Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng rubiadin trong dược liệu ba kích bằng HPLC

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài“Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng rubiadin trong dược liệu Ba kích bằng HPLC”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực của bả

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài“Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương

pháp định lượng rubiadin trong dược liệu Ba kích bằng HPLC”, ngoài sự làm

việc nghiêm túc, nỗ lực của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Dược liệu, thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Viện Dược liệu đã tạo rất nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS.Tống Thị Thanh Vượng – GV Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã đóng góp ý kiến, tận tình sửa chữa giúp em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Lê Thị Kim Vân – Khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược liệu, người đã tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược liệu đã hỗ trợ em trong quá trình nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy em suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2017

Nguyễn Thị Lê

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN DƯỢC LIỆU BA KÍCH 2

1.1 Ba kích 2

1.1.1 Tên khoa học 2

1.1.2 Mô tả 2

1.1.3 Bộ phận dùng 2

1.1.4 Nơi sống và thu hái 2

1.1.5 Thành phần hóa học 3

1.1.6 Tác dụng dược lý 5

1.2 Tình hình nghiên cứu đánh giá Dược liệu Ba kích 7

1.2.1 Tiêu chuẩn Dược điển 8

1.2.2 Tại Việt Nam 11

1.2.3 Trên thế giới 11

1.3 Rubiadin 13

1.3.1 Công thức cấu tạo 13

1.3.2 Tác dụng dược lý 13

1.3.3 Sự phân bố rubiadin trong chi Morinda 14

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất 16

2.3 Nội dung nghiên cứu 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Định tính các nhóm chất hóa học 17

2.4.2 Xác định hàm lượng anthranoid toàn phần trong Ba kích bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 20

2.4.3 Xác định hàm lượng rubiadin bằng phương pháp HPLC 21

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Xác định sự có mặt của một số nhóm chất trong Ba kích và một số hoạt

chất nhóm anthranoid 27

3.1.1 Kết quả xác định một số nhóm chất bằng phản ứng hóa học 27

3.1.2 Xác định sự có mặt của một số hoạt chất nhóm anthranoid bằng TLC 28 3.2 Xác định hàm lượng anthranoid toàn phần trong Ba kích 30

3.2.1 Chuẩn bị dung dịch sắc ký 30

3.2.2 Xây dựng đường chuẩn 30

3.2.3 Xác định hàm lượng anthranoid toàn phần 31

3.3 Xác định hàm lượng rubiadin trong Ba kích bằng HPLC 31

3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký và chuẩn bị các dung dịch sắc ký 31

3.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng rubiadin trong Ba kích theo AOAC 36 3.3.3 Xác định hàm lượng Rubiadin trong Ba kích 42

3.4 Bàn luận 43

3.4.1 Mẫu nghiên cứu 43

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 44

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2 AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (Association of

analytical chemists)

3 BHC Benzene hexachloride (C6H6C6)

4 DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector)

5 DDT Dichloro diphenyl trichlorothane (C14H9C15)

9 LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

10 LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Qualification)

13 RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relactive Standard

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Kết quả định tính một số nhóm chất trong Ba kích 27

3.3 Độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn rubiadin 30 3.4 Hàm lượng anthranoid toàn phần của các mẫu thử tính theo

rubiadin

31

3.5 So sánh hàm lượng rubiadin khi chiết ở nồng độ EtOH khác nhau 31 3.6 So sánh hàm lượng rubiadin khi chiết trong thời gian khác nhau 32

3.9 Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký 38

3.12 Kết quả xác định khả năng thu hồi của phương pháp 41

3.14 Kết quả định lượng rubiadin trong các mẫu thử 43 3.15 Tỉ lệrubiadin so với anthranoid toàn phần tính theo chuẩn rubiadin 43

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

3.2 Đồ thị tương quan giữa nồng độ chuẩn rubiadin và độ hấp thụ 30 3.3 SKĐ rubiadin chuẩn với pha động MeOH:H3PO4 0,1% (85:15) 33 3.4 SKĐ rubiadin chuẩn với pha động MeOH:H3PO4 0,1% (80:20) 33 3.5 SKĐrubiadin chuẩn pha loãng trog dịch chiết dược liệu với pha

3.12 Đồ thị tương quan giữa diện tích pic và nồng độ 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ba kích là một loại dược liệu quý trong y học cổ truyền Rễ Ba kích được sử dụng rộng rãi với mục đích ôn thận, tráng dương, kiện cân cốt, khử phong và hàn thấp Nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của dịch chiết rễ Ba kích đã được tiến hành, chứng minh tác dụng chống viêm, chống loãng xương, điều hòa đường huyết, giảm huyết áp

Ở Việt Nam, Ba kíchphân bố rộng rãi ở các tỉnh phía Bắc, đặc biệt là Quảng Ninh Trong những năm gần đây, Quảng Ninh đã chủ trương phát triển Ba kích trở thành dược liệu đặc trưng của tỉnh: mở rộng khu vực trồng Ba kích và phát triển các thương phẩm Ba kích Tuy nhiên hiện nay trên thị trường dược liệu, Ba kích có rất nhiều nguồn như: Ba kích nhập từ Trung Quốc, Ba kích Quảng Ninh, Ba kích Bắc Cạn , rất khó để kiểm soát chất lượng dược liệu

Với mong muốn tìm hiểu về chất lượng dược liệu Ba kích, chúng tôi tiến hành

đề tài: “Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng rubiadin

trong dược liệu Ba kích bằng HPLC” Đề tài được thực hiện với mục tiêu:

- Xây dựng phương pháp định lượng rubiadin trong Ba kích

- Sơ bộ xác định hàm lượng anthranoid toàn phần và hàm lượng rubiadin trong Ba kích

- So sánh hàm lượng rubiadin so với anthranoid toàn phần và rubiadin trong

Ba kích Quảng Ninh so với các mẫu Ba kích khác trên thị trường

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN DƯỢC LIỆU BA KÍCH

1.1.1 Tên khoa học

- Morinda officinalis How.,họ Cà Phê Rubiaceae [3][4][6]

- Tên khác: Ba kích thiên, dây ruột gà, chồi hoàng kim, sáy cày[3][4][6]

1.1.2 Mô tả

Ba kích là một loại cây thân thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn, dài hàng mét Thân non màu tím, có lông, sau nhẵn Cành non có cạnh, lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, cuống ngắn, lúc non có lông dày hơn ở mặt dưới, màu xanh lục, sau già lá ít lông hơn và có màu trắng mốc; lá kèm mỏng, ôm sát vào thân Hoa nhỏ, màu trắng sau hơi vàng, tập trung thành tán ở đầu cành; đài hoa hình chén hay hình ống gồm những lá đài nhỏ phát triển không đều; tràng hoa hàn liền ở phía dưới thành ống ngắn, nhị 4, bầu hạ Quả hình cầu, rời nhau hoặc dính liền thành khối, khi chín màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh Mùa hoa: tháng 5-6

Mùa quả: tháng 7-10 [3][4][6]

1.1.3 Bộ phận dùng

Bộ phận dùng: Rễ phơi hoặc sấy khô (Radix morindae) [3][4][6]

Đặc điểm: Rễ cong queo Thịt đứt thành từng đoạn, để lộ lõi nhỏ ở bên trong,

vỏ ngoài màu hồng nhạt, thịt màu hồng hay tím, trên mặt vỏ có nhiều vân dọc Cắt ngang thấy lớp vỏ ngoài rất mỏng, dính chặt vào thịt, thịt dày, giữa có lõi như lõi

sắn Lớp gỗ rắn chắc, màu vàng nâu hoặc vàng trắng, đường kính 1-5mm [3][4][6]

1.1.4 Nơi sống và thu hái

Mọc hoang ở ven rừng thứ sinh trung du và miền núi Gặp nhiều ở Quảng Ninh, Hà Tây, Ninh Bình, Vĩnh Phúc, Lạng Sơn, Hà Giang, Hòa Bình Có nhiều nơi như Quảng Ninh, Hà Tây, Vĩnh Phúc trồng để đảm bảo nhu cầu trong nước

[3][4][6]

Có thể đào rễ quanh năm, tốt nhất là vào mùa thu-đông, rửa sạch, cắt bỏ rễ

con, phơi sấy cho gần khô, dập dẹt rồi phơi sấy tiếp đến độ ẩm 13% [3][4][6] 1.1.5 Thành phần hóa học

a Thành phần hóa học

Theo nhiều nghiên cứu đã công bố, thành phần chính của Ba kích là anthranoid, iridoid và polysaccharide Ngoài ra Ba kích còn chứa một số thành phần

khác như: saponin, đường khử, acid hữu cơ [3][4][6]

1 Iridoid glycoside Trong rễ của cây Ba kích đã tìm thấy các iridoid

glycoside: asperulosid, monotropein, morofficinalosid, acid deacetyl asperulosidic, acid asperosidic, acelat apserulosid, morindolide

2 Anthranoid Các anthranoid phân lập được từ rễ cây Ba kích

khá đa dạng:1-hydroxy-methylanthraquinone; hydroxy-1-methoxyanthraquinone;rubiadin,physcion, 1,3-dihydroxy-2-methoxyanthraquinone; 3-hydroxy-2-methylanthraquimone, digiferruginol,lucidin w-ethyl ether; anthraquinone-2-carboxylic acid, rubiadin-1-methylether,…

2-3 Polysaccharide Một số polysaccharid được tìm thấy trong rễ cây

Ba kích như: nystose, fructofuranosylnystose, type hexasaccharide, inulin-type heptasaccharid, sucrose, inulin-type trisaccharid, inulotriose, inulotretrose, inulopentose, 1-ketose, arabinose,

inulin-galactose, galacturonic acid, acidic polysaccharide…

1.1.5.2 Nhóm anthranoid

 Đặc điểm[1]

nthraquinone cĩ nhĩm –OH ở vị trí α cĩ tính acid yanthraquinone cĩ –OH ở vị trí β

Các anthraquinone tan trong dung dịch NaOH, ca

hydrocarbonat

n chất 1,8-dihydroxy anthraquinone trong dung dphenolat cĩ màu đỏ, dưới UV (365nm) cho huỳnh quang tím ho

t oxyanthraquinone cĩ ít nhất một nhĩm OH magie acetat trong cồn Màu đậm nhạt phụ thuộc vào v

n chất 1,2-dihydroxy cho màu tím; 1,4-dihydroxy cho má tía, dihydroxy và 1,8-dihydroxy cho màu đỏ cam

nthraquinone đã phân lập được trong dược liệu Ba kích

c liệu Ba kích, thành này cĩ khung 9,10-anthraquinone

nh tính bằng phản ứng vi

ạng glycoside dễ tan

u cơ

i UV (365nm) cho huỳnh quang

cĩ tính acid yếu hơn

Ba kích

Cơng thức cấu tạo

methyl ether:

: C16H12O4 Tên khoa học: 3-hydroxy-1-methoxy-2-

9,10-dione

: C16H12O5 -Dihydroxy-3-methoxy-6-methyl-

Trong một nghiên cứu khác, khicho chuột uống dịch chiết nước Ba kích với liều 15-20g/kg cơ thể bằng đường uống trước khi tiêm NH4Cl thì thấy Ba kích có tác dụng tăng sức đề kháng chung của cơ thể với các yếu tố độc hại

 Từ kết quả của 2 thí nghiệm trên chứng tỏ Ba kích có tác dụng bồi bổ cơ

thể[18][41]

b Tác dụng trên nội tiết

Một nghiên cứu được tiến hành trên chuột cống đực cho thấyBa kích không có tác dụng kiểu androgen, nhưng có thể có khả năng tăng cường hiệu lực của androgen hoặc tăng cường quá trình chế tiết hoocmon androgen Ba kích làm tăng trọng lượng tinh hoàn, cơ nâng hậu môn và túi tinh còn trọng lượng tuyến tiền liệt

không thay đổi đáng kể[6][38]

c Tác dụng trên xương

Anthraquinon và polysaccharid có liên quan đến việc điều chỉnh cũng như

tăng cường sự hình thành xương, tăng sinh tế bào tạo xương in vivo, có tác dụng

trong ngăn ngừa và điều trị bệnh liên quan đến sự tiêu xương

Các polysaccharid: có tác dụng bảo vệ, chống mất xương, chống oxy hóa do tăng hoạt tính của các enzym chống oxy hóa của cơ thể, làm giảm lượng MDA (Malodialdehyd) trong chuột cống thử nghiệm So sánh với chuột được kiểm soát bình thường, Polysaccharid làm tăng sự xuất hiện của các gen như BMP-2, Cbfal, Rrankl, rOPG, rPPARγ2 mARN Các gen này đều đóng vai trò quan trọng trong sự

phát triển, trao đổi chất của xương và sụn [43][14][23][29

Ba hợp chất anthraquinone: 1, 3, 8-trihydroxy-methoxy-anthraquinone; hydroxy-1-methoxy-anthraquinone và rubiadin được chứng minh là có tác dụng bảo

2-vệ xương khi cắt bỏ buồng trứng ở chuột Chúng làm giảm các lỗ rò do tiêu xương, làm giảm lượng tế bào hủy xương đa nhân, ức chế tartrate resistant acid phosphates(TRAP), enzym cathepsin K, thụ thể calcitonin (CTR) và carbonic anhydrase II (CAII) là những thành phần đặc hiệu cho hoạt động của tế bào hủy xương Ngoài ra, ba hợp chất này còn có tác dụng chặn tín hiệu cho tế bào hủy xương của NK- B (nuclear factor kappa B) và JNK (c-Jun N-terminal inases) đồng

thời điều chỉnh tỉ lệ OPG/RANKL (Osteopro-tegerin / receptor activator of NF- B

ligand) của tế bào tạo xương [15][30]

d Tác dụng chống viêm

Thí nghiệm được tiến hành trên chuột cống trắng với mô hình gây phù bàn chân chuột bằng nhũ dịch kaolin 10%, Ba Kích được dùng với các liều lượng 5g, 10g và 20g/ kg cơ thể tiêm dưới da trước khi gây phù Kết quả cho thấy Ba kích có tác dụng chống viêm rõ rệt

e Hạ đường huyết và giảm stress

Dịch chiết cồn Ba Kích có tác dụng hạ đường huyết và giảm stress oxy hóa trên chuột cống đái tháo đường giúp ngăn ngừa các biến chứng của đái tháo đường

Ba Kích có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại stress oxy hóa trên tế bào Leydig TM3

gây bởi hydrogen peroxide[21][24][26].

Oligosaccharid: có tác dụng chống trầm cảm, chống tổn thương tế bào thần kinh do corticosteron, có rất nhiều thử nghiệm lâm sàng chứng minh viên nang oligosaccharid từ Ba kích có thể chữa trị chứng trầm cảm mức độ nhẹ và vừa, hiệu quả chữa trị tương đương với fluoxetin hydrochlorid, phản ứng phụ rất ít và nhẹ, có

thể áp dụng trong chữa trị chứng trầm cảm mức độ nhẹ và vừa [17]

Năm hợp chất có tác dụng chống trầm uất: acid succinic, nystose,

1-Ffructose-furanosylnystose, hexasaccarid và heptasaccarid [11]

f Tác dụng dự phòng thiếu máu cục bộ

Với cơ chế ngăn chặn quá trình tang calci quá mức và các gốc oxy tự do, Ba kích có vai trò dự phòng thiếu máu cục bộ Tác dụng này đã được chứng minh qua nghiên cứu quan sát ảnh hưởng của Ba Kích đối với tổn thương thiếu máu cục bộ -

tái tưới máu cơ tim chuột cống trắng16]

1.2.1 Tiêu chuẩn Dược điển

a Chuyên luận Ba Kích dược điển Việt Nam IV[5]

- Sắc ký lớp mỏng:

Bản mỏng: Silicagel G

Hệ dung môi khai triển: Ether dầu: ethylacetat: acid acetic băng (7,5:2,5:0,25) Dung dịch thử: Lấy khoảng 5 g dược liệu thêm 10 ml nước, lắc để nước thấm

đều dược liệu, để yên 15 phút, nghiền dược liệu trong cối sứ thành bột ướt, thêm 40

ml MeOH, cho vào bình cầu miệng mài, đun sôi hồi lưu trên cách thủy trong 30 phút, lọc, làm bay hơi dung môi đến cạn Thêm 5 ml nước và 20 ml ether dầu hỏa, lắc khoảng 3 - 5 phút, để lắng, gạn lấy phần dịch chiết, làm bay hơi hết dung môi Hòa cắn trong 2 ml MeOH làm dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy 5 g dược liệu Ba kích (mẫu chuẩn) và tiến hành như

đối với dung dịch thử

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl dung dịch đối chiếu và

dung dịch đối chiếu Sau khi triển khai, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí, phun dung dịch kali hydroxyd trong EtOH Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết (2 - 3 vết) màu đỏ, cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu

- Độ ẩm: không quá 15%

- Tỷ lệ vụn nát: không quá 5%

- Tạp chất: không quá 1%

- Tỷ lệ dược liệu xơ, hóa gỗ, đường kính dưới 3mm: không được có

- Lượng chất gỗ: không nhiều hơn 35%

b Chuyên luận Ba Kích dược điển Trung Quốc[16]

- Định tính:

Cân 2,5g bột dược liệu, thêm 25ml EtOH, đun hồi lưu cách thủy trong 1 giờ,

để nguội, lọc Bốc hơi dung môi đến khi còn khoảng 1ml làm dung dịch thử Chuẩn

bị một dung dịch chuẩn đối chiếu với 2,5g bột dược liệu Ba kích chuẩn trong điều kiện tương tự như chuẩn bị dung dịch thử

Bản mỏng: Silicagel GF254

Dung môi khai triển: Toluen : ethylacetat : acid formic (8:2:0,1)

Tiến hành chấm riêng biệt lên bản mỏng 10µl dung dịch chuẩn và dung dịch thử Sau khi khai triển sắc ký, sấy khô, kiểm tra các vết dưới đèn tử ngoại 254nm Mẫu thử phải có các vết với vị trí và màu sắc tương tự như các vết có trong mẫu

chuẩn

- Độ ẩm: không quá 15%

- Tỷ lệ vụn nát: không quá 5%

- Tạp chất: không quá 1%

- Tỷ lệ dược liệu xơ, hóa gỗ, đường kính dưới 3mm: không được có

- Lượng chất gỗ: không nhiều hơn 35%

- Hàm lượng các kim loại:

+ Chì: không nhiều hơn 5 ppm

+ Arsen: không nhiều hơn 3 ppm

+ Cadimi: không nhiều quá 0,3 ppm

+ Sulfur dioxide: không quá 0,2 ppm

+ Thủy ngân: không quá 0,2 ppm

- Dư lượng thuốc trừ sâu: Tổng DDT: không quá 0,1 ppm, tổng BHC không quá 0,2 ppm, tổng aldrin không quá 0,01ppm, endrin: không quá 0,01ppm

- Tiêu chuẩn về hàm lượng nystose:

Điều kiện khai triển sắc ký:

c Chuyên luận Ba kích dược điển Hàn Quốc[22]

- Sắc ký bản mỏng:

Cân 2,0g bột dược liệu, thêm 15ml EtOH, đun hồi lưu cách thủy trong vòng 1 giờ, lọc Bốc hơi dung môi, thu cắn Hòa tan cắn trở lại bằng 1ml EtOH Dung dịch này được sử dụng làm dung dịch thử

Bản mỏng: Silicagel G

Hệ dung môi khai triển: hexan:ethylacetat (3:2)

Tiến hành chấm lên bản mỏng 10µl dung dịch thử, khai triển sắc ký Bản mỏng sau khi khai triển được làm khô trong không khí, hiện màu bằng acid sulfuric

và đốt ở 105oC trong 10 phút

Yêu cầu: Có vết màu tím xuất hiện ở giá trị Rf khoảng 0,6

- Lượng chất gỗ: không nhiều hơn 35%

- Hàm lượng các kim loại nặng:

+ Chì: không nhiều hơn 5 ppm

+ Arsen: không nhiều hơn 3 ppm

+ Cadimi: không nhiều quá 0,3 ppm

+ Thủy ngân: không quá 0,2 ppm

- Dư lượng thuốc trừ sâu:

+ Tổng DDT: không quá 0,1 ppm

+ Tổng BHC không quá 0,2 ppm

+ Tổng aldrin không quá 0,01ppm, endrin: không quá 0,01ppm, diedrin không quá 0,01ppm

- Sulfur dioxide không quá 30ppm

- Mất khối lượng do làm khô không quá 13%

- Hàm lượng tro không quá 6%

- Hàm lượng acid không tan không quá 1%

- Hiệu suất chiết với EtOH pha loãng kgoong nhở hơn 52%

1.2.2 Tại Việt Nam

Hiện tại ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu kiểm nghiệm Ba kích như: Nghiên cứu tiến hành đánh giá Ba kích tím ở Ba Chẽ, Quảng Ninh, bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cho Ba kích Quảng Ninh, tuy nhiên nghiên cứu này chỉ mới dừng lại ở mức độ định tính Công trình nghiên cứu phân lập và định lượng monotropein trong Ba kích ở cấp độ luận văn thạc sĩ thực hiện trên Ba kích trồng tại Bắc Giang đã chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định được hàm lượng

monotropein [8][9] bằng phương pháp HPLC với các điều kiện:

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về phân lập, định tính và định lượng nhóm

chất trong dược liệu Ba kíchnhư sau[20][35][39][42][44][39]

Thứ nhất: Nghiên cứu phân lập và định tính anthranoid trên các mẫu Ba kích

Trung Quốc bằng phương pháp HPLC kết hợp với một HSCCC Phương pháp

HPLC sử dụng cột C18(150mm × 4,6mm, 5µm), pha động MeOH-Acid acetic 1% theo gradient:

Thời gian (phút) MeOH (%) Acid acetic 1% (%)

Thứ hai: Nghiên cứu định lượng anthranoid toàn phần bằng phương pháp so

màu ở bước sóng 509nm được thực hiện trên các mẫu dược liệu Trung Quốc đã xác định được hàm lượng anthranoid toàn phần là 0,023%

Thứ ba: Nghiên cứu định lượng anthranoid bằng phương pháp HPLC sử dụng

cột C18(250mmx4,6mm, 5µm), hệ pha động: dung môi A: ACN; dung môi B: dung dịch acid phosphoric 0,2% với gradient:

Thời gian (phút) Dung môi A (%) Dung môi B (%)

(3) Rubiadin-1

(4) Rubiadin: 0,78 µg/g

Thứ 4: Nghiên c

cứu đã dùng phương pháp s

60, hệ dung môi khai tri

Sau khai triển cho kết qu

dung môi khai triển: n-butanol-isopropanol-nước-acetic acid (7:5:2:1, v/v)

t quả phân tách tốt 6 inulin-type oligosaccharide và cho k

ều tác dụng dược lý đã được chứng minh như tác d

ng kháng nấm, tác dụng ức chế tế bào ung thư, ch

][28][15][31][34][30]

ng oxi hóa

t oligosaccharide Nghiên

i bản mỏng silica gel acetic acid (7:5:2:1, v/v) type oligosaccharide và cho kết quả : DP3: 1.77%-10.94%, DP4: 41.09%, DP7: 9.36%-36.36%,

HPLC với cộtcyclobond I dòng: 0.4 mL/phút, thể tích tiêm: 10µl

type oligosaccharide

(DP1-ng minh như tác dụ(DP1-ng chố(DP1-ng bào ung thư, chống loãng xương và

Rubiadinđược chứng minh có khả năng chống lại sự peroxyd hóa lipid gây ra bởi FeSO4 và t-butylhydroperoxyd (tBHP) và khả năng này tốt hơn EDTA, vitamin

E, p-benzoquinone [34]

b Tác dụng ức chế tế bào ung thư

Rubiadin đã được chứng minh có khả năng gây độc đối với tế bào ung thư người Có thể xem rubiadin như là một chất độc quang học tự nhiên chống lại tế bào

ung thư [31]

c Tác dụng trên xương

Rubiadin được chứng minh là có tác dụng bảo vệ xương khi cắt bỏ buồng trứng ở chuột Chúng làm giảm các lỗ rò do tiêu xương, làm giảm lượng tế bào hủy xương đa nhân, ức chế tartrate resistant acid phosphates (TRAP), enzym cathepsin

K, thụ thể calcitonin (CTR) và carbonic anhydrase II (CAII) là những thành phần đặc hiệu cho hoạt động của tế bào hủy xương Ngoài ra, ba hợp chất này còn có tác dụng chặn tín hiệu cho tế bào hủy xương của NK- B (nuclear factor kappa B) và JNK (c-Jun N-terminal inases) đồng thời điều chỉnh tỉ lệ OPG/RANKL (Osteopro-

tegerin / receptor activator of NF- B ligand) của tế bào tạo xương [15][30]

d Tác dụng bảo vệ tế bào gan

Rubiadin có khả năng bảo vệ tế bào gan, làm giảm tỉ lệ phá hủy tế bào gan dưới tác nhân CCl4 ở chuột cống khi dùng 1 lần trên ngày trong 14 ngày liên tiếp

[37]

1.3.3 Sự phân bốrubiadin trong chi Morinda

Rubiadin rất phổ biến trong chi Morinda, đã được tìm thấy trong Morinda

citrifolia, Morinda jasminoides, Morinda lucida, Morinda umbellata, Morinda officinalis, Morinda elliptica[1]

Riêng trong Morinda officinalis, đã có nghiên cứu định lượng hàm lượng

rubiadin có trong các mẫu Trung Quốc: 0,78 µg/g – 21,53 µg/g Trong khi đó các anthraquinon khác được nghiên cứu đồng thời có hàm lượng là:

- 2-hydroxy-3-hydroxymethethyl-anthraquinone: 0,84µg/g-111,15 µg/g

- 2-hydroxy-1-methoxyanthraquinone: 3,67 µg/g- 211,57 µg/g

- Rubiadin-1-methyl ether: 1,94 µg/g- 98,56 µg/g

Nhận xét: Rubiadin là một trong những hoạt chất quan trọng thuộc nhóm

anthranoid trong dược liệu Ba kích Rubiadin đã được chúng minh có nhiều tác dụng dược lý như chống oxy hóa, bảo vệ xương, bảo vệ tế bào gan, ức chế tế bào ung thư Riêng trong dược liệu Ba kích đã có nghiên cứu tiến hành định lượng rubiadin trên các mẫu Ba kích Trung Quốc và cho kết quảrubiadin có tỉ lệ đáng kể

so với các anthraquinone khác

Những nghiên cứu định lượng hoạt chất của dược liệu Ba kích chưa công bố nhiều Cùng với với sự phổ biến và nhu cầu lớn của dược liệu ba kích trên thị

trường hiện nay, nên chúng tôi tiến hành đề tài “Bước đầu nghiên cứu xây dựng

phương pháp định lượng anthranoid trong dược liệu Ba kích bằng HPLC”, với

mục tiêugóp phần tìm hiểu về dược liệu Ba kích trên thị trường Việt Nam trên tiêu chí định lượng nhóm anthranoid, nhóm hoạt chất chính trong Ba kích.Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp định lượng rubiadin (như là marker) bằng phương pháp HPLC, và đồng thời tiến hành định lượng anthranoid toàn phần theo phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Ba kích do hợp tác xã Toàn Dân, xã Thanh Lâm, huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh cung cấp, 2 mẫu Ba kích thu mua tại cơ sở buôn bán dược liệu xã Ninh Hiệp, quận Gia Lâm, Hà Nội và 2 mẫu Ba kích thu mua tại các cơ sở buôn bán dược liệu phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội, 1 mẫu Ba kích Trung Quốc do công ty rượu Hà Nội cung cấp

Các mẫu được đánh số, dùng để chiết xuất và xác định hàm lượnganthranoid toàn phần và hàm lượng rubiadin

1 Mẫu Ba kích Trung Quốc do công ty rượu Hà Nội cung cấp

2 Mẫu Ba kích tại cơ sở 24 Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội

3 Mẫu Ba kích tại cơ sở 67 Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội

4 Mẫu Ba kích 2,5 năm tuổi hợp tác xã Toàn Dân, xã Thanh Lâm, huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh

5 Mẫu Ba kích tại quầy thuốc YHCT, xóm 9, xã Ninh Hiệp, Gia Lâm, Hà Nội

6 Mẫu Ba kích tại quầy thuốc Liên Khanh, xóm 8, xã Ninh Hiệp, Gia Lâm,

 Dung môi, hóa chất:

Các hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu gồm:rubiadin (ChemFaces – CFN99270), phycsion (Chengdu Biopurify Phytochemical – 15061509), emodin (ChemFaces - CFN98834), tectoquinon (ChemFaces), EtOH 96% (Merk), MeOH (Merk-PA), natri hydroxyd (công ty hóa chất Đức Giang), bản mỏng silicagel (Merk), ethylacetat (Trung Quốc), toluene (Trung Quốc), acid formic (Sigma-PA), acid sulfuric (Trung Quốc), ACN (Sigma-PA), acid phosphoric (Merk-PA), thuốc thử Fehling, natri carbonat, amoniac, chloroform, thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendoff, thuốc thử Bouchardat, đồng sulfat (Bộ môn Hóa phân tích-Độc chất), acid acetic (Trung Quốc), acid hydrochloric (Trung Quốc), ether (Trung Quốc), nước RO, nước cất hai lần…

 Áp dụng các phương pháp định tính đã được khảo sát qua các tài liệu, xác

định sự có mặt của một số nhóm nhất trong Ba kích

 Áp dụng phương pháp quang phổ UV-VIS để xác định hàm lượng

anthranoid toàn phần

 Khảo sát điều kiện sắc ký với HPLC để phân tích rubiadin trong Ba kích

 Thẩm định các điều kiện định lượng rubiadin trong Ba kích Quảng Ninh

 Áp dụng đểxác định hàm lượng rubiadin trong các mẫu Ba kích.So sánh hàm lượng rubiadin giữa Ba kíchQuảng Ninh với các mẫu Ba kích trên thị

trường.So sánh hàm lượng rubiadin với hàm lượng anthranoid toàn phần

2.4.1 Định tính các nhóm chất hóa học

a Chuẩn bị mẫu

Ba kích tươi rửa sạch, bỏ lõi đem sấy ở nhiệt độ 60oC đến khô theo tiêu chuẩn DĐVN IV, Ba kích khô đem sấy ở 60oC trong 24 giờ, sau đó kiểm tra dược liệu theo các tiêu chuẩn trong chuyên luận Ba kích-DĐVN IV Xay lấy bột để tiến hành phân tích

b Định tính các nhóm chất bằng phương pháp hóa học [1]

 Nhóm anthranoid:

Phản ứng Borntraeger:

- Định tính anthranoid toàn phần:

Tiến hành: Lấy 1g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn (10ml), thêm 5ml

dung dịch H2SO4 1N, đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi khoảng 15 phút Lọc nóng, thu dịch lọc vào bình gạn, để nguội Thêm 5ml ether, lắc nhẹ, gạn lấy lớp ether Lấy 1ml dịch chiết ether, thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp nước

sẽ có màu đỏ sim

- Định tính anthranoid tự do:

Tiến hành: Lấy 1g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn (10ml), thêm 5ml nước

cất Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi Lọc nóng, thu dịch lọc vào bình gạn Thêm 5ml ether Lắc nhẹ, gạn lấy lớp ether Lấy 1ml dịch chiết ether vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp nước sẽ có màu đỏ sim

 Định tính iridoid

dung dịch CuSO40,2% và 0,5ml HCl đặc, lắc đều

Tiến hành:Cân khoảng 1g bột dược liệu, thêm 5ml dung dịch HCl 1%, lắc đều,

để yên 2 giờ Lấy 0,1ml dịch chiết, thêm 1ml thuốc thử Trim Hill, đun cách thủy Dung dịch chuyển sang màu xanh dương

 Định tính đường khử

Tiến hành: Cân khoảng 2g bột dược liệu, thêm 10ml nước, đun sôi 10 phút,

lọc lấy dịch chiết Thêm thuốc thử Fehling, đun cách thủy 5 phút, sẽ có kết tủa đỏ gạch

 Định tính saponin

Quan sát hiện tượng tạo bọt:

Tiến hành: Cân khoảng 1g bột dược liệu, thêm 10ml nước, đun cách thủy

trong 10 phút, lọc thu dịch lọc vào một ống nghiệm to Thêm nước đến khoảng 10ml Bịt ống nghiệm bằng ngòn tay, lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 phút Để yên và quan sát cột bọt, thấy cột bọt bền trong 15 phút thì phản ứng dương tính

 Định tính alcaloid

phút Thêm 20ml dung dịch CHCl3 lắc đều, ngâm trong 1 giờ, lọc thu dịch lọc vào bình gạn Lắc 3 lần, mỗi lần với 15ml dung dịch HCl 5% Thu dịch chiết nước Lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ổng khoảng 1ml dịch chiết Lần lượt thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff vào 3 ống nghiệm

Các phản ứng định tính trên đều được lặp lại 5 lần

c Xác định sự có mặt của một số hoạt chất bằng TLC[15]

Chuẩn bị dung dịch thử: cân khoảng 2g bột dược liệu cho vào bình nón, thêm

khoảng 10ml EtOH Đun hồi lưu cách thủy trong khoảng 30 phút Để nguội thu dịch lọc, đem cô đến khi thu được dịch chiết để khai triển sắc ký

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn emodin,

rubiadin, tectoquinon, phycsion có nồng độ 0,1mg/ml

- Bản mỏng Silicagel GF254 đã hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ

- Hệ dung môi khai triển: Toluen – Ethyl acetat – Acid formic (8:2:0,1)

- Thuốc thử hiện màu: đèn tử ngoại bước sóng 365nm

Tiến hành chấm riêng biệt lên bản mỏng 10µl dung dịch thử và các dung dịch chuẩn emodin, rubiadin, tectoquinon, phycsion bằng hệ thống chấm sắc ký tự động Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi Saukhi khai triển xong, sấy khô Quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm

2.4.2 Xác định hàm lượng anthranoid toàn phần trong Ba kích bằng phương

pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS

a Nguyên tắc

Dựa vào tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành định lượng anthranoid theo nguyên tắc: anthranoid được tạo phức chelat với dung dịch magie acetat 0,5% trong MeOH Xác định nồng độ anthranoid toàn phần thông qua nồng độ phức chelat

bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS [44]

b Chuẩn bị dung dịch thử

Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu Tiến hành chiết Soxhlet với 150ml EtOH 80o đến kiệt, bốc hơi dung môi, thu cắn Thêm 10ml hỗn hợp CH3COOH băng + HCl 25% (10:21), siêu âm trong 5 phút Thêm 10ml CHCl3, đun hồi lưu trong 30 phút, để nguội Gạn lấy lớpCHCl3, tiếp tục lắc 3 lần vớiCHCl3, mỗi lần 5ml Gộp dịch chiết, bốc hơi dung môi thu cắn Hòa tan cắn trở lại vào bình định mức 25ml bằng dung dịch Magie acetat 0,5% trong MeOH vừa đủ thu được dung

dịch thử[44]

c Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn rubiadin:Cân chính xác khoảng 1mg rubiadin vào bình định

mức 10ml, thêm 5ml MeOH, siêu âm đến tan hoàn toàn, thêm MeOH đến vừa đủ thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1mg/ml Từ dung dịch chuẩn gốcrubiadin 0,1mg/ml, lấy chính xác một dãy các thể tích: 0,2ml; 0,4ml; 0,6ml; 0,8ml; 1mlvào cốc có mỏ nhỏ, cô lấy cắn Hòa tan cắn trở lại bằng dung dịch Magie acteat 0,5% trong MeOH và chuyển sang bình định mức 5ml Bổ sung vừa đủ dung dịch Magie

acetat 0,5% trong MeOH thu được dãy dung dịch chuẩn [44]

d Xây dựng đường chuẩn

Tiến hành đo độ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn rubiadin tại bước sóng 501nm (PL 3) với dung dịch magie acetat 0,5% trong MeOH làm mẫu trắng, xây dựng

đường chuẩn Mỗi dung dịch đo lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình[44]

e Xác định hàm lượng anthranoid toàn phần

Tiến hành đo độ hấp thụ UV-VIS các dung dịch thử với mẫu trắng là dung dịch magie acetat 0,5% trong MeOH tại501nm.Dựa vào đường chuẩn đã xây dựng, tính toán xác định hàm lượng anthranoid toàn phần theo rubiadin Mỗi mẫu thử lặp

lại 3 lần, lấy kết quả trung bình [44]

2.4.3 Xác định hàm lượng rubiadin bằng phương pháp HPLC

a Chuẩn bị dung dịch thử

Lựa chọn điều kiện chiết xuất:

Cân 1,500g bột dược liệu, thêm 50ml EtOH 50o, 70o và 96o,đun cách thủy ở

80oC trong 1 giờ Thu dịch chiết, xác định và so sánh hàm lượng rubiadin trong dược liệu theo từng phương pháp Dung môi cho dịch chiết có hàm lượng rubiadin cao nhất được lựa chọn làm dung môi phân tích

Tiến hành cân 1,500g bột dược liệu, thêm 50ml dung môi đã lựa chọn, đung cách thủy ở 80oC trong thời gian 30 phút, 1 giờ, 1,5 giờ và 2 giờ Thu dịch chiết, xác định và so sánh hàm lượng rubiadin trong dược liệu theo từng phương pháp Điều kiện được lựa chọn là điều kiện cho dịch chiết cóhàm lượng rubiadin cao nhất

Chuẩn bị dung dịch thử:Cân chính xác 1,500g bột dược liệu, thêm 50ml dung

môi đã lựa chọn Cân tổng khối lượng bình Đun cách thủy ở 80oC trong thời gian

đã lựa chọn, để nguội.Bổ sung EtOH vào bình định mức sao cho tổng khối lượng bình sau khi bổ sung bằng tổng khối lượng bình trước khi chiết, lắc đều.Thu dịch chiết làm dung dịch thử, dung dịch thử được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi tiêm sắc ký

b Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn gốcrubiadin0,1mg/ml: Cân chính xác 1mg rubiadin vào các bình định mức 10ml, thêm 5ml MeOH, siêu âm đến tan hoàn toàn, bổ sung MeOH

vừa đủ Pha loãng dung dịch chuẩn gốc thu được dãy dung dịch có nồng độ trong khoảng 0,1 µg/ml đến 2µg/ml để tiến hành phân tích và thẩm định phương pháp

c Khảo sát tìm điều kiện sắc ký

Chọn cột sắc ký

Vì lý do điều kiện cơ sở vật chất tại nơi làm thực nghiệm chỉ có cột C18 Waters (150mm x 4,6 mm, 5 µm) Do vậy chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký với loại cột này

Dung môi pha động

Chúng tôi tiến hành khảo sát dung môi pha động:

=W /2Trong đó: W1/20: Độ rộng của pic sắc ký ở độ cao 1/20, : khoảng cách từ chân đường cao hạ từ đỉnh pic sắc ký tới đường cong phía trước của pic ở độ cao 1/20

Yêu cầu: Hệ số bất đối phải nằm trong khoảng 0,8-2 [2][10][13]

Chọn bước sóng phát hiện

Từ phổ hấp thụ của rubiadin (PL4) cho thấybước sóng hấp thụ cực đại của rubiadin là λmax=245nm, 277nm và 411nm Trong đó, độ hấp thụ của rubiadin tại bước sóng 277nm lớn nhất, do đó chúng tôi lựa chọn bước sóng 277nm để phân tích

d Thẩm định phương pháp định lượng rubiadin trongBa kích Quảng Ninh

Tiến hành thẩm định phương pháp định tính, định lượng theo AOAC: độ đặc hiệu, tính thích hợp của hệ thống, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, độ chính

xác, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng [13]

Độ đặc hiệu

Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi

có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích

Tiến hành: Tiêm lần lượt mẫu chuẩn và mẫu thử Tiến hành khai triển theo các

điều kiện đã khảo sát Ghi lại sắc ký đồ (SKĐ)

Yêu cầu: Trên SKĐ của mẫu thử phải cho pic với thời gian lưu tương ứng như

pic của chất đó trên mẫu chuẩn Phổ hấp thụ của chất đó trong mẫu thử và mẫu chuẩn phải tương ứng nhau

Độ thích hợp của hệ thống sắc ký

Độ thích hợp của hệ thống sắc ký là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý xong