Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC MS MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC  HÀ ANH TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AFLATOXIN TRONG DƢỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC  HÀ ANH TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AFLATOXIN TRONG DƢỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC KHÓA: QH.2014.Y Ngƣời hƣớng dẫn 1: TS Nguyễn Thị Phƣơng Ngƣời hƣớng dẫn 2: TS Nguyễn Hữu Tùng Hà Nội – 2019 LỜI CẢM ƠN Bản luận văn đƣợc hồn thành Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu dƣới hƣớng dẫn TS Nguyễn Thị Phƣơng TS Nguyễn Hữu Tùng Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Phƣơng (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu) TS Nguyễn Hữu Tùng (Bộ môn Hóa dƣợc kiểm nghiệm, Khoa Y Dƣợc - ĐHQGHN) ngƣời thầy hƣớng dẫn, bảo, góp ý đƣa ý kiến quý báu để em hồn thiện khóa luận Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phƣơng Thiện Thƣơng (Trƣởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu) với anh chị,bạn bè, cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu giúp đỡ em, đặc biệt anh Nguyễn Đình Quân - ngƣời theo sát, hƣớng dẫn cho em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Khoa Y – Dƣợc dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em suốt năm theo học trƣờng Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè ln bên cạnh, ủng hộ, động viên em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Cuối cùng, em xin chúc thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc thành công công việc nhƣ sống Hà Nội, ngày 16 tháng 04 năm 2019 Sinh viên Hà Anh Tuấn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan aflatoxin .2 1.1.1 Giới thiệu aflatoxin 1.1.2 Tính chất hóa lý 1.1.3 Điều kiện sinh aflatoxin 1.1.4 Cơ chế gây bệnh aflatoxin 1.1.5 Độc tính aflatoxin lên thể ngƣời .9 1.1.6 Những nghiên cứu phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin dƣợc liệu 10 1.2 Tổng quan s ắc ký lực miễn dịch sắc ký lỏng – khối phổ (LCMS/MS) 15 1.2.1 Sắc ký lực miễn dịch 15 1.2.2 Sắc ký lỏng khối phổ 16 CHƢƠNG2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .21 2.2 Chất chuẩn, hóa chất thiết bị 21 2.2.1 Chất chuẩn 21 2.2.2 Hóa chất 21 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 2.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin dƣợc liệu 2.3.3 Áp dụng phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng aflatoxin mẫu dƣợc liệu giàu tinh bột thị trƣờng Hà Nội 2.4.Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phƣơng pháp thu thập xử lý sơ mẫ u thử 2.4.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí 2.4.3 Quy trình thẩm định phƣơng pháp 2.4.3.1 Tính đặc hiệu/ chọn lọc 2.4.3.2 Giới hạn phát (LOD), Giới hạn định lƣợng (LOQ) 2.4.3.3 Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn 2.4.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi 2.4.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1.Khảo sát điều kiện khối phổ 3.2.Khảo sát điều kiện sắc ký 3.2.1 Lựa chọn pha tĩnh 3.2.2 Khảo sát pha động 3.3.Khảo sát quy trình xử lý mẫu 3.3.1 Khảo sát dung môi chiết mẫu 3.3.2 Khảo sát dung môi làm 3.4.Thẩm định phƣơng pháp 3.4.1 Độ chọn lọc phƣơng pháp 35 3.4.2 Tính phù hợp hệ thống 36 3.4.3 Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 37 3.4.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 39 3.4.5 Độ lặp lại độ thu hôi 40 3.5 Áp dụng phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng aflatoxin dƣợc liệu 42 CHƢƠNG KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu AF AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AFM1 AFM2 AOAC CE/MS CTCT CTPT CV% ELISA ESI HCC HPLC HPLC-FLD IARC LC-MS LC-MS/MS LOD LOQ MeOH PBS R% RSD SD SPE SPE-IM TLC TLPT TLTK Bảng 1.Tính chất Bảng 2.Một số ng Bảng 2.1 Danh sách mẫu thu mua Bảng 3.1 Thông số MS tối ưu Bảng 2.Một số ch Bảng 3.Các thôn Bảng Hiệu suất thu hồi aflatoxin với dung môi khác 34 Bảng Hiệu suất thu hồi aflatoxin với dung môi làm Bảng Ion mẹ v Bảng Kết đ Bảng Quan hệ Bảng Kết x Bảng 10 Độ lặp lại độ thu hồi DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sơ đồ khối máy khối phổ Hình 1.2 Bộ phân tích tử cực chập ba Hình 3.1 Phổ khối AFB1, AFB2, AFG1 AFG2 quan sát chế độ ESI-positive Hình Phổ khối củ Hình 3 Sắc ký đồ c Hình Sắc ký đồ c Hình Sắc ký đồ đ Hình Đường chuẩ Nồng độ 10 ppb 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 110000 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 Nồng độ ppb 55000 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 0 Nồng độ 2,5 27500 25000 22500 20000 17500 15000 12500 10000 7500 5000 2500 0.0 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 Nồng độ ppb 12500 10000 7500 5000 2500 0.0 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0.0 Nồng độ 0.1 ppb Dung dịch chuẩn AFG2 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 40000 35000 25000 66040 30000 20000 15000 10000 5000 0 0 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0.0 Nồng độ ppb 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 25000 22500 20000 17500 15000 12500 10000 7500 5000 2500 0.0 Nồng độ 2.5 ppb Nồng độ ppb Nồng độ 0.5 ppb SẮC KÝ ĐỒ MẪU THỬ Mẫu phát Mẫu YD4 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0.0 AFG1 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 600 500 400 300 200 100 0.0 3000 2500 2000 1500 1000 500 0.0 AFB1 1750 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 1500 1250 1000 750 500 250 0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 AFB2 Mẫu không phát Mẫu BL1 3.5 4.0 4.5 5.0 200 1:AFB1 TIC(+) 175 150 125 100 75 50 25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 2.5 3.0 250 2:AFB2 TIC(+) 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0.0 0.5 3:AFG1 TIC(+) 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 1.0 1.5 2.0 3.5 4.0 4.5 5.0 2750 4:AFG2 TIC(+) 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Mẫu TT1 1:AFB1 TIC(+) 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 500 2:AFB2 TIC(+) 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 3:AFG1 TIC(+) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 4:AFG2 TIC(+) 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 Mẫu CC1 0.5 1:AFB1 TIC(+) 700 600 500 400 300 200 100 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 3.0 3.5 2:AFB2 TIC(+) 300 250 200 150 100 50 0.0 0.5 3:AFG1 TIC(+) 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 4.0 4.5 5.0 12500 4:AFG2 TIC(+) 10000 7500 5000 2500 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Mẫu HS1 2250 1:AFB1 TIC(+) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 1.0 1.5 600 2:AFB2 TIC(+) 500 400 300 200 100 0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 2250 3:AFG1 TIC(+) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 4:AFG2 TIC(+) 11000 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0.0 0.5 4.0 4.5 5.0 ... phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin dƣợc liệu với hiệu suất thu hồi cao phƣơng pháp đơn giản, nhƣ tiết kiệm thời gian hơn, đề xuất đề tài ? ?Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin dƣợc liệu LC- MS/ MS”,... để xác định hàm lƣợng aflatoxin số dƣợc liệu với mục tiêu: - Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời độc tố aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) dƣợc liệu phƣơng pháp LC- MS/ MS sử dụng... sản phẩm dƣợc liệu 1.1.6 Những nghiên cứu phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin dƣợc liệu 10 Bảng Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin nước TT Phƣơng pháp phân tích I LC- MS/ MS LC- FLD LC- FLD II Các