Number 19 59 42 Ward AF, Mitchell DG, Kahl M and Aldous KM Determination of copper in plasma and serum by use of a microsampling cup in atomic absorption spectrometry Clin Chem 1974 20(9):1199–203 43 Tan M, Sudjadi, Astuti, Rohman Validation and quantitative analysis of cadmium, chromium, copper, nickel, and lead in snake fruit by Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy J Appl Pharm Sci 2018 2018;8(2):044–8 44 Ramos NC, Lamorena RB Detection of copper, cadmium, manganese, lead and zinc content in milled rice using microwave plasma atomic emission spectroscopy Philipine J Sci 2021;150(4):765–76 H P 45 RobeLourt NB, Faircluogh D, McLoughlin S and Taylor WH Measurement of copper, zinc and magnesium in serum and urine by DC plasma emission spectrometry Ann Clin Biochem 1985;22:533–8 46 Jeffrey M Beckett jbeckett@utas.edu.au, Thomas F Hartley, and Madeleine J Bal Evaluation of the Randox colorimetric serum copper and zinc assays U against atomic absorption spectroscopy Ann Clin Biochem Int J Lab Med 2009;46(4) 47 Roger Johnson Assessment of bias with emphasis on method comparison H Clin Biochem Rev 2008;37–42 48 Najib Aziz, Micheal R Irwin, Sally S Dickerson, Anthony W Butch Interpreting method comparison studies by use of the Bland- Altman plot: Reflecting the importance of sample size by incorporating confidence limits and predefined error limits in the graphic Clin Chem 2004;50(11):2216-2218 49 Lidija Bili-Zulle Comparison of methods : Passing and Bablok regression Biochem Medica 2011;21(12):49–52 60 H P H U 61 H P H U 62 H P H U 63 H P H U 64 H P H U 65 H P H U 66 H P H U 67 H P H U 68 H P H U 69 H P H U 70 H P H U