Phân lập và sàng lọc vi khuẩn biển định hướng sinh enzyme thủy phân fucoidan từ rong nâu việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI KHUẨN BIỂN ĐỊNH HƯỚNG SINH ENZYME THỦY PHÂN FUCOIDAN TỪ RONG NÂU VIỆT NAM Giảng viên hướng dẫn :Th.S Văn Hồng Cầm Th.S Cao Thị Thúy Hằng Sinh viên thực : Nguyễn Duy Hoài An Mã số sinh viên : 54130064 Khánh Hòa: 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI KHUẨN BIỂN ĐỊNH HƯỚNG SINH ENZYME THỦY PHÂN FUCOIDAN TỪ RONG NÂU VIỆT NAM Giảng viên hướng dẫn :Th.S Văn Hồng Cầm Th.S Cao Thị Thúy Hằng Sinh viên thực : Nguyễn Duy Hoài An Mã số sinh viên : 54130064 Khánh Hòa, tháng 07/2016 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới ThS Văn Hồng Cầm ThS NCS Cao Thị Thúy Hằng Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang vô tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ em suốt thời gian thực đồ án Em xin bày tỏ lòng biết ơn toàn thể ban lãnh đạo, cán Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, đặc biệt cán phòng Hóa phân tích phòng Công nghệ sinh học tạo điều kiện hỗ trợ giúp đỡ em để em có đủ điều kiện thực đồ án Em xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, phòng đào tạo Đại học sau Đại học thầy cô Trường đại học Nha Trang tận tình dạy hướng dẫn suốt trình học làm đồ án Cuối em xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân bạn bè luôn bên, quan tâm, chia sẻ khó khăn, động viên, đốc thúc nguồn động lực to lớn để em hoàn thành đồ án Nguyễn Duy Hoài An MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu fucoidan 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Cấu trúc 1.1.3 Hoạt tính sinh học fucoidan 13 1.2 Giới thiệu fucoidanases 18 1.2.1 Khái niệm 19 1.2.2 Nguồn thu fucoidanases 19 1.2.2.1 Nguồn thu từ vi sinh vật 19 1.2.2.2 Nguồn thu từ động vật không xương sống biển 20 1.2.3 Cấu trúc 22 1.2.4 Cơ chế tác động fucoidanase 24 1.2.5 Các yếu tố dinh dưỡng môi trường ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme 26 1.2.6 Một số phương pháp xác định hoạt tính enzyme fucoidanases 29 1.2.7 Ứng dụng fucoidanase 31 1.2.8 Một số phương pháp tinh fucoidanase 32 1.2.9 Tình hình nghiên cứu sử dụng fucoidanase giới Việt Nam 34 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Vật liệu thiết bị 36 2.1.1 Mẫu vật 36 2.1.2 Hóa chất 36 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 36 2.1.4 Thiết bị 36 2.2 Phương pháp nghiên cứu 36 2.2.1 Phân lập vi khuẩn phương pháp khuẩn lạc 38 2.2.2 Sàng lọc vi khuẩn định hướng sinh enzyme đĩa thạch 38 2.2.3 Khảo sát hoạt tính dịch chiết enzyme thô tách chiết từ dịch lên men vi khuẩn định hướng sinh enzyme thủy phân fucoidan 39 2.2.4 Định danh vi khuẩn gen 16s rDNA 41 2.2.5 Khảo sát điều kiện lên men tối ưu cho vi khuẩn sinh enzyme có hoạt tính mạnh 42 CHƯƠNG KẾT QUẢ, THẢO LUẬN 46 3.1 Phân lập vi khuẩn phương pháp khuẩn lạc 46 3.2 Sàng lọc vi khuẩn định hướng sinh enzyme fucoidanase 46 3.3 Khảo sát hoạt tính dịch chiết enzyme thô từ dịch lên men vi khuẩn định hướng sinh enzyme thủy phân fucoidan 48 3.4 Định danh chủng vi khuẩn 16NT 215 50 3.5 Khảo sát điều kiện lên men tối ưu chủng 16NT 215 52 CHƯƠNG KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 62 4.1 Kết luận 62 4.2 Kiến nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 69 DANH MỤC VIẾT TẮT APS Ammonium persulphat BSA Bovine serum albumin DNA Deoxyribonucleic acid kDa Kilo Dalton M Marker OD Optical density PCR Polymerase chain reaction rRNA Ribosome ribonucleic acid C-PAGE Carbohydrate–polyacrylamide gel electrophoresis UI Unit international v/v Volume/volume w/v Weight/volume IR Infrared spectroscopy GC – EIMS Gas Chromatography with Electron Impact Mass Spectrometry LDL – C Low Density Lipoprotein-Cholesterol HDL – C High Density Lipoprotein-Cholesterol HGF Human Hepatocyte Growth Factor HIV Human Immunodeficiency Virus DVT Deep Vein thrombosis PE Pulmonary Embolism RPM Rounds Per Minute PBS Phosphate Buffered Saline ANOVA Analysis Of Variance GC/MS Gas chromatography/mass spectrometry ESI – MS Electrospray Ionisation Mass Spectrometry DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mô hình cấu trúc fucoidan từ Fucus vesiculosus Pankter 12 Hình 1.2 Mô hình cấu trúc fucoidan từ Ascophyllum nodosum 12 Hình 1.3 Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum swartzii Việt Nam 13 Hình 1.4 Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum polycystum Việt Nam 13 Hình 1.5 Số lượng công bố fucoidan fucoidanases giới 34 Hình 2.6 Sơ đồ tóm tắt toàn qui trình thực 37 Hình 2.8 Sơ đồ tóm tắt qui trình tách chiết thu enzyme thô 40 Hình 2.9 Sơ đồ tóm tắt qui trình khảo sát điều kiện lên men tối ưu 43 Hình 3.10 Sàng lọc vi khuẩn định hướng sinh enzyme thủy phân fucoidan phương pháp đĩa thạch chất fucoidan từ rong S mcclurei 47 Hình 3.11 Kết thử nghiệm hoạt tính dịch chiết enzyme thô chủng 16NT 215 49 Hình 3.12 Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1% Hình 3.16 Thử nghiệm đĩa thạch ảnh hưởng pH môi trường đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 55 Hình 3.17 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng nồng độ pepton đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 57 Hình 3.18 Thử nghiệm đĩa thạch ảnh hưởng nồng độ pepton đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 57 Hình 3.19 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng tốc độ nuôi lắc đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 59 Hình 3.20 Thử nghiệm đĩa thạch ảnh hưởng tốc độ nuôi lắc đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 59 Hình 3.22 Thử nghiệm đĩa thạch ảnh hưởng thời gian nuôi lắc đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 61 50 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng đường, sulfate uronic acid theo tỷ lệ mol fucoidan từ năm loại rong mơ Khánh Hòa (Nguyễn Duy Nhứt, 2008) 11 Bảng 1.2 Hoạt tính fucoidanases số động vật không xương sống 21 Bảng 1.3 Sự đặc hiệu chất số loại fucoidanases từ vi khuẩn biển 25 Bảng 1.4 pH nhiệt độ tối ưu cho hoạt động số enzyme thủy phân fucoidan từ vi sinh vật (Kusaykin cs., 2016) 28 Bảng 3.5 Bảng khảo sát hoạt tính enzyme thủy phân fucoidan 48 Bảng 3.6 Bảng so sánh trình tự tương đồng 16S rRNA chủng 16NT 215 ngân hàng gen NCBI 51 MỞ ĐẦU Fucoidan từ rong Nâu Việt Nam ngày biết đến rộng rãi loại thực phẩm chức với đặc tính sinh học đa dạng thú vị Fucoidan có hoạt tính đáng quí chống đông cục máu, kháng khuẩn, kháng virus (kể HIV) (Bui Huu Tai cs., 2011), chống nghẽn tĩnh mạch, chống ung thư (Nguyễn Duy Nhứt cs., 2008), chống viêm khớp, giảm mỡ máu tiến hành lâm sàng người (Nguyễn Duy Nhứt cs., 2008) Nguồn tài nguyên biển phong phú bờ biển dài 3000 km nước ta tài sản vô đáng giá Việt Nam nước có điều kiện thuận lợi cho rong biển phát triển, riêng thành phần loài rong biển Việt Nam đến xác định lên đến 800 loài, gồm ngành rong Nâu, rong Đỏ, rong Lục Trong đó, đa số chi ngành rong Nâu có sản lượng tự nhiên lớn chi Sargassum, Hormophysa, Hydroclathrus (Lê Như Hậu cs., 2009) Riêng tính sản lương rong Mơ – Sargassum sản lượng năm lên đến 20.000 khô/năm (Lê Như Hậu cs., 2009) Fucoidan rong Nâu chiếm từ – 8% trọng lượng khô (Lê Như Hậu cs., 2009) Do đó, việc khai thác nguồn polysaccharide đáng quí vô to lớn ý nghĩa Fucoidan tên đặt riêng cho sulfate polysaccharide có thành phần ngành rong Nâu mà thành phần loài thực vật hay động vật khác Fucoidan có cấu trúc hóa học phức tạp tính đa dạng liên kết glycosidic khả phân nhánh với vị trí nhóm sulfate xếp không theo quy luật mạch polymer Dựa vào lí trên, người ta cần có phương pháp hữu hiệu để cắt mạch fucoidan, phần để nghiên cứu cấu trúc chúng, ý nghĩa nhóm sulfate đặc trưng hoạt tính sinh học Phần lại để phục vụ cho mục đích chữa trị fucoidan mạch nhỏ fucoidan hấp thụ dễ dàng phân tử lớn mà giữ hoạt tính nguyên gốc sulfate Hơn nữa, việc fucoidan có phân tử khối lớn dẫn đến tính nhớt chúng dung dịch hạn chế hoạt tính sinh học Các phương pháp hóa học dùng acid đặc, kiềm đặc hay nhiệt độ cao để cắt mạch fucoidan dẫn đến khả biến tính fucoidan hoạt tính đáng quí vốn có (Cao Thị Thúy Hằng, 2011) Vì vậy, việc tìm phương pháp sinh học mà cụ thể sử dụng enzyme để cắt mạch trở nên hiệu với mục đích sử dụng fucoidan nghiên cứu Enzyme phân cắt fucoidan tìm thấy nhiều loài sinh vật biển bao gồm động vật không xương sống hay vi sinh vật biển Chúng có khả sử dụng fucoidan chất để phục vụ cho mục đích sinh trưởng phát triển Đặc biệt việc thu enzyme từ vi sinh vật có nhiều thuận lợi Vi sinh vật sinh sản phát triển với tốc độ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, tỷ lệ enzyme tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Lượng enzyme sản xuất thời gian ngắn Vì lí trên, khuôn khổ đồ án tốt nghiệp này, hỗ trợ Viện Nghiên cứu Ứng dụng Nha Trang, em thực đề tài: “Phân lập sàng lọc vi khuẩn biển định hướng sinh enzyme thủy phân fucoidan từ rong Nâu Việt Nam” Nội dung bao gồm:  Phân lập vi khuẩn biển từ nguồn sinh vật biển thuộc vùng biển Nha Trang  Sàng lọc vi khuẩn biển sinh enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan  Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn phương pháp sinh học phân tử  Lựa chọn khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để chủng vi khuẩn sinh enzyme có hoạt tính cao 78 21 16NT 172 22 16NT 173 23 16NT 174 24 16NT 176 25 16NT 177 Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Hòn Một Khuẩn lạc tròn, lớn, màu trắng, khô, dẹp, có nhân Hòn Một Khuẩn lạc tròn, lớn, trắng, lồi, bóng Hòn Một Khuẩn lạc tròn, nhỏ, lồi, bóng, vàng nhạt Hòn Một Khuẩn lạc tròn không đều, lồi, trắng Hòn Một Khuẩn lạc trắng, vừa, tròn, lồi, bóng 26 16NT 178 Ruột hải sâm Hòn Một Khuẩn lạc tròn, nhỏ, lồi, bóng, vàng nhạt 27 16NT 179 Ruột hải sâm Hòn Một Khuẩn lạc tròn, vừa, lồi, bóng, vàng nhạt 28 16NT 180 Ruột hải sâm Hòn Tre Khuẩn lạc tròn, khô, dẹp, trắng 79 sữa, viền không trơn 29 16NT 181 30 16NT 182 31 16NT 183 Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Hòn Tre Khuẩn lạc vừa, tròn, lồi, bóng, trắng vàng Hòn Tre Khuẩn lạc tròn, trắng, nhân lõm, khô, kích thước vừa, rìa Sông Lô Khuẩn lạc tròn, vừa, trắng sữa, lồi, bóng Sông Lô Khuẩn lạc to, trắng đục, tạo màng khô bề mặt Sông Lô Khuẩn lạc màu trắng, khô, nhân lồi Khuẩn lạc màu vàng, tròn, vừa, lồi, bóng 32 16NT 184 Ruột hải sâm 33 16NT 185 Ruột hải sâm 34 16NT 186 Ruột hải sâm Sông Lô Ruột hải sâm Khuẩn lạc màu trắng Sông Lô đục, khô, tâm lõm, viền không 35 16NT 187 80 trơn 36 16NT 188 37 16NT 189 Ruột hải sâm Ruột hải sâm Hòn Rùa Khuẩn lạc to, tròn, lồi, bóng, vàng Hòn Rùa Khuẩn lạc vừa, tròn, lồi, khô, vàng nhạt 38 16NT 190 Ruột hải sâm Hòn Rùa Khuẩn lạc to, tròn, nhân lồi, bóng, vàng chanh 39 16NT 191 Ruột hải sâm Hòn Rùa Khuẩn lạc tròn, vừa, vàng, khô, đỉnh nhọn Hòn Rùa Khuẩn lạc to, tròn, lồi, bóng, có màng khô, nhăn, sinh khối nhớt Hòn Rùa Khuẩn lạc tròn, nhỏ, vàng cam, khô, Hòn Rùa Khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bóng, vàng nhạt 40 16NT 192 41 16NT 193 42 16NT 194 Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm 81 43 16NT 195 44 16NT 196 45 16NT 197 46 16NT 198 Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Hòn Rùa Khuẩn lạc nhỏ, tròn, trắng đục, dẹp, khô Hòn Rùa Khuẩn lạc nhỏ, khô, rìa nhăn, màu vàng nhạt, đỉnh Hòn Rùa Khuẩn lạc vừa, trắng, tròn, lồi, có màng Hòn Rùa Khuẩn lạc nhỏ, trắng vàng, tròn, dẹp, có nhân 47 16NT 199 Ruột hải sâm Hòn Rùa Khuẩn lạc nhỏ, tròn, vàng nhạt, tâm lõm 48 16NT 200 Ruột hải sâm Hòn Rùa Khuẩn lạc to, trắng, khô, dẹp Hòn Rùa Khuẩn lạc to, trắng, bề mặt sần sùi 49 16NT 201 Ruột hải sâm 82 50 16NT 202 51 16NT 203 52 16NT 204 53 16NT 205 54 16NT 206 55 16NT 207 56 16NT 208 Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Hòn Rùa Khuẩn lạc to, tròn, vàng, khô, lồi Hòn Rùa Khuẩn lạc to, khô, dẹp, đục, màu kem, hình gần tròn, nhọn hai đầu Hòn Rùa Khuẩn lạc to,vàng, tròn, trơn, lồi, đỉnh Hòn Rùa Khuẩn lạc tròn, nhỏ li ti, vàng trơn Hòn Rùa Khuẩn lạc to, vàng tròn, bề mặt sần sùi, khô Hòn Rùa Khuẩn lạc tròn, rìa, nhăn, lồi, màu vàng Hòn Rùa Khuẩn lạc màu vàng nhạt, tròn, dẹp, có nhân 83 57 16NT 215 58 16NT 216 59 16NT 217 60 16NT 218 Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm 61 16NT 219 Ruột hải sâm 62 16NT 220 Ruột hải sâm 63 16NT 221 Ruột hải sâm Bãi Tiên Khuẩn lạc nhỏ, màu vàng nhạt, lồi, trơn Bãi Tiên Khuẩn lạc to, trắng đục, dẹp, bề mặt sần sùi Bãi Tiên Khuẩn lạc to, vàng, nhân lồi, khô Bãi Tiên Khuẩn lạc to, vàng, nhân lồi, khô, tròn không Bãi Tiên Khuẩn lạc nhỏ, màu kem, , lồi, bóng Bãi Tiên Khuẩn lạc trắng đục, dẹp, khô Bãi Tiên Khuẩn lạc to, vàng, tâm lồi, bề mặt khô 84 64 16NT 222 65 16NT 223 66 16NT 224 67 16NT 225 68 16NT 226 69 16NT 227 70 16NT 228 Bãi Tiên Khuẩn lạc to, vàng nhạt, tâm lồi, bề mặt trơn Bãi Tiên Khuẩn lạc màu trắng, tạo màng nhăn, khô, sinh khối nhớt Ruột hải sâm Bãi Tiên Khuẩn lạc màu cam, trơn, tròn, dẹp Ruột hải sâm Khuẩn lạc nhỏ, tròn, Bãi Tiên bóng , màu kem, dẹp Ruột hải sâm Bãi Tiên Khuẩn lạc tròn, vừa, trắng đục, dẹp Bãi Tiên Khuẩn lạc nhỏ, màu vàng nhạt, tròn, dẹp Bãi Tiên Khuẩn lạc dẹp, trắng đục, bề mặt khô sần sùi, to, đỉnh nhọn, không tròn Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm Ruột hải sâm 85 Một số hình ảnh cấy ria làm vi khuẩn Cấy ria vi khuẩn 16NT 221, 16NT 215 Cấy ria vi khuẩn 16NT 179, 16NT 174 Cấy ria vi khuẩn 16NT 158, 16NT 166 Cấy ria vi khuẩn 16NT 155, 16NT 154 86 Kết sàng lọc hoạt tính enzyme 21 chủng vi khuẩn Thử nghiệm hoạt tính STT Kí hiệu chủng Fucoidan rong S.mcclurei Fucoidan rong S.polycystum 16NT 154 +/- - 16NT 155 ++ + 16NT 158 + - 16NT 161 - + 16NT 166 - + 16NT 167 + - 16NT 168 ++ + 16NT 169 + - 16NT 170 + - 10 16NT 173 + + 11 16NT 174 - + 12 16NT 178 - + 13 16NT 179 ++ + 14 16NT 183 ++ + 15 16NT 203 ++ + 16 16NT 215 +++ ++ 17 16NT 221 - + 18 16NT 222 + - 19 16NT 225 - +/- 20 16NT 226 + - 21 16NT 228 - + Chú thích: + : Có hoạt tính, - : Không có hoạt tính, +/-: Không quan sát rõ 87 10 Bảng trình tự nucletotid chủng vi khuẩn 16NT 215 gagtttgatc atggctcaga ttgaacgctg gcggcaggct taacacatgc aagtcgagcg 61 gaaacgattc tagcttgcta gaaggcgtcg agcggcggac gggtgagtaa tgcatgggaa 121 tctgcccgat agtgggggac aacctgggga aactcaggct aataccgcat acgtcctacg 181 ggagaaagca ggggatcttc ggaccttgcg ctatcggatg agcccatgtc ggattagctt 241 gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatccgtagc tggtctgaga ggatgatcag 301 ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg 361 acaatgggcg aaagcctgat ccagccatgc cgcgtgtgtg aagaaggcct tcgggttgta 421 aagcactttc agcgaggaag aacgcttcgg gattaatact cccgaggaaa gacatcactc 481 gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag ggtgcaagcg 541 ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcgc gtaggtggct aagtcagcca ggtgtgaaag 601 ccccgggctc aacctgggaa cggcatctgg aactgcttgg ctagagtgca ggagaggaag 661 gtagaattcc cggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatcgg gaggaatacc agtggcgaag 721 gcggccttct ggactgacac tgacactgag gtgcgaaagc gtgggtagca aacaggatta 781 gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcaactagc cgttgggtcc cttgaggact 841 tagtggcgca gctaacgcaa taagttgacc gcctggggag tacggccgca aggttaaaac 901 tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaac 961 gcgaagaacc ttacctaccc ttgacatcca gaggactttc cagagatgga ttggtgcctt 1021 cgggaactct gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga aatgttgggt 1081 taagtcccgt aacgagcgca acccctatcc ttatttgcca gcgagtaatg tcgggaactc 1141 taaggagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggac gacgtcaagt catcatggcc 1201 cttacgggta gggctacaca cgtgctacaa tggcaagtac aaagggttgc aatacggcga 1261 cgtggagcca atcccataaa gcttgcctca gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca 1321 tgaagtcgga atcgctagta atcgtggatc agaatgccac ggtgaatacg ttcccgggcc 1381 ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tggactgcac cagaagtggt tagcctaacc 1441 ttcgggaggg cgatcaccac 88 11 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ fucoidan đến tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 Hoạt tính enzyme (mm) Nồng độ Lần Lần Lần Lần fucoidan Trung bình 0.05% 6.5 6.3 6.267 ± 0.252 0.522 Lần 0.5 OD Lần 0.517 0.513 ± 0.012 0.10% 7.5 7.4 0.15% 8 8±0 0.925 0.912 0.897 0.911 ± 0.014 0.20% 8.5 8.25 8.6 8.45 ± 0.18 1.286 1.299 1.331 1.305 ± 0.023 0.25% 2.5 2.75 2.25 2.5 ± 0.25 1.089 1.021 1.122 1.077 ± 0.052 0.30% 0.983 ± 0.225 0.953 0.966 0.945 0.955 ± 0.011 0.75 7.25 7.383 ± 0.126 0.689 0.689 0.701 Trung bình 1.2 0.693 ± 0.007 12 Bảng ANOVA ảnh hưởng nồng độ nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 13 Bảng ANOVA ảnh hưởng nồng độ nguồn cacbon đến số OD dịch nuôi cấy chủng 16NT 215 89 14 Kết khảo sát ảnh hưởng pH môi trường đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 pH 5.5 Hoạt tính enzyme (mm) OD Lần Lần Lần Lần Lần Lần Trung bình 3 4.5 4.25 4.25 4.333 ± 0.144 0.587 0.599 0.612 4.75 ± 0.15 Trung bình 0.599 ± 0.013 5.8 5.5 6.5 4.75 4.5 7 6.6 6.8 6.8 ± 0.2 1.243 1.226 1.256 1.242 ± 0.015 7.75 7.25 7.5 7.5 ± 0.25 1.598 1.489 1.598 1.562 ± 0.063 7.5 0.923 0.892 0.902 0.906 ± 0.016 5.117 ± 0.437 1.026 0.999 1.021 1.015 ± 0.014 6.3 6.1 6.333 ± 0.252 1.092 0.989 1.064 1.048 ± 0.053 8.5 6.8 6.25 6.4 6.217 ± 0.202 0.821 0.852 0.808 0.827 0.023 15 Bảng ANOVA ảnh hưởng pH môi trường đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 16 Bảng ANOVA ảnh hưởng pH môi trường đến số OD dịch nuôi cấy chủng 16NT 215 90 17 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ pepton đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 Nồng độ pepton 0% Hoạt tính enzyme (mm) Lần Lần Lần Trung bình 5.75 6.5 6.083 ± 0.382 Lần 0.333 OD Lần 0.298 Lần 0.324 0.318 ± 0.018 0.25% 7.5 7.75 7.25 7.5 ± 0.25 0.691 0.723 0.752 0.722 ± 0.031 0.50% 11 10.75 11.5 11.083 ± 0.382 1.61 1.578 1.589 1.592 ± 0.016 0.75% 10 10.25 10.25 10.167 ± 0.144 1.422 1.395 1.501 1.439 ± 0.055 1.00% 9.5 9.25 9.5 9.417 ± 0.144 1.217 1.222 1.193 1.211 ± 0.016 1.25% 8.4 8.25 8.217 ± 0.202 0.921 0.968 0.921 0.937 ± 0.027 1.50% 6.6 6.75 6.5 6.617 ± 0.126 0.872 0.799 0.825 0.832 ± 0.037 Trung bình 18 Bảng ANOVA ảnh hưởng nồng độ pepton đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 19 Bảng ANOVA ảnh hưởng nồng độ pepton đến số OD dịch nuôi cấy chủng 16NT 215 91 20 Kết khảo sát ảnh hưởng tốc độ nuôi lắc đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 Tốc độ nuôi lắc (vòng/ phút) Hoạt tính enzyme (mm) OD Lần Lần Lần Trung bình Lần Lần Lần Trung bình 80 6.4 6.5 6.3 ± 0.265 0.911 0.928 0.958 0.932 ± 0.024 100 8.2 7.5 7.75 7.817 ± 0.355 1.224 1.345 1.333 1.301 ± 0.067 120 9.3 9.5 9.75 9.517 ± 0.225 1.465 1.399 1.421 1.428 ± 0.034 140 12.5 12 11.5 12 ± 0.5 1.692 1.687 1.594 1.658 ± 0.055 160 11 11.75 11 11.25 ± 0.433 1.582 1.582 1.583 1.582 ± 0.001 180 10.5 10.25 10 10.25 ± 0.25 1.498 1.447 1.379 1.441 ± 0.06 200 9.5 8.5 ± 0.5 1.342 1.322 1.245 1.303 ± 0.051 220 8.75 8.25 ± 0.433 1.111 0.981 0.9 0.997 0.106 21 Bảng ANOVA ảnh hưởng tốc độ nuôi lắc đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 22 Bảng ANOVA ảnh hưởng tốc độ nuôi lắc đến số OD dịch nuôi cấy chủng 16NT 215 92 23 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi lắc đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 Thời gian nuôi lắc (giờ) Hoạt tính enzyme (mm) OD Lần Lần Lần Trung bình Lần Lần Lần Trung bình 0 0±0 0.048 0.021 0.05 0.04 ± 0.016 12 10 9.5 10 9.833 ± 0.289 1.352 1.364 1.289 1.335 ± 0.04 18 12.5 12 12.5 12.333 ± 0.289 1.594 1.599 1.489 1.561 ± 0.062 24 13.6 13.8 13.75 13.717 ± 0.104 1.745 1.764 1.695 1.735 ± 0.036 30 14.5 13.5 13.75 13.917 ± 0.52 1.595 1.493 1.566 1.551 ± 0.053 36 5.5 6.5 5.667 ± 0.764 1.286 1.224 1.196 1.235 ± 0.046 42 4.5 4.25 4.25 ± 0.25 0.996 1.123 1.112 1.077 ± 0.07 48 3.5 3.75 3.5 3.583 ± 0.144 0.882 0.873 0.799 0.851 0.046 24 Bảng ANOVA ảnh hưởng thời gian nuôi lắc đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng 16NT 215 25 Bảng ANOVA ảnh hưởng thời gian nuôi lắc đến số OD dịch nuôi cấy chủng 16NT 215 [...]... fucoidan từ rong Nâu Sargassum swartzii vào năm 2009 (Hình 1.3) (Nguyễn Duy Nhứt và cs., 2009) Hình 1.3 Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum swartzii ở Vi t Nam Và cấu trúc của fucoidan từ rong Nâu Sargassum polycystum vào năm 2008 (Hình 1.4) (Nguyễn Duy Nhứt, 2008) Hình 1.4 Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum polycystum ở Vi t Nam Hình 1.5 Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum polycystum ở Vi t Nam. .. từ các vi khuẩn, vi nấm biển đến các động vật biển 1.2.2.1 Nguồn thu từ vi sinh vật Vi sinh vật là một nguồn thu enzyme to lớn và hiệu quả Các nghiên cứu trước đây đã tìm ra một số loài vi sinh vật biển (vi nấm, vi khuẩn) có khả năng sinh fucoidanases Enzyme thu được từ mỗi loài khác nhau là khác nhau về các đặc tính lý hóa (pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu, cơ chất đặc hiệu, liên kết đặc hiệu,…) Fucoidanases... fucoidanases thường được phân lập từ các loại rong, trùng biển, hải sâm (Kusaykin và cs., 2016) Fucoidanases phân lập được đa số là fucoidanases nội bào Các enzyme thu được từ ba chủng vi khuẩn Pseudoalteromonas citrea (KMM 3296, KMM 3297, KMM 3298) xúc tác thủy phân liên kết α – 13 – glycosydic trong fucoidan từ rong Fucus evanescens và Laminaria cichorioides (Bakunina và cs., 2002) Trong khi đó Flavobacteriaceae... 2006, nhóm nghiên cứu enzyme của Vi n hàn lâm Nga tại Vladivostok đã đặt tên fucoidanase cho enzyme thủy phân liên kết 13 fucosidic trong fucoidan (Kusaykin và cs., 2016) Năm 2015, Silchenkoa và nhóm nghiên cứu của mình đã đặt tên fucodanase cho enzyme thủy phân fucoidan có liên kết 14 fucosidic (Silchenkoa và cs., 2015) Như vậy, vi c định nghĩa và tên gọi enzyme xúc tác thủy phân fucoidan đến nay cần... trong phân tử fucoidanases đã dẫn đến những khác nhau về tính chất hóa lí của chúng Khối lượng phân tử của fucoidanases từ các chủng vi khuẩn thường khoảng 60 đến 100 kDa (Furukawa và cs., 1992) Trong khi các fucoidanases từ nấm mốc và động vật không xương sống biển có khối lượng phân tử lớn hơn, thường từ 100 đến 200 kDa (Furukawa và cs., 1992; Wu và cs., 2011) Về khối lượng phân tử, fucoidanase từ. .. (Kusaykin và cs., 2016) 30 Phương pháp xác định độ đục Kitamikado và cs (1990) đã sử dụng phương pháp đo độ đục để xác đinh lượng enzyme thủy phân alginate trong vi sinh vật biển Phương pháp này đã được sử dụng để thích nghi với vi c xác định hoạt tính của enzyme fucoidanases Để xác định hoạt tính của fucoidanases, vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với fucoidan Sau đó, người ta cho vào môi... Flavobacteriaceae xúc tác thủy phân liên kết 14 – O – glycosidic trong fucoidan từ rong Nâu Delvetia canaliculata (Descamp và cs., 2005) Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234 cho ra enzyme thể hiện là dạng endo- α – L – fucoidanase (Takashi và cs., 2010) Fucoidanase từ Fucoidanobacter marinus chủng SI-0098 cắt mạch polymer của fucoidan từ rong Nâu Kjellmaniella crassifolia (Urvantseva và cs., 2006) Ngoài... và cs., 2011) Fucoidanases thu được từ vi sinh vật biển đa số có pH hoạt động tối ưu ở pH trung tính hoặc kiềm và chúng đa dạng ở dải nhiệt độ hoạt động (Kusaykin và cs., 2016) Enzyme từ Vibrio sp N-5 hoạt động ở 50 - 60˚C, trong khi fucoidanase từ 20 “Fucobacter marina” SA-0082 (Furukawa và cs., 1992) (Takashi và cs., 2010) lại mất hoạt tính ở 30˚C Các chủng vi khuẩn cho thấy có sự sinh tổng hợp fucoidanases... tùy thuộc vào vi sinh vật Có rất ít những công bố về fucoidanases thu được từ nấm biển Cho đến nay, chỉ có hai loại fucoidanases từ Dendryphiella arenaria TM94 và Furasium sp LD8 được phân lập và mô tả cụ thể hoạt tính xúc tác Về pH tối ưu, pH của enzyme từ nấm biển cho thấy hoạt tính tốt nhất ở pH 6.0 và nhiệt độ khoảng 50 - 60˚C (Kusaykin và cs., 2006) Khối lượng phân tử của fucoidanases từ D arenaria... tồn tại fucoidanases ngoại bào thu được từ vi sinh vật biển, điển hình là fucoidanases từ Alteromonas sp SN-1009 do nhà khoa học Nhật Bản Sakai phát hiện năm 2004 Hiện chưa có công bố về fucoidanases phân lập từ vi sinh vật trên cạn 1.2.2.2 Nguồn thu từ động vật không xương sống biển Fucoidanases có thể được thu từ nhiều ngành động vật không xương sống biển khác nhau, thể hiện ở bảng 2.2 Các enzymes