phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá cơm, mắm cá linh, mắm cá sặc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME COLLAGENASE TỪ MẮM CÁ CƠM, MẮM CÁ LINH, MẮM CÁ SẶC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU PHẠM THÁI VY MSSV: 3102796 LỚP: CNSH KHÓA 36 Cần Thơ, tháng 05 năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME COLLAGENASE TỪ MẮM CÁ CƠM, MẮM CÁ LINH, MẮM CÁ SẶC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU PHẠM THÁI VY MSSV: 3102796 LỚP: CNSH KHÓA 36 Cần Thơ, tháng 05 năm 2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. Bùi Thị Minh Diệu Phạm Thái Vy DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Trong trình thực đề tài, nhận giúp đỡ tận tình bậc sinh thành, quý thầy cô, anh chị bạn sinh viên. Xin gửi lời cám ơn chân thành đến: Cha mẹ tôi, người có công nuôi nấng dưỡng dục, dạy bảo, tạo điều kiện vật chất để yên tâm chuyên lo học hành cho lời khuyên gặp khó khăn công việc sống. Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập thực đề tài luận văn. Ts. Bùi Thị Minh Diệu tận tình hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ đến hoàn thành đề tài luận văn. Tập thể thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho suốt trình học tập Trường Đại học Cần Thơ. Tập thể cán sinh viên phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật, phòng Hóa sinh thực phẩm tạo điều kiện, hỗ trợ trang thiết bị cần thiết cho trình thực đề tài chia sẻ kinh nghiệm, động viên giúp hoàn thành tốt đề tài luận văn này. Cần Thơ, ngày tháng Sinh viên thực Phạm Thái Vy năm 2014 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Collagen có nhiều ứng dụng lĩnh vực thực phẩm, y học, dược phẩm mỹ phẩm. Trên thực tế, collagen loại protein quan trọng cấu trúc thể động vật da, xương. Việt nam, với lợi quốc gia có nông - ngư nghiệp phát triển, hàng năm thải môi trường hàng phụ - phế phẩm (Theo Tổng cục thống kê, tính đến tháng năm 2014 86.340 phụ - phế phẩm cá Tra/Basa ) nên việc tận dụng collagen từ thể động vật, đặc biệt nguồn phế thải trình sản xuất thủy sản đem lại giá trị kinh tế. Hiện nay, việc tách chiết collagen phương pháp sinh học trọng đầu tư, nghiên cứu. Một bước nghiên cứu tìm kiếm nguồn sinh vật sản xuất enzyme collagenase hiệu quả. Hệ vi sinh vật chứa lượng enzyme collagenase phong phú. Do đó, việc chọn dòng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme collagenase bước khởi đầu cần thiết. Từ ba mẫu mắm cá cơm, mắm cá linh mắm cá sặc phân lập 41 dòng vi khuẩn hiếu khí có khả sinh tổng hợp enzyme collagenase hai loại môi trường gelatin (giai đoạn phân lập) collagen (giai đoạn sau tách ròng). Đa số khuẩn lạc có dạng không đều, độ mô, dạng bìa nguyên, màu trắng đục. Vi khuẩn có thời gian phát triển trung bình, phần lớn hình cầu. Dựa vào kết kích thước vòng phân giải cho dịch enzyme thô vi khuẩn tương tác với chất collagen, tác động thuốc thử TCA 35%, xác định 19 số 41 dòng vi khuẩn phân lập cho hoạt tính enzyme collagenase. Hoạt tính enzyme xác định phương pháp Ninhydrin đo qua bốn ngày, dòng CV41 cho hoạt tính cao (2,85 U/ml) ngày thứ hai, dòng CV37 (hoạt tính 2,03 U/ml) ngày thứ hai dòng CV32 (hoạt tính U/ml) ngày thứ ba. Cả ba dòng vi khuẩn CV32, CV37, CV41 thuộc nhóm Gram âm, di động hình dạng khác nhau; dòng CV32 CV37 hình cầu, dòng CV41 hình que ngắn. Ba dòng vi khuẩn phản ứng dương tính với thử nghiệm amylase catalase; phản ứng âm tính với thử nghiệm Methyl Red Voges Proskauer. Thử nghiệm Indol, dòng CV37 cho phản ứng dương tính, dòng CV32 CV41 cho phản ứng âm tính. Từ khóa: Collagen, enzyme collagen, gelatin, mắm cá cơm, mắm cá linh, mắm cá sặc. Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ . TÓM LƯỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG . v DANH SÁCH HÌ NH . vi TỪ VIẾT TẮT .vii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU . 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu đề tài . CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc collagen . 2.1.1. Giới thiệu sơ lƣợc collagen. 2.1.2. Cấu trúc collagen. . 2.1.2.1. Cấu trúc phân tử collagen . 2.1.2.2. Thành phần acid amin . 2.1.3. Phân loại collagen. . 2.1.4. Ứng dụng collagen 2.1.4.1. Trong công nghiệp thực phẩm . 2.1.4.2. Trong y học dƣợc phẩm 2.1.4.3. Trong mỹ phẩm . 2.1.5. Sơ lƣợc gelatin 2.2. Sơ lƣợc enzyme collagenase . 2.2.1. Định nghĩa enzyme collagenase 2.2.2. Nguồn enzyme collagenase số tính chất 10 2.2.2.1. Enzyme collagenase mô 10 2.2.2.2. Enzyme collagenase vi sinh vật 11 2.2.3. Một số tính chất enzyme collagenase . 14 Chuyên ngành Công nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 2.2.3.1. Kích thƣớc cấu trúc phân tử . 14 2.2.3.2. Độ bền enzyme 14 2.2.3.3. Tính đặc hiệu enzyme . 15 2.2.4. Một số ứng dụng enzyme collagenase 16 2.2.4.1. Trong nghiên cứu tách chiết collagen . 16 2.2.4.2. Trong công nghiệp thực phẩm . 17 2.2.4.3. Trong y học, dƣợc phẩm mỹ phẩm . 19 2.2.5. Tình hình nghiên cứu enzyme collagenase giới Việt Nam 21 2.2.5.1. Nghiên cứu enzyme collagenase giới . 21 2.2.5.2. Nghiên cứu enzyme collagenase Việt Nam . 22 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1. Thời gian, địa điểm 23 3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu . 23 3.2.1. Vật liệu thí nghiệm 23 3.2.2. Thiết bị hóa chất . 23 3.2.2.1. Thiết bị . 23 3.2.2.2. Hóa chất . 24 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu . 25 3.3.1. Phân lập vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme collagenase môi trƣờng Czapek cải tiến 25 3.3.2. Đánh giá khả sinh tổng hợp enzyme collagenase dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 27 3.3.3. Xác định hoạt tính enzyme collagenase dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn 28 3.3.4. Xác định số đặc tính hình thái sinh hóa dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn . 30 3.3.4.1. Xác định số đặc tính hình thái 30 3.3.4.2. Xác định số đặc tính sinh hóa . 31 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1. Phân lập vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme collagenase Chuyên ngành Công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT từ mắm cá cơm, mắm cá linh mắm cá sặc . 32 4.1.1. Số lƣợng dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 32 4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 32 4.2. Đánh giá tuyển chọn số dòng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme collagenase từ dòng vi khuẩn phân lập đƣợc . 34 4.3. Hoạt tính enzyme collagenase dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn 37 4.4. Một số đặc tính hình thái, sinh hóa dòng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme collagenase mạnh đƣợc tuyển chọn 39 4.4.1. Đặc tính hình thái 39 4.4.2. Đặc tính sinh hóa . 40 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1. Kết luận 42 5.2. Đề nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 43 PHỤ LỤC . PHỤ LỤC 1. HÌNH ẢNH 1. Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trình thực thí nghiệm 2. Một số hình ảnh trình thực thí nghiệm PHỤ LỤC 2: PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH VI KHUẨN PHỤ LỤC 3. ĐỒNG NHẤT MẬT SỐ VI KHUẨN PHỤ LỤC 4. SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM PHỤ LỤC 5. KẾT QUẢ THỐNG KÊ 1. Kết thống kê xác định đƣờng kính vòng phân giải 2. Kết thống kê xác định hoạt tính enzyme collagenase Chuyên ngành Công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Thành phần phần trăm ba acid amin phân tử collagen . Bảng 2. Kết cấu chuỗi phân bố loại collagen thể ngƣời . Bảng 3. Thành phần phần trăm acid amin thu đƣợc thủy phân 100g gelatin . Bảng 4. Một số enzyme collagenase có nguồn gốc từ mô 11 Bảng 5. Một số enzyme collagenase có nguồn gốc từ vi sinh vật . 13 Bảng 6. Thành phần hóa chất môi trƣờng Czapek cải tiến 24 Bảng 7. Thành phần môi trƣờng tăng sinh 24 Bảng 8. Nồng độ pha loãng . 26 Bảng 9. Nồng độ pha dung dịch leucine 29 Bảng 10. Thành phần hóa chất dựng đƣờng chuẩn leucine . 29 Bảng 11. Số lƣợng dòng vi khuẩn theo nguồn gốc phân lập . 32 Bảng 12. Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập đƣợc . 32 Bảng 13. Hoạt tính enzyme collagenase theo thời gian dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn . 38 Bảng 14. Kết nhuộm Gram ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 39 Bảng 15. Kết thử nghiệm số đặc tính sinh hóa ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 40 Chuyên ngành Công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Cấu trúc phân tử collagen . Hình 2. Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử chuỗi polypeptide Hình 3. Trật tự xếp acid amin phân tử collagen . Hình 4. Cấu trúc sợi collagen Hình 5. Hanamai Collagen . Hình 6. Một số mỹ phẩm chứa collagen Hình 7. Cấu trúc Gly - X - Y phân tử gelatin Hình 8. Pseudomonas sp., C. Histolyticum Aspergillus oryzae . 13 Hình 9. Bệnh co cứng Dupuytren 19 Hình 10. Các bƣớc giai đoạn nhuộm Gram. 31 Hình 11. Hình thái khuẩn lạc số dòng vi khuẩn 34 Hình 12. Vòng phân giải dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme collagenase 35 Hình 13. Biểu đồ thể khả sinh tổng hợp enzyme collagenase dòng vi khuẩn 36 Hình 14. Kết nhuộm Gram ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 40 Hình 15. Kết số đặc tính sinh hóa ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn . 41 Chuyên ngành Công nghệ sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 2. Một số hình ảnh trình thực thí nghiệm A B Hình 19. Gelatin dạng tinh thể (A) bột collagen (B) Hình 20. Dịch vi khuẩn dòng CV41 trƣớc sau tăng sinh nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút CV41 CV37 CV41 ĐC CV37 Hình 21. Vòng phân giải số dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme gelatinase Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Hình 22. Phản ứng màu Ninhydrin (1). Cho dung dịch Ninhydrin vào. (2). Dung dịch bắt đầu chuyển sang màu tím. (3). Màu đậm sau ủ lắc. (4). Định mức đến 10ml để đo OD. ĐC Hình 23. Dãy ống nghiệm dựng đƣờng chuẩn (0,1-0,5µg/ml) PHỤ LỤC 2: PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH VI KHUẨN 1. Xác định số đặc tính hình thái vi khuẩn Quan sát hình thái vi khuẩn Tiến hành quan sát hình dạng, khả chuyển động vi khuẩn phương pháp giọt ép xác định kính hiển vi quang học. Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn sau: - Nhỏ 20µl nước cất vô trùng lên kính mang vật. - Kim cấy khử trùng lửa đèn cồn để nguội. - Dùng kim cấy lấy khuẩn lạc trải lên giọt nước kính mang vật. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT - Dùng kính đậy vật, đậy lên giọt nước cách để cạnh kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật góc 45º, hạ kính đậy vật xuống từ từ nhẹ nhàng cho mẫu vật bọt khí. Quan sát vật kính x100. Nhuộm Gram vi khuẩn Các bước nhuộm Gram:  Làm tiêu - Nhỏ giọt nước khử trùng lên lame. - Dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn từ khuẩn lạc rời cho vào giọt nước, trải thật mỏng theo hình xoắn ốc. - Hơ nóng mặt lame lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn.  Nhuộm tiêu - Nhỏ - giọt Crystal violet từ mẫu cố định, để 60 giây. Rửa nước vài giây. - Nhỏ dung dịch Iod, để 60 giây. Rửa nước, sau rửa cồn rửa lại nước. - Nhỏ - giọt Fushin hay Safranin, để 60 giây. Rửa nước vài giây. - Làm khô nước giấy thấm hơ lửa đèn cồn. - Quan sát kính hiển vi vật kính x100. (*Nguồn: Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2009) 2. Xác định số đặc tính sinh hóa  Thử nghiệm Amylase Mục đích: Phát dòng vi khuẩn có hệ enzym amylase từ dòng mạnh tuyển chọn. Nguyên tắc: Vi khuẩn có hoạt tính amylase phân cắt tinh bột tạo thành phân tử glucose, nên nhỏ dung dịch Iod không tạo thành màu xanh tím đặc trưng. Với vi khuẩn hoạt tính amylase xảy phản ứng tinh bột Iod cho màu xanh tím. Cách tiến hành: Chủng 1ml vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 1ml nước muối 0,1%. Cho 1ml tinh bột 0,1% vào, lắc đều, ủ nhiệt độ 30°C 30 phút, lấy nhỏ - giọt dung dịch Iod. Và đọc kết quả: - Dương tính (+): Mất màu hỗn hợp tinh bột Iod. - Âm tính (-): Hỗn hợp có màu xanh tím đặc trưng. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT  Thử nghiệm Catalase Mục đích: Phát các dòng vi khuẩn có hệ enzym catalase từ dòng mạnh tuyển chọn. Nguyên tắc: Enzyme catalase diện vi khuẩn hiếu khí kỵ khí tùy ý. Với vi khuẩn có hoạt tính enzyme catalase xuất bọt khí có diện hydrogen peroxide (H2O2). enzyme catalase H 2O H2O + O2 (bọt khí) Cách tiến hành: Nhỏ - giọt H2O2 3% lên lame chứa dịch vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy lỏng quan sát kết quả: - Dương tính (+): Có tượng sủi bọt khí. - Âm tính (-): Không xảy tượng sủi bọt khí.  Thử nghiệm Indol Mục đích: Phát dòng vi khuẩn có khả sinh Indol (có hệ enzyme tryptophanase) từ dòng mạnh tuyển chọn. Nguyên tắc: Tryptophan acid amin bị oxy hóa số vi khuẩn có hệ enzyme tryptophanase tạo nên sản phẩm chứa gốc Indol. Việc phát Indol thực phản ứng phân tử với thuốc thử Kovac’s chứa gốc p - Dimethylaminbenzaldehyde (p - DMABA) tạo nên phức chất dạng quinone màu đỏ. Các tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm môi trường lỏng Tryptone. Dùng que cấy lấy lượng nhỏ khuẩn lạc cho vào môi trường, ủ nhiệt độ 37oC 24 giờ. Thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm chứa dịch nuôi vi khuẩn, lắc nhẹ. Đọc kết quả: - Dương tính (+): Xuất màu đỏ bề mặt môi trường. - Âm tính (-): Xuất màu vàng bề mặt môi trường.  Thử nghiệm Methyl Red (MR) Mục đích: Phát dòng vi khuẩn sản xuất trì acid bền trình lên men glucose từ dòng mạnh tuyển chọn. Nguyên tắc: Chỉ thị pH Methyl Red giúp phân biệt nồng độ H+ diện môi trường sau vi khuẩn lên men glucose. Chỉ thị thay đổi màu sau: - pH < 4,4: Màu đỏ Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT - pH 5,0 - 5,8: Màu cam - pH > 6,0: Màu vàng Glucose + H2O  Lactic acid + Acetic acid + Ethanol + Formic acid Cách tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm môi trường lỏng Glucose Phosphate (MR- VP Broth). Dùng que cấy lấy lượng nhỏ khuẩn lạc cho vào môi trường lỏng MR - VP, ủ nhiệt độ 37oC - ngày. Thêm vài giọt thuốc thử MR vào ống nghiệm chứa dịch nuôi vi khuẩn. Đọc kết ngay: - Dương tính (+): Môi trường có màu đỏ. Càng kéo dài thời gian nuôi cấy môi trường acid. - Âm tính (-): Môi trường có màu vàng. Càng kéo dài thời gian nuôi cấy chất bị chuyển hóa, môi trường dần trung tính. - Trường hợp màu cam, tiếp tục ủ ống môi trường chứa giống, sau nhỏ thuốc thử lại.  Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) Mục đích: Phát dòng vi khuẩn tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trình lên men glucose từ dòng mạnh tuyển chọn. Nguyên tắc: Trong trình lên men glucose, vi khuẩn cho sản phẩm cuối khác nhau, số acetoin. Khi bổ sung vào môi trường vài giọt dung dịch KOH 40%, acetoin tạo phức màu hồng. Glucose + ½ O2  2,3 - butanediol + H2O + 2CO2 2,3 - butanediol dehydrogenase 2,3 - butanediol Acetoin Cách tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm môi trường lỏng Glucose Phosphate (MR - VP Broth). Dùng que cấy lấy lượng nhỏ khuẩn lạc cho vào môi trường lỏng MR - VP, ủ nhiệt độ 37oC 48 giờ. Thêm vài giọt thuốc thử KOH 40% vào ống nghiệm chứa dịch nuôi vi khuẩn, lắc nhẹ. Đọc kết sau 20 phút chậm giờ. - Dương tính (+): Xuất màu đỏ bề mặt môi trường. - Âm tính (-): Trên bề mặt môi trường không đổi màu. (*Nguồn: Nguyễn Văn Hạnh, 2009) Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT PHỤ LỤC 3. ĐỒNG NHẤT MẬT SỐ VI KHUẨN Bảng 16. Mật số vi khuẩn sau 48 tăng sinh môi trƣờng bổ sung gelatin nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút chuẩn bị xác định khả sinh tổng hợp enzyme gelatinase. Số khuẩn lạc STT Dòng VK Trung bình Lần Lần Lần Mật số VK Ghi (CFU/ml) CV1 6,67 133,4 x1011 CV2 5,67 113,4 x1011 CV3 80 x1011 CV4 80 x1011 CV5 10 12 10 200 x1011 CV6 3,67 73,4 x1011 CV7 41 46 48 45 900 x1011 CV8 3,33 66,6 x1011 CV9 60 x1011 10 CV10 10 33 47 30 600 x1011 11 CV11 10 7,67 153,4 x1011 12 CV12 60 61 69 63,33 1266,6 x1011 13 CV13 3,33 66,6 x1011 14 CV14 8,33 166,6 x1011 15 CV15 4,67 93,4 x1011 16 CV16 3,67 73,4 x1011 17 CV17 11 7,33 146,6 x1011 18 CV18 20 x1011 19 CV19 12 13 11 220 x1011 20 CV20 11 25 38 24,67 493,4 x1011 21 CV21 10 12 15 12,33 246,6 x1011 22 CV22 15 16 12,33 246,6 x1011 23 CV23 3,67 73,4 x1011 24 CV24 80 x1011 25 CV25 1,3 2,6 x1011 26 CV26 15 10,67 213,4 x1011 27 CV27 3,67 73,4 x1011 28 CV28 100 x1011 29 CV29 40 x1011 30 CV30 20 x1011 31 CV31 3,67 73,4 x1011 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 32 CV32 2,33 46,6 x1011 33 CV33 1,67 33,4 x1011 34 CV34 40 x1011 35 CV35 120 x1011 36 CV36 4,67 93,4 x1011 37 CV37 3,67 73,4 x1011 38 CV38 6,67 133,4 x1011 39 CV39 45 47 49 47 940 x1011 40 CV40 7,67 153,4 x1011 41 CV41 15 17 26 19,33 386,6 x1011 Bảng 17. Mật số vi khuẩn sau 48 tăng sinh môi trƣờng bổ sung collagen nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút chuẩn bị xác định khả sinh tổng hợp enzyme collagenase. Số khuẩn lạc STT Dòng VK Trung bình Mật số VK Ghi (CFU/ml) Lần Lần Lần CV1 2,33 46,6 x1011 CV2 20 x1011 CV3 13 15 10,67 213,4 x1011 CV4 2,33 46,6 x1011 CV5 39 45 48 44 880 x1011 CV6 1,33 26,6 x1011 CV7 20 x1011 CV8 1,67 23,4 x1011 CV9 10 12 12 11,33 226,6 x1011 10 CV10 1,33 26,6 x1011 11 CV11 12 21 26 19,67 393,4 x1011 12 CV12 11 13 14 12,67 253,4 x1011 13 CV13 7,67 153,4 x1011 14 CV14 14 16 17 15,67 313,4 x1011 15 CV15 13 21 14,33 286,6 x1011 16 CV16 1,33 26,6 x1011 17 CV17 2,67 53,4 x1011 18 CV18 15 19 24 19,33 386,6 x1011 19 CV19 6,33 126,6 x1011 20 CV20 16 19 21 18,67 373,4 x1011 21 CV21 14 16 21 17 340 x1011 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 22 CV22 40 x1011 23 CV23 2,33 46,6 x1011 24 CV24 20 x1011 25 CV25 2,67 53,4 x1011 26 CV26 20 21 25 40 x1011 27 CV27 58 62 65 61,67 1233,4 x1011 28 CV28 11 9,67 193,4 x1011 29 CV29 27 29 33 29,67 593,4 x1011 30 CV30 1,33 26,6 x1011 31 CV31 20 x1011 32 CV32 40 x1011 33 CV33 0,67 13,4 x1011 34 CV34 1,33 26,6 x1011 35 CV35 36 41 46 41 820 x1011 36 CV36 72 73 76 73,67 1473,4 x1011 37 CV37 20 x1011 38 CV38 18 20 15 300 x1011 39 CV39 1,7 34 x1011 40 CV40 3,33 66,6 x1011 41 CV41 80 85 86 83,67 1673,4 x1011 Bảng 18. Mật số vi khuẩn sau 48 tăng sinh môi trƣờng bổ sung collagen nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút chuẩn bị xác định hoạt tính enzyme collagenase. Khuẩn lạc STT Dòng VK Trung Mật số VK Ghi Lần Lần Lần bình (CFU/ml) CV2 1,33 26,6 x1011 CV3 11 12 15 12,67 253,4 x1011 CV5 30 37 41 36 720 x1011 CV7 1,33 26,6 x1011 CV8 2,67 53,4 x1011 CV10 1,67 33,4 x1011 CV11 19 21 21 20,33 406,6 x1011 CV16 1,67 33,4 x1011 CV17 2,67 53,4 x1011 10 CV18 16 20 26 20,67 406,6 x1011 11 CV22 40 x1011 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 12 CV23 3,67 113,4 x1011 13 CV32 2,67 53,4 x1011 14 CV33 20 x1011 15 CV35 39 42 45 42 840 x1011 16 CV37 20 x1011 17 CV39 1,33 26,6 x1011 18 CV40 80 x1011 19 CV41 76 85 91 84 1680 x1011 PHỤ LỤC 4. SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM Bảng 19. Kết đo đƣờng kính vòng phân giải chất gelatin STT Dòng vi khuẩn CV1 Đƣờng kính vòng Đƣờng kính vòng STT Dòng vi khuẩn 17,67 21 CV21 6,33 CV2 7,33 22 CV22 6,67 CV3 6,33 23 CV23 7,33 CV4 0,33 24 CV24 8,33 CV5 5,67 25 CV25 11,33 CV6 10,67 26 CV26 CV7 5,67 27 CV27 17,67 CV8 28 CV28 9,67 CV9 17,67 29 CV29 13 10 CV10 30 CV30 1,67 11 CV11 13,33 31 CV31 12 CV12 7,67 32 CV32 13 CV13 28,33 33 CV33 17 14 CV14 10,33 34 CV34 4,67 15 CV15 17 35 CV35 16,67 16 CV16 12 36 CV36 15,67 17 CV17 10 37 CV37 8,33 18 CV18 7,33 38 CV38 6,67 19 CV19 19,67 39 CV39 5,33 20 CV20 15 40 CV40 41 CV41 phân giải (mm) Chuyên ngành Công nghệ sinh học phân giải (mm) Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Bảng 20. Kết đo đƣờng kính vòng phân giải chất collagen STT Dòng vi khuẩn Đƣờng kính vòng phân giải (mm) STT Dòng vi khuẩn Đƣờng kính vòng phân giải (mm) CV2 6,33 11 CV22 0,33 CV3 12 CV23 5,33 CV5 8,67 13 CV32 6,33 CV7 1,33 14 CV33 1,67 CV8 15 CV35 CV10 16 CV37 7,67 CV11 3,33 17 CV39 4,33 CV16 1,33 18 CV40 1,33 CV17 1,67 19 CV41 14 10 CV18 7,67 Bảng 21. Giá tri OD dung dịch leucine chuẩn. [Leucine] nghiệm (mg/ml) Lần Lần Lần 0,069 0,070 0,070 0,070 0,1 0,439 0,422 0,462 0,441 0,2 0,649 0,65 0,661 0,653 0,3 0,984 0,979 0,963 0,975 0,4 1,125 1,123 1,127 1,125 0,5 1,511 1,499 1,509 1,506 Giá trị đo OD bƣớc sóng 570nm Ống OD 570nm 1,6 1,4 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 Trung bình y = 2,729x + 0,112 R² = 0,989 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Nồng độ leucine (µg/ml) Hình 24. Biểu đồ đƣờng chuẩn leucine Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Bảng 22. Kết xác định hoạt tính enzyme collagenase Ngày Kết đo OD 570nm STT Dòng VK Trung [leucine] Hoạt tính Lần Lần Lần bình (U/ml) CV2 0,264 0,297 0,284 0,282 0.062 0,517 CV5 0,356 0,405 0,374 0,379 0,098 0,817 CV18 0,596 0,581 0,579 0,585 0,173 1,442 CV32 0,597 0,502 0,523 0,541 0,157 1,308 CV37 0,420 0,427 0,415 0,421 0,113 0,942 CV41 0,790 0,756 0,770 0,772 0,242 2,017 Ngày Kết đo OD 570nm STT Dòng VK Trung Lần Lần Lần bình [leucine] Hoạt tính (U/ml) CV2 0,578 0,517 0,593 0,563 0,165 1,375 CV5 0,693 0,695 0,698 0,695 0,214 1,783 CV18 0,736 0,718 0,759 0,738 0,229 1,908 CV32 0,711 0,706 0,699 0,705 0,217 1,808 CV37 0,814 0,767 0,754 0,778 0,244 2,033 CV41 1,017 1,008 1,110 1,045 0,342 2,85 Ngày Kết đo OD 570nm STT Dòng VK Trung [leucine] Hoạt tính Lần Lần Lần bình (U/ml) CV2 0,723 0,731 0,742 0,732 0,227 1,892 CV5 0,570 0,551 0,543 0,555 0,162 1,350 CV18 0,670 0,693 0,657 0,673 0,206 1,717 CV32 0,761 0,759 0,782 0,767 0,240 2,000 CV37 0,518 0,520 0,523 0,520 0,150 1,250 CV41 0,606 0,624 0,614 0,615 0,184 1,533 Ngày STT Kết đo OD 570nm Dòng VK CV2 Trung Lần Lần Lần bình 0,314 0,321 0,306 0,314 Chuyên ngành Công nghệ sinh học [leucine] 0,074 Hoạt tính (U/ml) 0,617 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT CV5 0,213 0,203 0,178 0,198 0,032 0,267 CV18 0,496 0,461 0,429 0,462 0,128 1,067 CV32 0,479 0,452 0,465 0,465 0,129 1,075 CV37 0,224 0,290 0,290 0,268 0,057 0,475 CV41 0,496 0,512 0,499 0,502 0,143 1,192 PHỤ LỤC 5. KẾT QUẢ THỐNG KÊ 1. Kết thống kê xác định đường kính vòng phân giải. One-way ANOVA: ĐK vòng phân giải versus Dòng VK Source DF SS MS F P Dòng VK 18 715,65 39,76 5,05 0,000 Error 38 299,33 7,88 Total 56 1014,98 S = 2,807 R-Sq = 70,51% R-Sq(adj) = 56,54% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+---- CV10 1,000 1,000 CV11 3,333 0,577 CV16 1,333 0,577 (----*-----) CV17 1,667 0,577 (-----*----) CV18 7,667 1,528 CV2 6,333 3,215 CV22 0,333 0,577 CV23 5,333 0,577 CV3 1,000 1,732 CV32 6,333 1,528 CV33 1,667 1,528 CV35 1,000 0,000 CV37 7,667 6,658 CV39 4,333 2,082 CV40 1,333 0,577 CV41 14,000 7,000 CV5 8,667 4,933 CV7 1,333 0,577 CV8 2,000 2,000 (-----*----) (-----*----) (-----*----) (-----*----) (-----*----) (-----*----) (-----*----) (-----*----) (-----*----) (-----*----) (-----*----) (----*-----) (----*-----) (----*-----) (----*-----) (----*-----) (----*-----) -----+---------+---------+---------+---0,0 6,0 12,0 18,0 Pooled StDev = 2,807 Grouping Information Using Fisher Method Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Dòng VK N Mean Grouping CV41 14,000 CV5 8,667 B CV37 7,667 B C CV18 7,667 B C CV32 6,333 B C D CV2 6,333 B C D CV23 5,333 B C D E CV39 4,333 B C D E F CV11 3,333 C D E F CV8 2,000 D E F CV33 1,667 E F CV17 1,667 E F CV7 1,333 E F CV40 1,333 E F CV16 1,333 E F CV35 1,000 E F CV3 1,000 E F CV10 1,000 E F CV22 0,333 F A Means that not share a letter are significantly different. 2. Kết thống kê xác định hoạt tính One-way ANOVA: Hoạt độ (U/ml) versus Ngày Source DF SS MS F P 4,23301 0,84660 136,13 0,000 Error 12 0,07463 0,00622 Total 17 4,30763 N1 S = 0,07886 R-Sq = 98,27% R-Sq(adj) = 97,55% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev CV18 1,4453 0,0284 CV2 0,5180 0,0509 CV32 1,2990 0,1585 CV37 0,9427 0,0186 CV41 2,0153 0,0518 CV5 0,8133 0,0759 --+---------+---------+---------+------(-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (-*-) --+---------+---------+---------+------0,50 1,00 1,50 2,00 Pooled StDev = 0,0789 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Grouping Information Using Fisher Method N1 N Mean Grouping CV41 2,0153 CV18 1,4453 CV32 1,2990 CV37 0,9427 D CV5 0,8133 D CV2 0,5180 A B C E Means that not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: Hoạt độ (U/ml) versus Ngày Source DF SS MS F P 3,58034 0,71607 73,23 0,000 Error 12 0,11734 0,00978 Total 17 3,69768 N2 S = 0,09889 R-Sq = 96,83% R-Sq(adj) = 95,50% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev CV18 1,9103 0,0632 CV2 1,3763 0,1228 CV32 1,8120 0,0191 CV37 2,0347 0,0968 CV41 2,8493 0,1726 CV5 1,7813 0,0081 -----+---------+---------+---------+---(-*--) (--*-) (-*--) (--*-) (--*-) (--*-) -----+---------+---------+---------+---1,50 2,00 2,50 3,00 Pooled StDev = 0,0989 Grouping Information Using Fisher Method N2 N Mean Grouping CV41 2,8493 CV37 2,0347 B CV18 1,9103 B C CV32 1,8120 C CV5 1,7813 C CV2 1,3763 A D Means that not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: Hoạt độ (U/ml) versus Ngày Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Source Trường ĐHCT DF SS MS F P 1,34134 0,26827 199,14 0,000 Error 12 0,01617 0,00135 Total 17 1,35751 N3 S = 0,03670 R-Sq = 98,81% R-Sq(adj) = 98,31% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev CV18 1,7140 0,0557 CV32 2,0013 0,0388 CV37 1,2470 0,0075 CV41 1,5347 0,0275 CV5 1,3520 0,0426 --+---------+---------+---------+------CV2 1,8933 0,0291 (-*-) (-*-) (-*-) (*-) (-*-) --+---------+---------+---------+------1,25 1,50 1,75 2,00 Pooled StDev = 0,0367 Grouping Information Using Fisher Method N3 N Mean CV32 2,00133 CV2 1,89333 CV18 1,71400 CV41 1,53467 CV5 1,35200 CV37 1,24700 Grouping A B C D E F Means that not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: Hoạt độ (U/ml) versus Ngày Source DF SS MS F P 4,613 0,923 5,00 0,011 Error 12 2,216 0,185 Total 17 6,829 N4 S = 0,4297 R-Sq = 67,55% R-Sq(adj) = 54,03% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+----- CV18 1,0690 0,1025 (------*-------) Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 CV2 0,6157 0,0230 CV32 1,0790 0,0415 CV37 0,4767 0,1166 CV41 1,8010 1,0385 CV5 0,2623 0,0552 Trường ĐHCT (-------*-------) (------*-------) (-------*-------) (-------*------) (-------*------) ----+---------+---------+---------+----0,00 0,70 1,40 2,10 Pooled StDev = 0,4297 Grouping Information Using Fisher Method N4 N Mean Grouping CV41 1,8010 A CV32 1,0790 A B CV18 1,0670 A B CV2 0,6157 B C CV37 0,4767 B C CV5 0,2623 C Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học [...]... để phân lập vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase hiệu quả Vì vậy, đề tài Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá cơm, mắm cá linh, mắm cá sặc được thực hiện 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài được thực hiện với mục tiêu phân lập để tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase Chuyên ngành Công nghệ sinh. .. 3.3.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase trên môi trƣờng Czapek cải tiến Mục đích: Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase phát triển trên hai môi trường chứa gelatin và môi trường chứa collagen Nguyên tắc: Chọn những khuẩn lạc phát triển được trên môi trường chứa gelatin sau khi cấy trải, tiến hành cấy chuyển đến khi tách ròng từng dòng vi khuẩn. .. khác Thêm vào lợi thế của enzyme vi sinh vật thường có khoảng hoạt động rộng hơn và khả năng phân cắt mạnh hơn đối với nhiều enzyme khác Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase được phát hiện phần lớn phân lập từ môi trường đất như C histolyticum, P marinoglutinosa, Pseudomonas sp Tuy nhiên, những vi sinh vật này lại sinh ra độc tố (Kawahara, 1993) Bên cạnh đó, cũng có một số vi sinh vật... enzyme ngoại bào thực sự, nghĩa là chúng được tiết ra ngoài môi trường và không có mặt trong dịch thủy phân của tế bào Chức năng thứ hai của enzyme collagenase thể hiện phổ biến ở đa số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase (chức năng dinh dưỡng) Enzyme collagenase phân cắt phân tử collagen thành các đoạn peptide nhỏ hơn, tạo điều kiện cho các enzyme peptidase phân cắt tiếp tục các... enzyme collagenase vào sản xuất để kiểm tra tính an toàn của chế phẩm, khả năng phân hủy collagen, khả năng làm mềm thịt, khả năng phân hủy một số protein dị ứng và sử dụng enzyme collagenase trong sản xuất nước mắm bằng cách thăm dò khả năng phân hủy da cá của enzyme collagenase thương phẩm với enzyme collagenase của Bacillus subtilis FS-2 sau 4 tháng ướp chượp Chuyên ngành Công nghệ sinh học 22 Vi n... trong vi c phân lập các tế bào cơ tim Sự phân tách các mô được tiến hành bằng cách ngâm nguyên vẹn cơ quan trong dung dịch enzyme, trong đó enzyme collagenase được chọn lựa hoặc một mình hoặc kết hợp với một enzyme khác chẳng hạn enzyme hyaluronidase hoặc trypsin Enzyme collagenase có thể được sử dụng khi phân tách một cách hoàn toàn bằng cách ngâm mô nhỏ vào dịch enzyme Phân lập các tế bào gan: Các... A, enzyme collagenase A, collagenase I Vi sinh vật không chứa collagen nhưng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, các nhà nghiên cứu đã thu được enzyme collagenase vào năm 1937 (Seifter và Harper, 1971) Dựa vào đó, có thể đưa ra nhận định sự có mặt enzyme collagenase trong môi trường nuôi cấy do hai chức năng liên quan: chức năng liên quan tới cơ chế ký sinh của vi sinh vật vào tế bào chủ và chức năng. .. chế dinh dưỡng của vi sinh vật Chức năng đầu của enzyme collagenase ở các vi sinh vật thuộc giống Clotridium, các enzyme này làm yếu và phân giải các màng chắn mô liên kết của tế bào chủ Trong nhiều trường hợp, tế bào chủ hỗ trợ cho chức năng này của enzyme collagenase bằng cách sản sinh ra enzyme elastase và enzyme polysaccaridase, thậm chí cả enzyme phospholipase, làm rối loạn các mô của màng tế... mắm cá linh và mắm cá sặc (có nguồn gốc tại huyện Châu Đốc, tỉnh An Giang) - Gelatin dùng làm cơ chất phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase - Collagen dùng làm cơ chất cấy chuyển sau khi đã tách ròng các dòng vi khuẩn trên cơ chất gelatin 3.2.2 Thiết bị và hóa chất 3.2.2.1 Thiết bị - Bộ micropipette Nichipet Ex - Nhật Bản - Cân điện tử Sartorius Teg 101 - Đức - Lò vi. .. Bacillus subtilis FS-2 từ một số thực phẩm lên men ở khu vực Châu Á và khảo sát các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase Bước đầu xây dựng hoàn chỉnh quy trình thu nhận chế phẩm enzyme collagenase từ chủng Bacillus subtilis FS-2 tự nhiên, quy trình tinh chế và xác định đặc tính enzyme collagenase đồng thời phân lập gen mã hóa sinh tổng hợp enzyme collagenase bằng kỹ thuật . để phân lập vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase hiệu quả. Vì vậy, đề tài Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá cơm, mắm. 3.3.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase trên môi trƣờng Czapek cải tiến 25 3.3.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn phân lập. thiết. Từ ba mẫu mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc đã phân lập được 41 dòng vi khuẩn hiếu khí có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase trên hai loại môi trường gelatin (giai đoạn phân lập)