Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC MS MS

VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ine an dP rm ac y,  M ed ic HÀ ANH TUẤN of XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ho ol ĐỊNH LƢỢNG AFLATOXIN @ Sc TRONG DƢỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS Co py rig ht KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2019 VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI dP rm  ac y, KHOA Y DƢỢC an HÀ ANH TUẤN ine XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ed ic ĐỊNH LƢỢNG AFLATOXIN of M TRONG DƢỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Sc KHÓA: QH.2014.Y Ngƣời hƣớng dẫn 2: TS Nguyễn Hữu Tùng Co py rig ht @ Ngƣời hƣớng dẫn 1: TS Nguyễn Thị Phƣơng Hà Nội – 2019 LỜI CẢM ƠN VN U Bản luận văn đƣợc hồn thành Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu dƣới hƣớng dẫn TS Nguyễn Thị Phƣơng TS Nguyễn Hữu Tùng ac y, Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Phƣơng (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu) TS Nguyễn Hữu dP rm Tùng (Bộ mơn Hóa dƣợc kiểm nghiệm, Khoa Y Dƣợc - ĐHQGHN) ngƣời thầy hƣớng dẫn, bảo, góp ý đƣa ý kiến q báu để em hồn thiện khóa luận an Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phƣơng Thiện Thƣơng (Trƣởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu) với anh chị,bạn ine bè, cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu ed ic giúp đỡ em, đặc biệt anh Nguyễn Đình Qn - ngƣời ln theo sát, hƣớng dẫn cho em suốt trình thực đề tài M Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Khoa Y – Dƣợc of dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em suốt năm theo học trƣờng Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè ln ho ol bên cạnh, ủng hộ, động viên em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Sc Cuối cùng, em xin chúc thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc thành Hà Nội, ngày 16 tháng 04 năm 2019 Sinh viên Co py rig ht @ công công việc nhƣ sống Hà Anh Tuấn VN U MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG ac y, DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ dP rm ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan aflatoxin 1.1.1 Giới thiệu aflatoxin an 1.1.2 Tính chất hóa lý ine 1.1.3 Điều kiện sinh aflatoxin ed ic 1.1.4 Cơ chế gây bệnh aflatoxin 1.1.5 Độc tính aflatoxin lên thể ngƣời M 1.1.6 Những nghiên cứu phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin of dƣợc liệu 10 ho ol 1.2 Tổng quan sắc ký lực miễn dịch sắc ký lỏng – khối phổ (LCMS/MS) 15 Sc 1.2.1 Sắc ký lực miễn dịch 15 @ 1.2.2 Sắc ký lỏng khối phổ 16 CHƢƠNG2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 rig ht 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 py 2.2 Chất chuẩn, hóa chất thiết bị 21 Co 2.2.1 Chất chuẩn 21 2.2.2 Hóa chất 21 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 22 VN U 2.3 Nội dung nghiên cứu 22 2.3.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 22 ac y, 2.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin dƣợc liệu 22 2.3.3 Áp dụng phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng aflatoxin mẫu dP rm dƣợc liệu giàu tinh bột thị trƣờng Hà Nội 23 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Phƣơng pháp thu thập xử lý sơ mẫu thử 23 an 2.4.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí 23 2.4.3 Quy trình thẩm định phƣơng pháp 23 ine 2.4.3.1 Tính đặc hiệu/ chọn lọc 23 ed ic 2.4.3.2 Giới hạn phát (LOD), Giới hạn định lƣợng (LOQ) 24 M 2.4.3.3 Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn 24 2.4.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi 25 of 2.4.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 26 ho ol CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 Sc 3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 27 3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 29 @ 3.2.1 Lựa chọn pha tĩnh 29 ht 3.2.2 Khảo sát pha động 30 rig 3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 33 Co py 3.3.1 Khảo sát dung môi chiết mẫu 33 3.3.2 Khảo sát dung môi làm 34 3.4 Thẩm định phƣơng pháp 35 3.4.1 Độ chọn lọc phƣơng pháp 35 VN U 3.4.2 Tính phù hợp hệ thống 36 3.4.3 Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 37 ac y, 3.4.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 39 3.4.5 Độ lặp lại độ thu hôi 40 dP rm 3.5 Áp dụng phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng aflatoxin dƣợc liệu 42 CHƢƠNG KẾT LUẬN Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AF Aflatoxin AFB1 Aflatoxin B1 AFB2 Aflatoxin B2 AFG1 Aflatoxin G1 AFG2 Aflatoxin G2 AFM1 Aflatoxin M1 AFM2 Aflatoxin M2 Hiệp hội nhà phân Chemists tích hóa học Capillary Electrophoresis – Mass ine CE/MS Spectrometry ed ic CTCT CTPT Assay kết với enzyme Electrospray Ionization Ion hóa tia điện tử M of @ gan Sắc ký lỏng hiệu Chromatography cao chromatography- Fluorescence rig Ung thƣ biểu mô tế bào High Performance Liquid HPLC-FLD py Co Hepatocellular carcinoma High performance liquid IARC Công thức phân tử Kỹ thuật miễn dịch liên ht HPLC Công thức cấu tạo Enzyme – Linked Immuno Sorbent Sc ESI khối phổ Hệ số biến thiên ho ol ELISA Điện di mao quản – Coefficient of Variation CV% HCC dP rm Association of Official Analytical an AOAC Tiếng Việt VN U Tên tiếng Anh tên khoa học ac y, Ký hiệu Detection International Agency for Research Sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò huỳnh quang Cơ quan nghiên ung Liquid Chromatography Mass LC-MS Spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ Liquid Chromatography tandem Sắc ký lỏng khối phổ Mass Spectrometry hai lần ac y, LC-MS/MS VN U thƣ quốc tế on Cancer Limit of detetion Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lƣợng MeOH Methanol PBS Phosphate-Buffered Saline R% Recovery RSD Relative Standard Deviation SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extract Chiết pha rắn SPE-IM Solid phase extract-Immuno TLC Thin layer chromatography ho ol of M ed ic ine an dP rm LOD TLPT phosphat Độ thu hồi Độ lệch chuẩn tƣơng đối Chiết pha rắn với cột lực miễn dịch Sắc ký lớp mỏng Trọng lƣợng phân tử Tài liệu tham khảo Co py rig ht @ Sc TLTK Dung dịch đệm DANH MỤC CÁC BẢNG VN U Bảng 1 Tính chất vài aflatoxin Bảng Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin nước 11 Bảng 2.1 Danh sách mẫu thu mua 21 ac y, Bảng 3.1 Thông số MS tối ưu 28 Bảng Một số chương trình gradient khảo sát 30 dP rm Bảng 3 Các thông số sắc ký ứng với chương trình gradient 32 Bảng Hiệu suất thu hồi aflatoxin với dung môi khác 34 Bảng Hiệu suất thu hồi aflatoxin với dung môi làm 35 Bảng Ion mẹ ion aflatoxin 35 an Bảng Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp 37 ine Bảng Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích píc chất 38 Bảng Kết xác định LOD LOQ phương pháp 40 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic Bảng 10 Độ lặp lại độ thu hồi aflatoxin mẫu dược liệu 41 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ VN U Hình 1.1 Sơ đồ khối máy khối phổ 18 Hình 1.2 Bộ phân tích tử cực chập ba 19 ac y, Hình 3.1 Phổ khối AFB1, AFB2, AFG1 AFG2 quan sát chế độ ESI-positive 28 dP rm Hình Phổ khối ion aflatoxin .29 Hình 3 Sắc ký đồ chương trình gradient 31 Hình Sắc ký đồ chương trình gradient 31 Hình Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp 36 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an Hình Đường chuẩn độc tố aflatoxin 39 ... liệu LC- MS/ MS”, áp dụng để xác định hàm lƣợng aflatoxin số dƣợc liệu với mục tiêu: M - Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời độc tố of aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) dƣợc liệu. .. phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin ine dƣợc liệu với hiệu suất thu hồi cao phƣơng pháp đơn giản, nhƣ tiết kiệm thời gian hơn, đề xuất đề tài Xây dựng phƣơng pháp định ed ic lƣợng aflatoxin dƣợc liệu. .. dP rm  ac y, KHOA Y DƢỢC an HÀ ANH TUẤN ine XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ed ic ĐỊNH LƢỢNG AFLATOXIN of M TRONG DƢỢC LIỆU BẰNG LC- MS/ MS ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Sc