Phân lập và xây dựng phương pháp định lượng flavonolignan trong dược liệu và chế phẩm từ cúc gai (silybum marianum (l ) gaertn )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LA HOÀNG ANH PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOLIGNAN TRONG DƯỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN.) LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LA HOÀNG ANH PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOLIGNAN TRONG DƯỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN.) Ngành: Kiểm nghiệm thuốc – độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGƠ THỊ THANH DIỆP Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác La Hồng Anh ii Luận văn thạc sỹ dược học Khóa 2016 – 2018 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc & độc chất – Mã số: 8720210 PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOLIGNAN TRONG DƯỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN.) Học viên: La Hoàng Anh NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ THỊ THANH DIỆP Từ khóa: HPLC, Cúc gai, Silymarin, Silybin, Silychristin Mở đầu: Cúc gai loại dược liệu có nguồn gốc từ Địa Trung Hải, di thực vào nước ta trồng phát triển tốt nơi có khí hậu mát mẻ Sapa, Lào Cai, Tam Đảo Thành phần hóa học Cúc gai chứa flavonolignan, đặc biệt silymarin, chứng minh có tác dụng tốt điều trị bệnh gan in vitro in vivo Các loại thuốc thực phẩm chức từ Cúc gai bắt đầu xuất thị trường Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Cúc gai tạo nguồn nguyên liệu cho sản xuất chế phẩm thuốc điều trị bệnh gan thận, đồng thời kiểm tra chất lượng chế phẩm có nguồn gốc từ Cúc gai lưu hành thị trường vấn đề quan tâm Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Hạt Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn thu mua năm 2017 hãng Starwest Botanicals (nguồn gốc: Croatia) Hạt sấy khô, xay thành bột thô Phương pháp nghiên cứu: Dùng phương pháp đun hồi lưu với sinh hàn, hạt Cúc gai loại hết dầu béo với petroleum ether, sau chiết kiệt với methanol, đuổi hết methanol Cắn thu đem phân lập thành chất tinh khiết sắc ký cột HPLC điều chế Cấu trúc xác định dựa vào liệu phổ UV, IR, MS NMR Định lượng silybin hạt Cúc gai chế phẩm từ Cúc gai máy HPLC Waters Alliance e2695, đầu dò PDA Waters 2998 với cột Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm) Kết quả: Từ 400g hạt Cúc gai, sau loại dầu béo 260g, chiết với methanol nóng rửa cắn cloroform thu 31g cắn Sử dụng 15g cắn để phân lập hợp chất Silybin hỗn hợp Silybin A, Silybin B, Isosilybin A, Isosilybin B (SA: 52mg) Silychristin (NS: 19mg) Định lượng silybin hạt Cúc gai chế phẩm từ Cúc gai máy HPLC Kết cho thấy hàm lượng silybin hạt Cúc gai khoảng 1,79 mg/g chế phẩm đạt khoảng 49 mg/viên (FY) 41 mg/viên (ZE) Kết luận: Những kết tiền đề cho nghiên cứu kiểm nghiệm dược liệu Cúc gai tác dụng dược lý sau iii Master’s thesis of Pharmacy Academic course: 2016 – 2018 Major: Drug quality control & Toxicology – Speciality code: 8720210 ISOLATION AND DEVELOPMENT OF QUANTITATIVE PROCEDURE FOR FLAVONOLIGNAN IN (MATERIALS AND PRODUCTS OF) SILYBUM MARIANUM (L.) La Hoang Anh Supervisor: Assoc Prof Dr Ngo Thi Thanh Diep Keywords: HPLC, Silybum marianum (L.), Silymarin, Silybin, Silychristin Introduction: Silybum marianum (L.) is a medicinal herbs originating from the Mediterranean, have planted in Vietnam and grown well in cool weather such as Sapa, Lao Cao, Tam Dao The chemical composition in Silybum marianum (L.) includes flavonolignan, especially silymarin, has been verified to be effective in treating liver disease in vitro and in vivo Drugs and dietary supplements from Silybum marianum (L.) have sold in pharmacies Standardization of Silybum marianum to produce raw materials for production for treatment of liver or kidney disease, and controlling the quality of products from Silybum marianum (L.) Materials and Methods Materials: Seeds of Silybum marianum (L.) were purchased in 2017, Starwest Botanicals branch (origin: Croatia) Seeds are dried, milled into raw powder Methods of study: Using reflux heating method, seeds of Silybum marianum (L.) was defatted with petroleum ether, then extracted with methanol and removed methanol This extract was isolated to pure compounds by column chromatography techniques and preparative HPLC Structures of isolated compounds were determined by UV, IR, MS and NMR data Quantification in seeds of Silybum marianum (L.) and product from Silybum marianum (L.) was performed on the HPLC Waters Alliance e2695, detector PDA Waters 2998, column Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm) Results: Defatted 400 g seeds of Silybum marianum (L.) to 260 g, extracted with methanol, rinsed extract with cloroform, got 31 g Using 15 g, compounds were isolated as Silybin, includes Silybin A, Silybin B, Isosilybin A, Isosilybin B (SA: 52 mg) and pure Silychristin (NS: 19 mg) Quantification in seeds of Silybum marianum (L.) and product from Silybum marianum (L.) was performed on the HPLC The results showed that the content of Silybin in seeds of Silybum marianum (L.) were 1,79 mg/g and in product were 49 mg/tablet (FY); 41 mg/hard capsule (ZE) respectively Conclusion: These results are the first step for further studies on quality control in Silybum marianum (L.) as well as its pharmacological effects in the future iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ix ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Tên gọi 1.1.2 Mô tả thực vật 1.1.3 Sinh thái phân bố 1.1.4 Bộ phận dùng 1.1.5 Hạt Cúc gai 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.3 TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM HẠT CÚC GAI TRONG DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM V 10 1.4 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC 14 1.5 TỔNG QUAN VỀ SILYMARIN – SILYBIN - SILYCHRISTIN 16 1.6 MỘT SỐ CHẾ PHẨM TỪ CÚC GAI TRÊN THỊ TRƯỜNG 19 1.7 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SILYMARIN 21 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24 2.1.1 Nguyên vật liệu 24 2.1.2 Dung mơi hóa chất, chất chuẩn 25 2.1.3 Trang thiết bị 25 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Chiết xuất 26 v 2.2.2 Phân lập tinh chế 27 2.2.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 29 2.2.4 Xây dựng quy trình định lượng Silybin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 31 2.2.5 Đánh giá quy trình định lượng Silybin hạt Cúc gai chế phẩm 36 2.2.6 Ứng dụng quy trình định lượng Silybin để định lượng hàm lượng Silybin hạt Cúc gai chế phẩm 42 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43 3.1 CHIẾT XUẤT 43 3.2 PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ 43 3.2.1 Tách phân đoạn sắc ký cột cổ điển (SKC) 43 3.2.2 Tinh chế 45 3.2.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 48 3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG SILYBIN TRONG DƯỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM CÚC GAI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC 62 3.3.1 Khảo sát điều kiện HPLC 62 3.3.2 Qui trình định lượng Silybin hạt Cúc gai 62 3.3.3 Đánh giá quy trình định lượng Silybin 63 3.3.4 Ứng dụng quy trình định lượng Silybin 75 CHƯƠNG BÀN LUẬN 75 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Từ nguyên Ý nghĩa Trung bình X ACN Acetonitril AR Analytical Reagent Hóa chất phân tích Hệ số bất đối As AU Area under CCl4 Tetracloromethan CHCl3 Cloroform d Doublet Đỉnh đôi* Distortionless DEPT Enhancement by Polarization Transfer* DMSO Dimethyl sulfoxid EA Ethyl Acetat F Trắc nghiệm Fisher H2 O Nước H2 O2 Hydroxy H3PO4 Acid phosphoric peroxyd High Performance HPLC Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao IR Chromatography InfraRed Hồng ngoại J Hằng số ghép* k Hệ số dung lượng LC/MS Sắc kí lỏng đầu dò khối phổ LD50 Liều gây chết 50 % vật thử nghiệm MeOH Methanol MHz Mega Hertz* MS Mass Spectroscopy Khối phổ vii N Số đĩa lý thuyết n Cỡ mẫu NMR Nuclear Magnetic Cộng hưởng từ hạt nhân* PDA Photodiode array Resonance Dãy diod quang Rf Hệ số lưu Rs Độ phân giải RSD Độ lệch chuẩn tương đối s second giây s Singlet Đỉnh đơn* SD Độ lệch chuẩn SKC Sắc ký cột cổ điển SKLM Sắc ký lớp mỏng Spic TLC STT Diện tích pic t Trắc nghiệm Student TB Trung bình TLTK Tài liệu tham khảo Số thứ tự TMS Trimethylsiloxan TP Toàn phần tR Thời gian lưu UV Ultraviolet Tử ngoại Viện kiểm nghiệm VKN VS Vanillin sulfuric α Độ chọn lọc Δ Chemical shift *: Được sử dụng phổ NMR Độ chuyển dịch hóa học* viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần tác dụng số chế phẩm từ Cúc gai 19 Bảng 2.1 Khảo sát hệ dung môi pha động để chọn hệ thích hợp chạy HPLC 33 Bảng 3.1 Kết tách phân đoạn từ cắn toàn phần SKC 45 Bảng 3.2 Kết tính % diện tích pic pic hỗn hợp SA HPLC 53 Bảng 3.3 Kết tính % diện tích pic pic hỗn hợp chuẩn Silybin VKN HPLC 55 Bảng 3.4 Kết tính % diện tích pic NS 56 Bảng 3.5 Bảng so sánh liệu phổ 13C (125 MHz) phổ 1H (500 MHz) NS so với Silychristin 59 Bảng 3.6 Thời gian lưu pic sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu thử hạt Cúc gai, mẫu thử chế phẩm 65 Bảng 3.7 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu chuẩn mẫu hạt Cúc gai, mẫu chế phẩm 68 Bảng 3.8 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu chế phẩm 69 Bảng 3.9 Kết thẩm định độ lặp lại quy trình định lượng Silybin mẫu thử hạt Cúc gai 70 Bảng 3.10 Kết thẩm định độ lặp lại quy trình định lượng Silybin mẫu thử chế phẩm 70 Bảng 3.11 Kết thẩm định độ xác trung gian quy trình định lượng Silybin mẫu thử hạt Cúc gai 71 Bảng 3.12 Kết thẩm định độ xác trung gian quy trình định lượng Silybin mẫu thử chế phẩm 72 Bảng 3.13 Kết thẩm định độ quy trình định lượng Silybin hạt Cúc gai 73 Bảng 3.14 Kết thẩm định độ quy trình định lượng Silybin chế phẩm 74 Bảng 3.15 Kết định lượng Silybin mẫu 75 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 12 Phổ HMBC NS (mở rộng) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 13 Phổ HSQC NS Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 14 Phổ HSQC NS (mở rộng) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 15 Phổ HSQC NS (mở rộng) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 16 Sắc ký đồ dò hệ pha động _ hệ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 17 Sắc ký đồ dò hệ pha động _ hệ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 18 Sắc ký đồ dị hệ pha động _ hệ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 19 Sắc ký đồ dò hệ pha động _ hệ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 20 Sắc ký đồ dò hệ pha động _ hệ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 21 Sắc ký đồ dị hệ pha động _ hệ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 22 Sắc ký đồ dò hệ pha động _ hệ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 23 Sắc ký đồ dò hệ pha động _ hệ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 24 Sắc ký đồ dò hệ pha động _ hệ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 25 Sắc ký đồ định lượng silybin hạt Cúc gai theo DĐVN V Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 26 Sắc ký đồ định lượng silybin hạt Cúc gai theo USP 40 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... gai) Xây dựng thẩm định quy trình định lượng flavonolignan phân lập chế phẩm từ Cúc gai Áp dụng quy trình xây dựng thẩm định để xác định hàm lượng flavonolignan dược liệu chế phẩm từ Cúc gai thị... liệu chế phẩm từ Cúc gai? ?? với mục tiêu sau: Phân lập, xác định cấu trúc đến hai flavonolignan từ hạt Cúc gai Xây dựng thẩm định quy trình định lượng flavonolignan phân lập dược liệu (hạt Cúc gai) ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LA HOÀNG ANH PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOLIGNAN TRONG DƯỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM