PHÂN lập và TUYỂN CHỌN nấm lớn có KHẢ NĂNG SINH TỔNG hợp ENZIM LACCAZA từ gỗ mục và đề XUẤT BIỆN PHÁP bảo tồn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG HÀ NỘI

KHOA MÔI TRƯỜNG

TẠ THỊ TUYẾT ANH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM LỚN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZIM LACCAZA TỪ GỖ MỤC

VÀ ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP BẢO TỒN

Hà Nội - Năm 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG HÀ NỘI

KHOA MÔI TRƯỜNG

TẠ THỊ TUYẾT ANH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM LỚN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZIM LACCAZA TỪ GỖ MỤC

VÀ ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP BẢO TỒN

Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Môi trườngMã ngành : 751 04 06

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS LÊ THANH HUYỀN

Hà Nội - năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi Tạ Thị Tuyết Anh xin cam đoan rằng khóa luận này là thành quả của bảnthân tôi trong suốt thời gian làm khóa luận vừa qua Khóa luận tốt nghiệp là thành quảtừ sự nghiên cứu hoàn toàn thực tế, trên cơ sở các số liệu theo dõi thực tế mới, đượcthực hiện theo hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn Các tài liệu, số liệu, kết quả đượcsử dụng trong khóa luận là chính xác, khoa học và đúng với quá trình nghiên cứu củabản thân tôi tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển nấm - Viện di truyền nông nghiệpViệt Nam.

Khóa luận được thực hiện hoàn toàn mới, là của riêng tôi, không sao chép bất cứsố liệu của khóa luận nào khác Mọi sự tham khảo sử dụng trong khóa luận đều đượctrích dẫn các nguồn tài liệu trong báo cáo và danh mục tài liệu tham khảo

Cuối cùng tôi xin cam đoan rằng khóa luận là hoàn toàn trung thực, chính xác vàkhoa học.

Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2019

Sinh viên

Tạ Thị Tuyết Anh

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới ban lãnh đạo NhàTrường, ban lãnh đạo Khoa Môi Trường, cán bộ tổ quản lý Phòng thí nghiệm cùng cácquý thầy cô Trường Đại học Tài nguyên và Môi trường Hà Nội đã dìu dắt và truyềnđạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại đây, cũng như đã động viên, gópý và tạo điều kiện tốt nhất để em được học tập, nghiên cứu trong suốt thời gian làmkhóa luận.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Thanh Huyền – Trưởng bộ môn Độchọc và quan trắc môi trường, Khoa Môi trường, Trường Đại học Tài nguyên và Môitrường Hà Nội đã hướng dẫn tận tình em trong suốt thời gian làm khóa luận, giải đáprất nhiều thắc mắc, những vấn đề mà em còn thiếu sót; tận tình chỉ dạy và truyền đạtcho em rất nhiều kinh nghiệm, kiến thức cũng như các kỹ năng làm việc thực tế, cùngvới những lời động viên vô cùng kịp thời, quý báu; cô cũng đã hướng dẫn chỉnh sửagiúp em hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này.

Đồng thời em xin chân thành cảm ơn đề tài cấp Bộ “Nghiên cứu các loài nấm lớncó giá trị để bố sung vào danh mục loài nguy cấp, quý hiếm được ưu tiên bảo vệ và đềxuất giải pháp bảo tồn, phát triển” mã số TNMT.2018.04.11 đã hỗ trợ em thực hiệnkhóa luận này.

Em xin chân thành cảm ơn đến tất cả các cô/chú, anh/chị trong Phòng chọn tạogiống và Công nghệ sản xuất Nấm của Trung tâm nghiên cứu và phát triển nấm - Việndi truyền nông nghiệp Việt Nam, đặc biệt là TS Cồ Thị Thùy Vân và chị Hoàng ThịSoan đã tạo điều kiện hỗ trợ, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập và nghiên cứuđề tài này để em được thực hiện khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Khoa Môi trường đã cho em những gópý, lời động viên và những lời khuyên bổ ích trong suốt thời gian qua

Mặc dù đã cố gắng hoàn thiện tốt nhất khóa luận của mình, nhưng chắc chắnkhông tránh khỏi những sai sót, em rất kính mong nhận được sự thông cảm cũngnhư sự góp ý của quý thầy cô để khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 10 tháng 06 năm 2020

Sinh viên

Tạ Thị Tuyết Anh

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về Nấm lớn 3

1.1.1 Đặc điểm cấu tạo của nấm lớn (nấm đảm) 3

1.1.2 Điều kiện sống của nấm lớn 4

1.2.Tổng quan về enzim laccaza 5

1.2.1 Cấu trúc phân tử của laccaza 5

1.1.3 Cơ chế xúc tác của laccaza 6

1.1.4 Một số đặc tính sinh hóa của enzim laccaza 7

1.2.4 Vi sinh vật sinh tổng hợp laccaza 8

1.2.5 Khả năng của laccaza trong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm 9

1.2.6 Khả năng của laccaza phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm có clo 11

1.3 Tình hình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp enzimlaccaza của nấm lớn hiệnnay trong nước và quốc tế 12

1.3.1 Trên thế giới 12

1.3.2 Ở Việt Nam 13

1.4 Tổng quan về ứng dụng của enzimlaccazatrong môi trường 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phạm vi nghiên cứu 21

2.3 Thiết bị, hóa chất 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Phương pháp luận (Cách tiếp cận) 22

2.4.2 Phân lập quả thể nấm 22

2.4.3 Phương pháp khảo sát, theo dõi khả năng lan sợi của hệ sợi nấm ở một số môitrường khác nhau 22

2.4.4 Phương pháp phân tích (soi kính hiển vi) 24

2.4.5 Phương pháp phân lập, sàng lọc các mẫu nấm có khả năng sinh tổng hợp enzimlaccaza 24

2.4.6 Phương pháp thống kê xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả nghiên cứu sự phát triển của hệ sợi nấm lớn ở môi trường hữu cơ và môitrường vô cơ 26

3.1.8 Mẫu nấm lớn LC 31

3.2 Kết quả phân tích hình thái hệ sợi của các mẫu nấm lớn 32

3.3 Kết quả đánh giá khả năng sinh tổng hợp của enzim laccaza của các mẫu nấm lớn 36

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển nấm 5

Bảng 1.2 Ứng dụng củalaccazatrong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm 9

Bảng 1.3 Ứng dụng củalaccazatrong phân hủy các chất hữu cơ có clo 11

Bảng 1.4 Khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD bởi đơn chủng và hỗn hợp chủng 18

Bảng 2.1 Danh mục các dụng cụ, thiết bị và hóa chất 21

Bảng 3.1 : Đường kính trung bình hệ sợi phát triển của các mẫu nấm lớn 26Bảng 3.2: Theo dõi đường kính vòng sinh tổng hợp enzim laccaza các mẫu nấm lớn 37

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu tạo chung của quả thể nấm lớn 3

Hình 1.2: Cấu trúc enzim laccaza [29] 6

Hình 2.1: Phương cách cấy chuyển nấm từ môi trường cũ sang môi trường mới 25

Hình 3.1 Theo dõi sự phát triển của hệ sợi nấm HB19.01 27

Hình 3.2 Theo dõi sự phát triển của hệ sợi nấm HB19.06 27

Hình 3.3 Theo dõi sự phát triển của hệ sợi nấm HB19.08 28

Hình 3.4 Theo dõi sự phát triển của hệ sợi nấm XS19L003 29

Hình 3.5 Theo dõi sự phát triển của hệ sợi nấm XS19L013 29

Hình 3.6 Theo dõi sự phát triển của hệ sợi nấm XS19T005 30

Hình 3.7 Theo dõi sự phát triển của hệ sợi nấm XS19T027 31

Hình 3.8 Theo dõi sự phát triển của hệ sợi nấm LC 31

Hình 3.9 Hình thái sợi nấm HB19.01 soi ở 40x, 100x 32

Hình 3.10 Hình thái sợi nấm HB19.06 soi ở 40x, 100x 33

Hình 3.11 Hình thái sợi nấm HB19.08 soi ở 40x, 100x 33

Hình 3.12 Hình thái sợi nấm XS19L003 soi ở 40x, 100x 34

Hình 3.13 Hình thái sợi nấm XS19L013 soi ở 40x, 100x 34

Hình 3.14 Hình thái sợi nấm XS19T005 soi ở 40x, 100x 35

Hình 3.15 Hình thái sợi nấm XS19T027 soi ở 40x, 100x 35

Hình 3.16 Hình thái sợi nấm LC soi ở 40x, 100x 36

Hình 3.17: Hình ảnh vòng sinh enzim laccaza của mẫu HB19.01 37

Hình 3.18: Hình ảnh vòng sinh enzim laccaza của mẫu HB19.06 38

Hình 3.19: Hình ảnh vòng sinh enzim laccaza của mẫu HB19.08 39

Hình 3.20: Hình ảnh vòng sinh enzim laccaza của mẫu XS19L003 39

Hình 3.21: Hình ảnh vòng sinh enzim laccaza của mẫu XS19L013 40

Hình 3.22: Hình ảnh vòng sinh enzim laccaza của mẫu XS19T005 41

Hình 3.23: Hình ảnh vòng sinh enzim laccaza của mẫu XS19T027 41

Hình 3.24: Hình ảnh vòng sinh enzim laccaza của mẫu LC 42

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮTChữ viết tắtChú thích

KBTTN Khu bảo tồn thiên nhiên

MỞ ĐẦU1 Đặt vấn đề

Việc ứng dụng hoạt tính của các enzim vào trong quá trình sản xuất và đời sốngthường ngày, ngày càng được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Thực tế cácnghiên cứu về chế phẩm enzim đã và đang được ứng dụng, sử dụng phổ biến ở nhiềunước và trong một số ngành công nghiệp như: thực phẩm, chế biến thức ăn chăn nuôi,giấy, dệt may, da giày, xử lý ô nhiễm môi trường,… đã mang lại lợi ích kinh tế khálớn, đặc biệt là các enzim có khả năng phân hủy các hợp chất thơm đa vòng Điển hìnhtrong số đó là enzim laccaza [23].

Năm 1883, Enzim laccazalần đầu tiên được phát hiện có trong nhựa câyRhusvernicifera của Nhật Bản, và đặc tính của nó là một kim loại có chứa oxyase đãđược phát hiện bởi Bertrand vào năm 1985 [5,16].

Là một polyphenol oxidase có chứa nhiều nguyên tử đồng trong trung tâm hoạtđộng, enzim laccaza (benzenediol: oxygen oxidoreductase) này xúc tác sự oxy hóa cácortho và paradiphenol, aminophenol, polyphenol, polyamin, lignin và các aryl diamincũng như một số các ion vô cơ Ngoài ra, laccaza là sự oxy hóa các cơ chất chỉ kèmtheo sự khử oxy thành nước Tính đặc hiệu cơ chất thấp và khả năng oxy hóa mạnhcủa nó đã làm cho nó trở nên hữu ích đáng kể trong nhiều quy trình công nghiệp nhưphân hủy sinh học lignin, cảm biến sinh học, tẩy trắng sinh học, tẩy thuốc nhuộm dệt,loại bỏ phenolics, khử độc nước thải và các loại khác [12].

Enzim laccaza không chỉ được tìm thấy trong thực vật bậc cao, mà còn được tìm

thấy trong vi khuẩn và nấm như: nấm mốc Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus,hay các nấm lớn như Pycnoporus cinnabarinus , Ở vi khuẩn, hoạt tính laccazacũng

đã được tìm thấy trong một số ít trường hợp Tuy nhiên, tất cả cáclaccazahay proteintương tự laccaza được tìm thấy ở vi khuẩn đều là nằm trong nội bào hay vùng ngoại vitế bào chất (periplasm) khác với các laccaza ở nấm và thực vật bậc cao đều được tiết ramôi trường bên ngoài [12] Nấm rất đa dạng trong tự nhiên, chúng đã được công nhậnlà mục tiêu sàng lọc để tìm ra nguồn enzim thích hợp với các đặc điểm mang tính xâydựng và mới lạ Và nấm có khả năng ký sinh trên gỗ mà các loại nấm mục thường lànguồn gen để phân lập các gen mã hóa laccaza Việc sử dụng tiềm năng của công nghệsinh học đã kích thích nhu cầu khám phá tìm hiểu thêm khả năng sinh tổng hợp enzimlaccaza của một số nấm lớn từ gỗ mục.

Việc tìm kiếm thêm ứng dụng thương mại rộng rãi của enzim laccaza trongngành thực phẩm, bột giấy và công nghiệp giấy, dệt may công nghiệp, hóa học tổng

hợp, mỹ phẩm, đất xử lý sinh học và phân hủy sinh học chất ô nhiễm phenolic môitrường và loại bỏ của các chất gây rối loạn nội tiết…đang ngày càng được quan tâmnhiều hơn trong những năm gần đây.

Xuất phát từ những lí do trên, em tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập và

tuyển chọn nấm lớn có khả năng sinh tổng hợp enzim Laccaza từ gỗ mục và đềxuất biện pháp bảo tồn”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tuyển chọn được nấm lớn khả năng sinh tổng hợp enzim laccaza từ gỗ mục.- Đề xuất được biện pháp bảo tồn cho nấm lớn khả năng sinh tổng hợp enzimlaccaza từ gỗ mục.

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu sự phát triển của hệ sợi nấm ở các môi trường khác nhau hữu cơ vàvô cơ.

-Phân tích hình thái hệ sợi nấm sau khi nghiên cứu sự phát triển của hệ sợi nấm ởcác môi trường khác nhau hữu cơ và vô cơ .

- Tuyển chọn được nấm lớn có khả năng sinh tổng hợp enzim laccaza từ gỗ mụctừ đó đề xuất biện pháp bảo tồn hệ sợi nấm lớn.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Tổng quan về Nấm lớn

1.1.1 Đặc điểm cấu tạo của nấm lớn (nấm đảm)

Hình 1.1: Cấu tạo chung của quả thể nấm lớn

Nguồn: Nguyễn Lân Dũng (2010) [6]

Mũ nấm phần trên cùng của quả nấm, nó mọc trên cuống nấm, mặt dưới của mũnấm có rất nhiều phiến nấm Trên một số loài cuống nấm đôi khi còn có vòng nấm ởphần cuống là bao nấm Trên mũ nấm có khi có những phiến vẩy, có vòng đồng tâm,có những mấu lồi, hay những đường vân hoặc nếp nhăn Phần thit nấm của mũ nấmcó thể có dạng tổ chức sợi kiểu xốp và dạng tổ chức sợi liên kết có mấu Cuống nấmcó thể nằm ở chính giữa mũ nấm, lệch tâm, hoặc nằm ở một bên Cuống nấm cũngcórất nhiều hình dạng khác nhau, có thể có hình viên trụ, hình chuỳ, hình cong, hình conthoi, hình đáy có dạng củ, hình sợi mảnh, hình đáy dạng rễ, hình đáy phình to Mũnầm có dạng mép phẳng, dạng mép nhãn, dạng mép lồi lõm, dang mép lượn sóng,dạng mép cụp vào, dạng mép cuốn lên, dạng hình tròn, dạng bán nguyệt, dạng viên trụ,dạng hình trứng, dạng chuông, dạng bán cầu, dạng vỏ sò, dạng cánh, dạng phễu, dạngloa, dạng bề mặt trơn nhắn, dạng có nếp nhắn, dạng có gai nhỏ, dạng có đường rãnh,dạng có lông, dạng mai rùa, dạng có hạt nhỏ, dạng có vảy dạng lông chùm, dạng cóvảy hình mấu, dạng có vảy dạng khối, dạng có tinh thê hình hạt, dạng có vết lỗi nhỏ

Phiến nấm cũng có nhiều loại hình thái khác nhau: dạng mép trơn nhẵn, có răng cưa,lượn sóng, dạng toả thẳng Ống nấm có các thể dạng nang có đảm, có bào tử đảm [12].Cơ quan sinh sản có cấu tạo đặc biệt gọi là tai nấm Tai nấm chủ yếu gồm mũ vàcuống Mũ thường có dạng nón hay phễu, với cuống dính ở giữa hay bên Mặt dướimũ của nhóm này cấu tạo bởi các phiến mỏng xếp sát vào nhau như hình nan quạt Ởmột số trường hợp, phiến còn kéo dài từ mũ xuống cuống như nấm sò [23].

Bào tử tập chung ở phía dưới cấu trúc đặc biệt gọi là mũ nấm hay tai nấm Mũnấm thường có cuống nâng lên cao để có thể nhờ gió đưa bào tử bay xa Bào tử nảymầm lại cho hệ sợi mới Người ta chia đời sống của nấm trồng ra 2 giai đoạn là: giaiđoạn tăng trưởng (hay sinh dưỡng) là tản dinh dưỡng, và giai đoạn quả thể (haycơ quan sinh bào tử hữu tính của nấm, giai đoạn sinh thực) là tản nấm sinh sản.Đa sốnấm trồng đều sinh sản bằng bào tử Nhờ vậy, nấm phát triển rất nhanh và phân bố rấtrộng Bào tử của nấm phổ biến có hai dạng: vô tính và hữu tính Nấm ăn, bào tử sinhra ở phía dưới cấu trúc đặc biệt gọi là mũ nấm hay tai nấm Mũ nấm thường có cuốngnâng lên cao để có thể nhờ gió đưa bào tử bay xa Bào tử nảy mầm lại cho hệ sợimới (từ sợi sơ cấp thành sợi thứ cấp) Đến điều kiện thuận lợi (thời tiết, khí hậu, độ ẩm ) nấm sẽ nảy mầm và hình thành quả thể.

Một số loại nấm có hình thái liên hợp dạng móc (clamp connection), tế bào đỉnhsợi nấm (2 nhân) mọc ra một mấu nhỏ, một trong hai nhân chui vào mấu này Mỗinhân phân cắt thành hai, hai thành bốn nhân, hai nhân giữ lại đỉnh tế bào, một nhânchui vào mấu, một nhân nằm ở gốc tế bào Tế bào đỉnh ban đầu xuất hiện hai váchngăn, chia thành ba tế bào Sau đó vách ngăn giữa mấu và tế bào gốc bị khai thông, tếbào gốc tiếp nhận nhân từ mấu chuyển xuống và trở thành tế bào song nhân Như vậytừ một tế bào song nhân trở thành hai tế bào song nhân và giữa hai tế bào còn lưu lạimột cái móc [16].

1.1.2 Điều kiện sống của nấm lớn

Nấm phân bố khắp nơi trên thế giới, ký sinh và hoại sinh rộng khắp ở các loài

cây lá rộng đến lá kim, thậm chí ở các tre trúc, dừa, cau, cọ dừa và nho Nấm tiết racác men phân giải màng tế bào endopolygalacturonase và endopectin methyl –translinase có tác dụng làm nhũn tế bào thực vật rất mạnh gây nên tình trạng các loạigỗ và rễ cây bị mùn ra.

Bảng 1.1: Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển nấm

Nguồn: Nguyễn Minh Khang(2016) [16]

1.2.Tổng quan về enzim laccaza

Laccaza đóng vai trò chính trong quá trình tổng hợp lignin ở thực vật, trong khilaccazado nấm tiết ra lại hoạt động hoàn toàn ngược lại, chủ yếu là làm suy giảmlignin Do đó, sự phân giải lignin của nấm nhờ vào enzim laccaza làm cho nó có mộtloạt các ứng dụng.

1.2.1 Cấu trúc phân tử của laccaza

Một loài sinh vật có thể sinh tổng hợp có nhiều loại laccaza khác nhau và chúngthường khác nhau về trình tự axit amin và tính chất động học xúc tác Khối lượng phântử laccaza dao động trong khoảng 60-100 kDa được xác định SDS-PAGE Phần lớnlaccaza của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lượng carbonhydrate chiếmkhoảng 10-25% [5].

Cấu trúc chính của laccaza bao gồm cấu trúc liên kết thùng beta chính của HyLạp, thành phần có khoảng 500 dư lượng axit amin trong ba nhóm liên tiếp Các axitamin này được phân phối trong ba nhóm: nhóm thứ nhất (T1) với 150 axit amin banđầu, nhóm thứ hai (T2) có 150 và nhóm thứ ba (T3) có 300 axit amin Sự ổn định củacấu trúclaccazalà do sự hiện diện của liên kết disulfide giữa nhóm 1 và 2 và giữa nhóm1 và 3 [15].

Tất cả laccaza đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tửđồng (Cu) Những nguyên tử đồng này được chia thành ba nhóm: loại 1 (T1), loại 2(T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử Cácnguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh,trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể đượchoạt hóa khi liên kết với anion mạnh[5].

Hình 1.2: Cấu trúc enzim laccaza[29]

Nguyên tử Cu ở T1 tạo ra màu xanh lam cho protein đa đồng, do sự hấp thụ điệntử mãnh liệt gây ra bởi liên kết đồng hóa trị đồng cysteine Ở T1 nguyên tử Cu có sựphối hợp lượng giác, với hai histine và cystein là các phối tử xích đạo được bảo tồn vàmột vị trí thường thay đổi Cu ở T2 hoặc vị trí Cu bình thường được đặc trưng bởi sựthiếu các tính năng hấp thụ mạnh trong vùng khả kiến và cho thấy phổ cộng hưởng từtrường điện từ (EPR) thông thường Đồng (Cu) ở T2 được điều phối bởi hai dư lượnghistidines và có vị trí chiến lược gần với nguyên tử đồng Cu ở T3 Nguyên tử đồng(Cu) ở T3 là một hạt nhân trung tâm được điều chỉnh bởi sáu histidine và được đặctrưng bởi quang phổ bởi sự hấp phụ electron ở bước sóng 330nm (dạng oxy hóa) vàkhông có tín hiệu EPR do liên kết chống sắt từ mạnh giữa hai nguyên tử đồng loại 3 cóliên quan đến sự hiện diện của một cây cầu hydroxyl[38].

1.1.3 Cơ chế xúc tác của laccaza

Laccaza sẽ oxy hóa cơ chất theo nguyên tắc là sẽ nhường một electron chonguyên tử đồng(Cu) T1, biến nguyên tử đồng T1 trở thành dạng Cu+ để hình thànhphân tửlaccazacó cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+) Phân tử O2 sau đóoxy hóalaccazathành dạng khử, thông qua hợp chất trung gian là peroxy và peroxy bịkhử thành nước ( H2O) Một số nhà nghiên cứu cho rằng, hợp chất peroxy trung gianbị oxy hóa hình thành nên laccazaở trạng thái bị oxy hoạt hóa, mà ở đó cả 4 nguyên tửđồng đều ở trạng thái oxy hóa Sau đó, enzim nhanh chóng tham gia vào chu trình xúctác mới [5].

Ngoài ra, cơ chế xúc tác có thể diễn ra theo cách, 4 nguyên tử Cu sẽ đảm nhiệmoxy hóa các cơ chất Các phân tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thể oxyhóa khử lớn, nên chúng không thể tiếp cận được vào trung tâm xúc tác của enzimlaccaza Trong trường hợp này, cần một chất để gắn kết hoặc một hệ chất gắn kết đểtiếp xúc với trung tâm phản ứng củalaccazađể oxy hóa laccaza, sau đó chất này ởdạng oxy hóa sẽ nhận một điện tử của cơ chất và trở thành chất khử, tiếp tục tham giavào chu kỳ xúc tác mới [28] Ngược lại,laccaza sau khi nhường cho chất gắn kết mộtelectron thì trở thành dạng khử, sau đó bị oxy hóa thành dạng oxy hóa và tiếp tục thamgia vào chu trình xúc tác tiếp theo Các chất gắn kết thường phù hợp cholaccazalà 3-hydroxyanthranillic acid(HAA), 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic axit)(ABTS), N-hydroxybenzotrialzone (HOBT),… Sự có mặt của chất gắn kết đã gópphần làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất của laccaza [5].

1.1.4 Một số đặc tính sinh hóa của enzim laccaza

Hiện nay, đã có khoảng 100 loạilaccazakhác nhau đã được tinh sạch và xácđịnh đặc điểm sinh hóa với các cơ chất là ABTS, 2,6-DMP và SGZ Đã có một vài hệgene của các chủng nấm có chứa hơn một gene laccaza Mức độ biểu hiện của cácgene điển hình khác nhau phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy Với hàm lượng nitơ cao

trong môi trường đã giảm sự dịch mã của gene laccaza trong chủng Basidiomycete sp.I-62 (CECT 20197) và loài Pleurotus sajorcaju [5].

Để làm tinh sạch protein laccaza phải trải qua nhiều bước như siêu lọc (lọc thẩmthấu màng), kết tủa với amoni sulfat hoặc với dung môi hữu cơ và trao đổi ion cũngnhư sắc ký khối lượng.laccaza đại diện của nấm là các protein có điểm đẳng điện xungquanh giá trị 4.0 Một số loài nấm sinh tổng hợplaccazađã được nghiên cứu bao gồm

Coprinus plicatilis, Fomes fomentarius, Heterobasidion annosum, Hypholomafasciculare, Kuehneromyces mutabilis, Leptoporus litschaueri, Panus stipticus,Phellinus igniarius, Pleurotus corticatus, P ostreatus, Polyporus brumalis, Stereumhirsutum, Trametes gibbosa, T hirsuta, và T versicolor có hơn một loại laccaza

(isozyme) và điểm đẳng điện (pI) trong khoảng từ 3 đến 5.

Khả năng xúc tác của enzim đã được mô tả thông qua định lượng bằng hằng

số Michaelics Km và hằng số hiệu quả xúc tác Kcat Những hằng số này đã được côngbố với một lượng lớn laccaza và có sự khác biệt trong số chúng Hằng số Km của

laccaza nhìn chung dao động xung quanh giá trị 2,5 μM phụ thuộc vào nguồn gốcenzim và cơ chất Giá trị Km của laccaza được xác định với cơ chất là 2,6-dimethoxyphenol nhìn chung là cao hơn khi xác định với syringadazine (sự trùng hợpcủa hai phân tử là 2,6-dimethoxyphenol được liên kết với nhau bằng cầu azide) [29]

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và các điều kiện nhiệt độ lên hoạt tính laccaza đãđược thực hiện Theo đó, sự biến động hoạt tính của laccaza theo pH thường có hìnhchuông và khoảng tối ưu xung quanh giá trị 4,6 khi sử dụng cơ chất có nguồn gốcphenol Hoạt tính laccaza giảm trong điều kiện pH trung tính hoặc kiềm là do tănganion - OH, anion này có kích thước nhỏ nên là tác nhân gây ức chế hoạt tính củalaccaza Khi pH tăng thế khử của cơ chất có bản chất phenol giảm dẫn đến cơ chất nàynhạy cảm hơn với quá trình oxy hoá bởi laccaza Sự ổn định hoạt tính laccaza đối vớipH nhìn chung trong khoảng từ 8-9 và sự ổn định hoạt tính của laccaza theo nhiệt độthay đổi phụ thuộc lớn vào nguồn gốc vi sinh vật, nhìn chung nằm trong khoảng từ 30đến 500C và hoạt tính giảm nhanh chóng ở nhiệt độ trên 600C [5].

1.2.4 Vi sinh vật sinh tổng hợp laccaza

Ở thực vật được laccaza tìm thấy trong xylem nơi chúng có thể oxy hóa cácmonoligno ở trạng thái ban đầu của quá trình lignin hóa và cũng tham gia trong các cơchế gốc cơ bản của sự hình thành lignin cao phân tử Hiện tại, nghiên cứu về laccazathực vật bậc cao còn rất hạn chế so với laccaza từ các chủng nấm Trên thực tế, một sốnghiên cứu về hoạt tính laccaza ở vi khuẩn không giống laccaza ở các nhóm nhân sơkhác Protein laccaza của vi khuẩn là protein nội bào hoặc ở khoang chu chất Chủng

Bacillus subtilis đã sinh ra loại laccaza CotA ổn định nhiệt tham gia vào sự hình thànhmàu ở màng nội bào [5].laccaza cũng đã được tìm thấy từ loài Streptomyces cyaneus[4] và S lavendulae.laccaza đã được nghiên cứu khá chi tiết ở nhiều chủng nấm thuộc

nấm sợi (Ascomycetes) và nấm đảm (Basidiomycetes) Có nhiều nghiên cứu về sản

phẩm laccaza tinh sạch của các loài nấm Ascomycetes như loài Melanocarpusalbomyce, Cerrena unicolor, Magnaporthe grisea, Trametes versicolor, Trichodermareesei và Xylaria polymorpha.

Có nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu về khả năng sinh laccaza từ nấm

men.Hiện nay, laccaza được tinh sạch từ chủng Cryptococcus (Filobasidiella)neoformans gây bệnh cho người, chủng nấm men này sinh ra laccaza thật có khả năng

oxy hóa phenol và aminophenol và cũng có thể oxy hóa tyrosine.Ngày nay, các nhàkhoa học vẫn đang nỗ lực nghiên cứu sàng lọc từ tự nhiên các chủng nấm sinh tổng hợplaccaza với mong muốn tìm được chủng có hoạt tính cao và có đặc tính mới Hoạt tínhlaccaza thay đổi phụ thuộc vào các loài, các chủng vi sinh vật, vì ở điều kiện tự nhiên hoạttính laccaza rất thấp Việc lựa chọn, sàng lọc các chủng có khả năng sinh tổng hợp laccazatừ tự nhiên là bước rất quan trọng sau đó là tối ưu các điều kiện môi trường nuôi cấy đểchúng sinh tổng hợp laccaza cao hơn với các đặc tính vượt trội hơn [5].

1.2.5 Khả năng của laccaza trong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm

Chủng nấm và enzim để ứng dụng trong xử lý các chất ô nhiễm môi trường đãđược nghiên cứu Trong đó, laccaza có khả năng phân hủy và khử độc có hiệu quả cáchợp chất hữu cơ khó phân hủy đã nhận được nhiều sự quan tâm trong lĩnh vực côngnghệ sinh học và chúng cũng đã được sử dụng như các cảm biến sinh học trong quantrắc, xử lý ô nhiễm môi trường trong các lĩnh vực công nghiệp dệt, thức ăn, xử lý gỗ,dược và hoá chất [5].

Có khoảng cơ chất đặc hiệu rộng nên laccaza có thể oxy hoá ở phạm vi lớn vớicác chất độc sinh học ngoại lai bao gồm các hợp chất phenol có clo, thuốc trừ sâu, cáchợp chất hữu cơ đơn và đa vòng thơm được khai thác từ các nhiên liệu hoá thạch

laccaza tinh sạch từ loài Coriolopsis gallica oxy hoá carbozole, Nethylcarbozole,fluorine và dibenzothiophene khi có mặt 1-hydroxybenzotriazole và 2.2-azinobis (3

ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid như là một chất gắn kết Các nghiên cứu trongphòng thí nghiệm đã chứng minh rằng laccaza sẽ loại bỏ được phenol và các aminthơm khỏi nước Cơ chế của quá trình này là sự oxy hoá của enzim với các chất ônhiễm thành các cấu tử tự do hoặc quinone và sau đó là quá trình kết tủa từng phần [5].

Bảng 1.2 Ứng dụng của laccaza trong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm

Hợp chấtNguồn gốc laccazaCơ chấtHình thứcPhenols

Chlorophenols, cresols, nitrophenols

, SA

Tự do4-tert-butylphenol,

Hợp chấtNguồn gốc laccazaCơ chấtHình thức

Bjerkandera adusta, T versicolor

Các hợp chất hydrocarbon (PAHs)

15 loại PAHs (theo USEPA)

Laccaza tái tổ hợp B.subtilis CotA biểu hiện

trong E coli

Naphthalene, phenanthrene

T versicolor (Sigma

-Cố định lênđất sét hoạt

tínhBenzo[a]pyrene,

Laccaza tái tổ hợp T.sanguineus biểu hiệntrong T.atroviride

(Chú thích: - : không có)(Nguồn: Yang J [37])

Các chất phenol đang thu hút nhiều sự quan tâm vì khả năng tác động tới cáchormon tự nhiên ở các động vật có xương sống Chúng là sản phẩm từ sự phân huỷsinh học không triệt để của các nonylphenol polyethoxylates (NPEOs) được sử dụngrộng rãi trong các chất hoạt động bề mặt không ion trong các quá trình công nghiệp.Cả nonyphenol và NPEOs được thải vào môi trường chủ yếu từ quá trình xử lý nướcthải không triệt để.laccaza từ các thực vật thuỷ sinh Clavariopsis aquatica đã đượcchứng minh là có khả năng phân huỷ các chất nonylphenol gây các triệu trứng thay đổinội tiết tố[5] … Một số ứng dụng của laccaza trong phân hủy các hợp chất hữu cơ trênthế giới được trình bày ở Bảng 1.1 [37].

Như vậy có thể thấy có rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh về khả năng sinhtổng hợp laccaza từ nhiều loài vi sinh vật hay tái tổ hợp trong phân hủy các hợp chấthữu cơ khác nhau với sự có mặt hay không có mặt của các chất gắn kết và ở các dạngtồn tại tự do hoặc được cố định lên các loại vật liệu khác nhau Qua đó cho thấy sự đadạng của chủng loại, cách thức sử dụng của laccaza trong xử lý các hợp chất hữu cơ.

1.2.6 Khả năng của laccaza phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm có clo

Độc bền, độc tính và khả năng bị phân hủy sinh học của các hợp chất clophenolphụ thuộc vào số lượng và vị trí của nguyên tố clo trên vòng thơm, và các hợp chất clovòng thơm khó bị phân hủy hơn các hợp chất clo mạch thẳng và khả năng phân hủysinh học giảm khi số lượng nhóm clo tăng Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng loạiclo của enzim là pH, nồng độ cơ chất ban đầu, lượng enzim, thời gian phản ứng vànhiệt độ laccaza đã loại được 79,74% clo của 2,4,5-TCP ở các điều kiện tối ưu như pH5, nồng độ cơ chất là 400 µM, thời gian phản ứng là 30 phút, với lượng enzim là 4ml

và nhiệt độ phản ứng là 50ºC.laccaza của loài nấm Rhizoctonia praticola đã được sửdụng để phân hủy các chất ô nhiễm phenolic như o-chlorophenol, pchlorophenol, 2,4-DCP, 2,4,5-TCP, 4-chloro methylphenol, nhưng độc tính của p-chlorophenol và 2,4,5-

TCP không giảm Sử dung laccaza để xử lý chất đa vòng thơm chứa Clo không phảilúc nào cũng đạt hiệu quả triệt, nên có thể laccaza được sử dụng để xử lý sau quá trìnhloại Clo các hợp chất trên[3] Khả năng phân hủy các hợp chất vòng thơm chứa clobởilaccazađược trình bày ở Bảng 1.3 [37].

Bảng 1.3 Ứng dụng của laccaza trong phân hủy các chất hữu cơ có clo

Hợp chấtNguồn gốc laccazaCơ chấtỞ dạngThuốc trừ sâu

ABTS,HBT,HPI,TEMPO,SA,VA, VAN

Tự do

Laccaza tái tổ hợp từ chủng vi khuẩn WD biểu hiện trong

Pseudomonas putida

Atrazine,chlorothalonil,chlorpyrifos,isoproturon, pyrimethani

T versicolor

ABTS, AS, guaiacol, HBT,SA, VA, VAN

nuôi cấyAmetryn,atrazine,clofibri

c acid,fenoprop,pentachlorophenol,propoxur

(Cố định) - Là hình thức enzim được cố định lên các loại vật liệu; (Trong quá trìnhnuôi cấy) - Enzim được hình thành trong quá trình sinh trưởng và phát triển của visinhvật.

Kết quả từ các nghiên cứu trong và ngoài nước được trình bày ở trên chothấy khả năng phân hủy các chất vòng thơm có clo (các thuốc trừ sâu) bởi laccazatái tổ hợp,laccaza tự nhiên từ chủng nấm, vi khuẩn và ở các dạng tồn tại khác nhau,bên cạnh đó là vai trò của chất gắn kết phù hợp với từng loại laccaza.

1.3 Tình hình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp enzim laccaza của nấm lớnhiện nay trong nước và quốc tế.

1.3.1 Trên thế giới

Trên Thế giới có rất nhiều đề tài nghiên cứu về hoạt tính laccaza của các tác giảtrên khắp thế giới Các đề tài nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp laccazacủa thực vật,các chủng vi sinh vật, nấm; các đề tài về chiết xuất, sản xuất laccaza đem các ưu điểmvề mặt hóa học, sinh học của enzim laccaza ứng dụng vào sản xuất như trong côngnghiệp may, dệt nhuộm, trong quá trình xử lí nước thải ….

Theo tác giả Liang Yin và các cộng sự (2017), qua phân lập, sàng lọc các mẫu

nấm đã chọn được chủng Abortiporus bienni J2 để sản xuất laccaza Sau 6 ngày hoạtđộ laccaza đạt tối đa là 37 U / mL,laccazangoại bào được tiết ra bởi Abortiporusbienni J2 đã được tinh chế bằng kết tủa ammonium sulfate, sắc ký trao đổi ion trên

dòng chảy nhanh DEAE-Sepharose và lọc gel trên cột Sephadex 100.laccaza đã đượctinh chế hoạt động ổn định trong phạm vi nhiệt độ từ 20 – 400C và pH 6.0 – 10 [30].

Theo Buddolla Viswanath và các 3 cùng các cộng sự (2015), tiến hành phân lập150 mẫu nấm ở Karnataka, Ấn Độ chỉ có 8 mẫu có khả năng sinh laccaza Tiến hànhsàng lọc định lượng enzim laccaza được sinh ra ở 8 mẫu nấm, thu được mẫu có kí hiệuFS6 sinh ra laccaza nhiều nhất, tiến hành phân tích giải trình tự FS6 xác định được đólà Marasmius sp BBKAV79 (KP455496, KP455497) [24].

Theo Rehan A Abd El Monssef and cộng sự (2016) về việc sản xuất laccaza ứngdụng để khử màu sắc tố nấm trên giấy và giấy da, đã tìm ra giá trị pH tối ưu cho hoạtđộng của enzim là 4,5 – 5,5 và giá trị pH tối ưu thay đổi tùy theo chất nền khác nhau.Nhận thấy enzim laccaza, ít ảnh hưởng đến sắc tố của giấy khi biến đổi sinh học so vớitác dụng của laccaza trên giấy, sắc tố tẩy xuất hiện sau 120 phút [33].

Theo Lijing Xu và các cộng sự (2015), phân lập, tinh chế và đặc tính sinh laccaza

của chủng nấm Pleurotus sp đã phát hiện ra laccaza bị cô lập có thể được sử dụng

trong việc phát triển bộ cảm biến sinh học để phát hiện các hợp chất phenolic từ nướcthải công nghiệp giấy Chỉ ra trọng lượng phân tử của laccaza được sinh ra từ nấm

basidiomycete trong khoảng từ 55.000 đến 72.000 Dalton Các chất ức chế khối lượng

phân tử như SDS và natri azide ức chế hoàn toàn hoạt động của enzim [31].

và đã xác đinh được vi khuẩn Achromobacter sp BQNT2 được phân lập từ nước thải

chứa 1600mg/l, sinh ra laccaza với hoạt tính 15 U/L trên môi trường muối khoángchứa 100 mg/L TNT [8].

Theo Nguyễn Thị Lan Anh cùng cộng sự của mình vào năm 2011, tiến hành phânloại và xác định hoạt tính laccaza của chủng XKDNP22 phân lập từ đất nhiễm chất

diệt cỏ/dioxin, đã xác định được hoạt tính laccaza của chủng xạ khuẩn Streptomyces

sp XKDNP22 được phân lập trong lô xử lý đất diệt cỏ/dioxyn tại sân bay Đà Nẵng,nuôi trên môi trường GauseM 1/5 bổ sung 4g dịch chiết malt, dịch chiết đất và 6 g/LKNO3 là 4.688 U/L [1].

Theo Đàm Thúy Hằng cùng cộng sự vào năm 2012, tiến hành phân loại, khả

năng sinh tổng hợp laccaza và phân hủy PAH của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.

XKBH13 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin thuộc sân bay quân sự cũ Biên

Hòa; đã xác định khả năng sinh laccaza của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.

XKBH13 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxyn tại sân bay Biên Hòa cao nhất làsau 24 giờ với hoạt tính 3.747 U/L được nuôi trong môi trường chứa dịch chiết malt, 1mM catechol và sử dụng dịch chiết đất ô nhiễm chứa dioxyn và các chất chứa clo kháclàm nguồn cacbon [10].

Năm 2012,theo Nguyễn Quang Huy và cộng sự đã xác định được hoạt tính của

enzim laccaza do chủng xạ khuẩn Streptomyces sp XKBH1 đã được phân lập từ đất

nhiễm chất diệt cỏ tại sân bay Biên Hòa là 1.073 U/L trong môi trường KG chứaveratryl alcohol nồng độ ban đầu 0,5 mM, thông qua nghiên cứu sinh enzim ngoại bàoperoxidaza, laccaza và phân hủy các hợp chất vòng thơm của chủng xạ khuẩn XKBH1[1].

Theo Nguyễn Thị Phương Mai cùng cộng sự của mình vào năm 2010, hai chủngN 7.2 và R 5.3 được nuôi trên môi trường MT4 ở 300C, pH 5, lắc 200 v/p trong thờigian 8 ngày, nghiên cứu tích lũy enzym cao nhất tương ứng là 84,76 UI/ml và 4,85 UI/ml Hoạt tính enzim của chủng N 7.2 rất bền với thời gian, canh trường của N 7.2 vẫngiữ được hoạt tính laccaza sau 4 tháng giữ ở 40C và đã định được tên chủng là

Phomopsis sp [19].

Theo Phùng Khắc Huy Chú(2018), đã tiến hành nghiên cứu khả năng loại màuthuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzimlaccaza trong luận án tiến sĩ của mình, đã chọn được chủng FBV40 từ 22 chủng phânlập được từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì, Hà Nội với hoạt tính laccaza thô cao nhất là107.708U/l trên môi trường TSH1 sau 8 ngày nuôi cấy Sau 8 ngày nuôi cấy chủngFBV40 phân hủy 44,7% đồng loại 2,3,7,8- TCDD với độ độc ban đầu 2000 ng TEQ/L,trong khi hỗn hợp các chủng nấm đảm FBV40, FBD154 và nấm sợi FNBLa1 đều sinhtổng hợp laccaza phân hủy gấp hơn 2 lần (92,9%) so với đơn chủng FBV40 [5].

Theo Đào Thị Ngọc Ánh và các cộng sự năm 2011, đã nghiên cứu được khả năngsinh enzim laccaza nấm sợi Aspergillus sp FNA1 được phân lập từ đất ô nhiễm hỗnhợp thuốc trừ sâu với hoạt tính cao nhất sau 1 ngày nuôi cấy là 1.608 U/L trên môitrường Czapek nghèo bổ sung 0,2% Tween 80, ở pH 5, nhiệt độ 30°C, 0,1% NaCl vàtrên nguồn chất độc là DDT [1].

Năm 2009, Đặng Cẩm Hà cùng nhóm cộng sự của mình đã thực hiện phân lập vàđánh giá khả năng phân hủy hexachlorocyclohexane của chủng nấm sợi FNA33 từ đấtxử ly khử độc126 thuốc trừ sâu bằng bioreactor hiếu khí, và đã xác định được hoạt tínhsinh tổng hợp laccaza của chủng nấm sợi Aspergillus sp FNA33, được phân lập từ đấtđang xử lý khử độc ô nhiễm hỗn hợp các thuốc trừ sâu trong bioreactor hiếu khí là 4,3U/L trên môi trường muối khoáng bổ sung 0,5% glucose và chứa 300 ppm HCH [9].

Theo Hoàng Thị Nhung và các cộng sự của mình vào năm 2012, đã tiến hànhsàng loc chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp enzim laccaza và phân hủy các hợpchất hữu cơ đa vòng thơm, loại màu thuốc nhuộm, và đã xác định được khả năng sinh

laccaza của chủng nấm sợi Trichoderma sp FCP3 phân lập từ rừng Quốc gia Cúc

Phương với hoạt tính là là 2.000 U/L ở pH 5,5, với chất cảm ứng là CuSO4, glucose,nguồn nitơ là hỗn hợp KNO3 và NaNO3 [20].

Năm 2013, theo Trần Thị Thu Hiền và cộng sự đã tiến hành phân lập và ảnhhưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp laccaza bởi chủngnấm thu thập từ rơm mục Ninh Bình, và đã xác định được khả năng sinh laccaza cao

của nấm sợi Myrothecium sp FNBLa1 phân lập từ rơm mục ở Ninh Bình với hoạt tính

lên tới 30.016 U/L sau 96h ở pH 6,5, chất cảm ứng là 0,1 mM CuSO4, 12 g/L glucose,hỗn hợp1 g/L casein và 3 g/L NaNO3 [11].

Theo Trịnh Thu Thủy và các cộng sự, năm 2015 đã tiến hành phân lập và tuyểnchọn các chủng nấm mốc sinh tổng hợp Enzim laccaza từ gỗ mục đã tìm ra 5 chủng cóhoạt tính laccaza dao động từ 1.480 U/ml đến 24.720 U/ml, trong đó chủng BV1 cókhả năng tổng hợp laccaza cao nhất đạt 24.720 U/ml sau 5 ngày nuôi cấy và lượng

sinh khối thu được là 457,4 mg và đã sơ bộ định tên chủng BV1 thuộc chi Meruliporia

Năm 2014, theo Nguyễn Thị Lan Anh và nhóm nghiên cứu của mình, khẳngđịnhlaccazasinh tổng hợp bởi hỗn hợp các chủng nấm FBV25, FBV28 và FNBLa1giảm dần theo thời gian xử lí và tỷ lệ nghịch với hiệu suất loại màu thuốc nhuộm sau168 giờ Điều này chứng tỏ laccaza đã tham gia vào phản ứng phá vỡ cấu trúc hay làmthay đổi nhóm chức của thuốc nhuộm màu xanh hoạt tính [3].

Theo Phùng Khắc Huy Chú và cộng sự năm 2017,laccaza thô từ chủng FBV40được nuôi lắc trên môi trường TSH1 và có hoạt tính laccazacao nhất thu được sau 8ngày nuôi cấy là 107.708U/L, chứng minh laccaza thô từ chủng FBV40 có khả năngloại được các màu hoạt tính ở mức độ khác nhau, khi sử dụng phương pháp đánh giákhả năng loại màu trên thiết bị UV-VIS [4]

Tổng quan tài liệu liên quan đếnlaccazavà các ứng dụng cho thấy,laccaza là đốitượng đã được nghiên cứu khá chi tiết trên các phương diện: vi sinh vật sinh tổng hợplaccaza, cấu tạo phân tử, cơ chế hoạt động xúc tác, nghiên cứu phân tử về gene, proteinvà đặc điểm hóa - lý của laccaza.

Đến thời điểm hiện nay, có ít công trình sử dụng tổ hợp của nhiều chủng vi sinhvật sinh tổng hợp laccaza trong xử lý các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy vì việclựa chọn được tổ hợp của nhiều vi sinh vật sinh tổng hợp laccaza có khả năng caokhông đơn giản và nghiên cứu đòi hỏi nhiều công sức Đây là cơ hội cho các nghiêncứu nhằm tìm kiếm công nghệ xử lý ô nhiễm môi trường do nước thải dệt nhuộm vàchất diệt cỏ/dioxin gây ra Các nghiên cứu về khả năng của laccaza cần tiếp tục thựchiện để bổ sung cơ sở khoa học, cơ sở dữ liệu về mức độ đa dạng của chủng vi sinh vậtsinh tổng hợp laccaza và tiềm năng ứng dụng theo phân bố của Việt Nam

Qua các công trình nghiên cứu về nhiều hoạt tính, công dụng của một số chủngNấm lớn vẫn còn quá ít các đề tài, công trình nghiên cứu chuyên sâu về khả năng sinhtổng hợp enzim laccaza từ gỗ mục Đặc biệt, đối với các nghiên cứu về chi nấm lớn tạikhu vực Vườn Quốc gia Xuân Sơn, tỉnh Phú Thọ và khu bảo tồn thiên nhiên ThượngTiến, huyện Kim Bôi, tỉnh Hòa Bình mà đề tài nghiên cứu thì chưa có tác giả nàonghiên cứu sâu về khả năng sinh tổng hợp enzim laccaza từ gỗ mục của nhóm nấmnày Vì vậy, việc tiến hành nghiên cứu đề tài trên là rất cần thiết và có ý nghĩa lớn đốivới việc bảo tồn đa dạng sinh học và hoạt tính laccaza của nấm ở Việt Nam cũng nhưtrên thế giới.

1.4 Tổng quan về ứng dụng của enzim laccaza trong môi trường

Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về laccaza và ứng dụng của nótrong xử lý các hợp chất hữu cơ và loại màu thuốc nhuộm, các hợp chất của phenols.Khả năng sinh laccaza và hiệu suất phân hủy dịch chiết đất (DCĐ) ô nhiễm chất diệtcỏ chứa chủ yếu đồng loại dioxin 2,3,7,8-TCDD, PAH, thuốc bảo vệ thực vật thuộcPOPs từ một số công trình như:

Theo Đặng Cẩm Hà và cộng sự năm 2009 nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩnphân lập từ xử lý sinh hoc tẩy độc nước thải bị ô nhiễm 2, 4, 6- trinitrotoluene, đã xác

đinh được vi khuẩn Achromobacter sp BQNT2 sinh laccaza với hoạt tính 15 U/L trên

môi trường muối khoáng chứa 100 mg/L TNT, nó được phân lập từ nước thải chứa1600mg/l [8] Năm 2009, Đặng Cẩm Hà cùng nhóm cộng sự khác của mình đã xác

định được hoạt tính sinh tổng hợp laccazacủa chủng nấm sợi Aspergillus sp FNA33,

được phân lập từ đất đang xử lý khử độc ô nhiễm hỗn hợp các thuốc trừ sâu trongbioreactor hiếu khí là 4,3 U/L trên môi trường muối khoáng bổ sung 0,5% glucose vàchứa 300ppm HCH [9].

Theo Đào Thị Ngọc Ánh và các cộng sự, nấm sợi Aspergillus sp FNA1 được

phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu có khả năng sinh enzim laccazavới hoạttính cao nhất sau 1 ngày nuôi cấy là 1.608 U/L trên môi trường Czapek nghèo bổ sung0,2% Tween 80, ở pH 5, nhiệt độ 30°C, 0,1% NaCl và trên nguồn chất độc là DDT [2].Theo Nguyễn Thị Lan Anh cùng các cộng sự của mình vào năm 2011, đã xác

định được hoạt tính laccaza của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp XKDNP22 được

phân lập

trong xử lý đất diệt cỏ/dioxyn tại sân bay Đà Nẵng, nuôi trên môi trườngGauseM 1/5 bổ sung 4g dịch chiết malt, dịch chiết đất và 6 g/L KNO3 là 4.688 U/L.[1].

Theo Hoàng Thị Nhung và các cộng sự của mình vào năm 2012 đã xác định

được khả năng sinh laccazacủa chủng nấm sợi Trichoderma sp FCP3 phân lập từ rừng

Quốc gia Cúc Phương với hoạt tính là là 2.000 U/L ở pH 5,5; chất cảm ứng là CuSO4,glucose, nguồn nitơ là hỗn hợp KNO3 và NaNO3 [20].

Theo Đàm Thúy Hằng cùng cộng sự vào năm 2012, đã xác định chủng xạ khuẩn

Streptomyces sp XKBH13 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxyn tại sân bay Biên

Hòa, có khả năng sinh laccaza cao nhất sau 24 giờ với hoạt tính 3.747 U/L được nuôitrong môi trường chứa dịch chiết malt, 1 mM catechol và sử dụng dịch chiết đất ônhiễm chứa dioxyn và các chất chứa clo khác làm nguồn cacbon [10].

Năm 2012,theo Nguyễn Quang Huy và cộng sự đã xác định được hoạt tính của

enzim laccaza do chủng xạ khuẩn Streptomyces sp XKBH1 đã được phân lập từ đất

nhiễm chất diệt cỏ tại sân bay Biên Hòa là 1.073 U/L trong môi trường KG chứaveratryl alcohol nồng độ ban đầu 0,5 mM [13].

Năm 2014, theo Nguyễn Thị Lan Anh và nhóm nghiên cứu của mình, đã cho hỗnhợp ba chủng nấm FBV25, FBV28 và FNBLa1 (tỉ lệ 5 : 3 : 2) cố định lên vật liệu PPcó khả năng sinh tổng hợp laccaza (500 U/L) đã được lựa chọn nhằm nghiên cứu hiệuquả loại màu màu xanh hoạt tính trong nước thải có nồng độ 240 mg/L Nhận thấy,khả năng loại màu của vi sinh vật khi được cố định hay không cố định trên vật liệu PP,khi có mặt hay không có mặt của chất gắn kết ViO, đều có hiệu suất loại màu gần nhưtương đương nhau, khoảng 45 - 50 % sau 24 - 72 giờ Khi bổ sung hỗn hợp cám và bộtđậu tương vào bình xử lí, hiệu suất loại màu không tăng so với mẫu đối chứng và duytrì ở 40 % cho đến 168 giờ Ngược lại, hiệu suất loại màu ở các thí nghiệm còn lại tiếptục tăng đến 70 - 85 % sau 72 giờ Điều này khẳng định chất gắn kết ViO không có vaitrò trong quá trình loại màu xanh dương hoạt tính trong nước thải ở nhà máy nhuộmNam Định Loại màu và phân hủy thuốc nhuộm thường được thực hiện bởi nấm đảmtrắng do sự oxy hóa của các hệ enzim ligninolytic như lignin peroxidase, manganperoxidase và laccaza Điều này chứng tỏ laccaza đã tham gia vào phản ứng phá vỡcấu trúc hay làm thay đổi nhóm chức của thuốc nhuộm màu xanh hoạt tính [3].

Theo Phùng Khắc Huy Chú(2018), đã tiến hành nghiên cứu khả năng loại màuthuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzimlaccaza, trong luận án tiến sĩ của mình đã đánh giá khả năng phân hủy đồng loại2,3,7,8-TCDD thuần khiết bởi đơn chủng FBV40 và hỗn hợp 3 chủng FBV40,FBD154 và FNBLa1 với độ độc ban đầu là 2.000 ng-TEQ/L Kết quả, sau 10 ngàyđược thể hiện trong bảng 1.4

Bảng 1.4 Khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD bởi đơn chủng và hỗn hợp chủng

Công thức thí nghiệm Hiệu suất phân hủy (%)Đơn chủng FBV40 và đồng loại 2,3,7,8-

Các công trình nghiên cứu đã được công bố quốc tế và Việt Nam về nghiên cứuphân hủy sinh học dioxin cho thấy khả năng loại bỏ chất ô nhiễm có độ độc cao này cótriển vọng.

Nghiên cứu được thực hiện bởi Takada vàcộng sự đã chứng minh khả năng phânhủy sinh học các PCDD/F có hàm lượng ban đầu là 50 ng bởi nấm mục trắng P.Sordida YK-624 khi nuôi cấy trên môi trường nghèo nitơ thì 40 -76% các PCDD và45-70% PCDF đã bị phân hủy Toàn bộ PCDD và PCDF đã bị phân hủy và hiệu suấtphân hủy tăng lên khi bổ sung glucose khả năng phân hủy đạt tương ứng là 75 và 70%.Kết quả nghiên cứu này rất có ý nghĩa khi nhìn nhận tiềm năng của chủngnấm trắng với quá trình phân hủy dioxin trong môi trường [39].

Theo Kunichika và các cộng sự của mình đã chứng minh nấmsợi Acremonium

sp có khả năng phân hủy đất nhiễm dioxin, khả năng phân hủy DD, 2,3,7-TriCDD vàOCDD, sản phẩm phân hủy DD là tạo thành catechol, chất này sau đó được trao đổichất tiếp đến cis-cis-muconate; trong khi đó phân hủy 2,3,7- TriCDD và OCDD tạothành catechol chứa 1-3 clo và catechol không chứa clo [33].

Khi nghiên cứu khả năng phân hủy PCDD/F trong đất ô nhiễm, hai loài nấm G.luteofolius, P.velutina và S rugosoannulata đã phân hủy được 61% và 70%, ở mẫu đối

chứng (không có vi sinh vật) không thấy sự phân hủy PCDD/F.

Sau 10 đến 12 tuần sự phân hủy của loài S rugosoannulata đối với đồng loại

1,2,3,4,6,7,8 HpCDF là 65%, trong khi loài G.luteofolius và P velutina phân hủy đồngloại trên đạt 74 và 68% Trong quá trình nghiên cứu đã xác định được sự hình thànhCO2 trong quá trình phân hủy, kết qủa thu được chứng tỏ chủng nấm nghiên cứu đãsinh trưởng trong quá trình xử lý và đóng vai trò phân hủy PCDD/F trong đất Kết quảnghiên cứu đã cung cấp thêm bằng chứng về vai trò của chủng nấm trong việc phânhủy PCDD/F trong đất.

Những kết quả nghiên cứu công bố quốc tế về khả năng phân hủy chất diệt cỏ vàcác đồng loại của PCDD và PCDF bởi các chủng nấm đảm, nấm sợi bằng đơn và hỗnhợp chủng đã có những bước tiến triển rõ ràng Tuy nhiên những số liệu phân hủy chủyếu tập trung vào các đồng loại ít clo, tổng độ độc trung bình không cao và nồng độthử nghiệm thấp và ở điều kiện phòng thí nghiệm.

Ở Việt Nam đã thành công trong xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bằngphương pháp kích thích vi sinh vật bản địa nhưng còn cách tiếp cận khác như xử lýbằng tổ hợp của các chủng vi sinh vật sinh enzim ngoại bào như laccaza, loạt enzimnội bào, ngoại bào cho đến nay thì có ít nghiên cứu thực hiện Việc nghiên cứu, sửdụng tổ hợp enzim cũng như hỗn hợp VSV sinh tổng hợp enzim khả năng phân hủyhàng loạt chất ô nhiễm như các đồng loại khác của dioxin trong đó có đồng loại2,3,7,8-TCDD, chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T cũng như các chất trao đổi của 2 nhóm chấtô nhiễm trên còn ít Các công trình nghiên cứu đều sử dụng dịch chiết từ đất ô nhiễmnặng, chất diệt cỏ và đồng loại 2,3,7,8-TCDD tinh khiết với hàm lượng cao hơn,hướng đích rõ ràng và khả năng phân hủy chúng chủ yếu là vi khuẩn, xạ khuẩn và mộtsố nấm sợi Chưa có công trình nào công bố nấm đảm từ rừng Việt Nam có khả năngphân hủy được không chỉ chất diệt cỏ mà còn cả đồng loại dioxin độc nhất là 2,3,7,8-TCDD [5].

Các loại laccaza được sinh bởi một số nghiên cứu ở trên đã thể hiện sự khác biệtso với laccaza thật bởi khi đun vài giờ chúng vẫn phân hủy được các chất hữu cơ đavòng thơm.Những kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng và khả năng rất cao của cácchủng vi sinh vật sinh tổng hợplaccazatừ tự nhiên sẽ được ứng dụng trong việc xử lýcác chất ô nhiễm có vòng thơm.

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu nấm lớn có kí hiệu: HB19.01, HB19.06, HB19.08, XS19L003,XS19L013, XS19T005, XS19T027, LC tại VQG Xuân Sơn, tỉnh Phú Thọ và tại Khubảo tồn thiên nhiên Thượng Tiến, huyện Kim Bôi, tỉnh Hòa Bình.

Môi trường PDA (CT 1)- Thạch Agar

- Đường Dextrose - Dịch chiết khoai tâyMôi trường PGA (CT 2)- Thạch Agar

- Đường Glucose- Dịch chiết khoai tâyMôi trường hữu cơ (CT 3)- Dịch chiết khoai tây- Giá đỗ

- Cám ngô/ gạo

- Đường Glucose- Thạch Agar

Môi trường vô cơ (CT 4)- Pepton

- Đường Glucose- Thạch agar- MgSO4.7H2O- K2HPO4- KH2PO4

Môt trường (CT 5)- Thạch Agar- Đường Dextrose - Dịch chiết khoai tây- Axit Tannic 0,5%

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp luận (Cách tiếp cận)

- Tiếp cận thu thập thông tin- Nghiên cứu tài liệu

- Thực nghiệm trong phòng thí nghiệm

Thu thập, tham khảo, kế thừa các tài liệu, số liệu có liên quan tới hướng nghiêncứu do các nhà nghiên cứu, các nhóm nghiên cứu đã công bố làm cơ sở cho việcnghiên cứu.

2.4.3 Phương pháp khảo sát, theo dõi khả năng lan sợi của hệ sợi nấm ở một số môi trường khác nhau.

Để xác định điều kiện môi trường thích hợp nhất cho việc bảo quản và nhângiống phù hợp cũng như đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzimlaccazatừ hệ sợi củamột số nấm lớn VQG Xuân Sơn, tỉnh Phú Thọ và huyện Kim Bôi, tỉnh Hòa Bình, tatiến hành nuôi cấy trong một số công thức môi trường sau:

*) Môi trường PDA (Công thức 1 - CT 1): [6]- Đường Dextrose: 20g/l

- Dịch chiết khoai tây: 750mml/l- Thạch Agar: 20g/l.

*) Môi trường PGA (Công thức 2 - CT 1): [6]- Đường Glucose: 20g/l

- Dịch chiết khoai tây: 750mml/l- Thạch Agar: 20g/l.

Nuôi cấy 1 -2 ngày trong tủ ấm sau đó theo dõi hệ sợi nấm ở nhiệt độ 28 - 30oC

*) Môi trường hữu cơ (Công thức 3 - CT 2): [6]- Dịch chiết khoai tây: 750g/l

- Giá đỗ: 100g/l- Cám ngô/ gạo: 30g/l- Đường Glucose: 20g/l- Thạch Agar: 17g/l

Tiến hành nuôi cấy 1 - 2 ngày trong tủ ấm sau đó theo dõi sự phát triển hệ sợinấm ở nhiệt độ 28 - 30oC

*) Môi trường vô cơ (Công thức 4 - CT 3) : [6]- Pepton: 4g/l

- Đường Glucose: 20g/l- Thạch agar: 20g/l- MgSO4.7H2O: 1g/l- K2HPO4: 1g/l- KH2PO4: 1g/l

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, tiến hành đồng thời với 03 công thức môi trường.Cách tiến hành làm 3 môi trường được thể hiện rõ ở Phụ lục 1

Các chỉ tiêu theo dõi: Tốc độ lan sợi (đo đường kính hệ sợi), màu sắc và đặcđiểm hình thái hệ sợi nấm (hệ tơ dày hay mỏng, có màu sắc gì)

Đánh giá tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm: V = D/T + V: Tốc độ mọc của hệ sợi (mm/ngày) + D: Đường kính hệ sợi nấm (mm)

+ T: Thời gian hệ sợi nấm mọc trên đĩa petri (ngày)

Cách tiến hành thí nghiệm: Các môi trường hấp khử trùng ở 121oC, tương đương1 atm, trong thời gian 60 phút Sau khi khử trùng môi trường để nguội xuống khoảng500C tiến hành đổ vào đĩa petri đã khử trùng khô ( 1700C / 2giờ) khoảng 20ml rồi dùngtay xoay tròn cho môi trường dàn đều trong đĩa, để nguội Tiến hành cấy giống vào đĩavà nuôi cấy theo từng môi trường Sau khi cấy 2 ngày, theo dõi đo đường kính của hệsợi nấm cho tới khi hệ sợi lan hết bề mặt thạch

Kết hợp theo dõi, nhận xét hệ sợi nấm và màu sắc

2.4.4 Phương pháp phân tích (soi kính hiển vi)

- Bước 1: Làm tiêu bản

Nhỏ một giọt nước cất nhỏ lên lam kính, sau đó dùng nhíp đã sát trùng gắp lấy một ít hệ sợi của mẫu nấm đã cấy thuần, tiếp tục lấy lamen kính đậy lên.

- Bước 2: Soi hệ sợi mẫu nấm

Quan sát tiêu bản mẫu ở vật kính 4x, 10x, 40x Tiếp đó, nhỏ một giọt dầu soi kính (Immersion oil) lên tiêu bản để soi mẫu ở vật kính 100x.

Lưu ý: Khi soi kính với dầu ở vật kính 100x, chỉ được phép quay lại quan sát ở vật kính (4x) và (100x).

2.4.5 Phương pháp phân lập, sàng lọc các mẫu nấm có khả năng sinh tổng hợp enzim laccaza

Sử dụng phương pháp đinh tính để tiến hành thí nghiệm phân lập các mẫu nấmcó khả năng sinh tổng hợp enzim laccaza, ta sử dụng công thức môi trường (CT 5)[21]

- Đường Glucose: 20g/l- Dịch chiết khoai tây: 750g/l- Thạch Agar: 17g/l

Chuyển (cấy chuyền) nấm

- Dùng que cấy, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn.

- Cắt một miếng môi trường có agar và khuẩn ty hình vuông hay hình tròn cókích thước (1 cm2).

- Chuyển sang môi trường mới bằng cách úp miếng agar có khuẩn ty nấm đặt vàochính giữa đĩa thạch trên mặt môi trường mới

Hình 2.1: Phương cách cấy chuyển nấm từ môi trường cũ sang môi trường mới

Cấy sợi nấm từ các mẫu nấm đã được cấy thuần sang đĩa peptri chứa môi trường(MT 5) và được ủ 28 - 30 0C trong 6 - 8 ngày Quan sát sự hình thành quầng màu,cóquầng màu nâu hoặc nâu đen xuất hiện chứng tỏ mẫu nấm đó có khả năng sinh tổnghợp enzimlaccazado sự phân huỷ axit tanic do enzim, và ngược lại, nếu không cóquầng màu xuất hiện là mẫu nấm đó không có khả năng sinh tổng hợp enzim laccaza.

2.4.6 Phương pháp thống kê xử lý số liệu

Kết quả được Phân tích và xử lý bằng phần mềm Microsoft excel.

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu sự phát triển của hệ sợi nấm lớn ở môi trường hữu cơ và môi trường vô cơ.

Sau khi tiến hành tách thuần hệ sợi nấm lớn của 8 mẫu nấm lớn, em tiến hànhnghiên cứu sự phát triển của hệ sợi nấm lớn ở các môi trường khác nhau, đó là môitrường hữu cơ và môi trường vô cơ với mục đích tìm ra môi trường thích hợp để hệ sợinấm lớn phát triển và môi trường nuôi giữ hệ sợi Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 : Đường kính trung bình hệ sợi phát triển của các mẫu nấm lớn.

1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 120

Ngàyd (mm)

Hình 3.1 Theo dõi sự phát triển của hệ sợi nấm HB19.01

Dựa vào hình 3.1, cho thấy sự phát triển hệ sợi của mẫu nấm có kí hiệu làHB19.01trên 3 MT , ta thấy ở MT CT 3 hệ sợi phát triển nhanh hơn 2 MT CT 2 và CT4 Cụ thể, MT CT 3 một ngày đường kính phát triển trung bình khoảng 6 – 7 mm vàsau 7 ngày cấy thì mọc tràn bề mặt đĩa thạch; MT CT 2 một ngày đường kính pháttriển trung bình khoảng 5 – 6 mm và sau 7 ngày cấy thì mọc tràn bề mặt đĩa thạch; MTCT4 một ngày đường kính phát triển trung bình khoảng 4 -5 mm và sau 12 ngày cấythì mọc tràn bề mặt đĩa thạch.

Ngàyd (mm)