NGHIÊN cứu PHÂN lập BACTERIOPHAGE PHÂN GIẢI VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI từ môi TRƯỜNG nước

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHẠM THỊ HÒA NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP BACTERIOPHAGE PHÂN GIẢI VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI TỪ MƠI TRƯỜNG NƯỚC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2015 – 2019 HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHẠM THỊ HÒA NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP BACTERIOPHAGE PHÂN GIẢI VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC Ngành đào tạo: Xét nghiệm Y học Mã ngành: 52720332 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2015 – 2019 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN TRỌNG TUỆ HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Việc tiến hành nghiên cứu làm đề tài khóa luận giúp em học hỏi nhiều điều, từ kiến thức y khoa, phương pháp làm nghiên cứu khoa học đến tác phong kinh nghiệm làm việc Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu, phòng Quản lý Đào tạo Đại học Trường Đại học Y Hà Nội tồn thể thầy, Bộ mơn Khoa học xét nghiệm Trường Đại học Y Hà Nội tận tình truyền thụ kiến thức cho em suốt trình em học tập để hồn thành khóa luận TS Nguyễn Trọng Tuệ - Giảng viên môn Khoa học xét nghiệm, Khoa Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy tận tình dìu dắt, giúp đỡ hướng dẫn em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin trân trọng cảm ơn tập thể thầy, cô anh chị Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, thầy Nguyễn Minh Hoan - Giảng viên môn Vi sinh, Khoa Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội dành cho em giúp đỡ quý báu trình thực đề tài Em xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè người thân động viên tinh thần giúp đỡ em q trình hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày 23 tháng năm 2019 Sinh viên Phạm Thị Hịa CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Kính gửi: Phịng Đào Tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cam đoan: Đây khóa luận thân tơi trực tiếp thực hướng dẫn TS Nguyễn Trọng Tuệ Nghiên cứu không trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp nhận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm cam kết Hà Nội, ngày 23 tháng năm 2019 Sinh viên Phạm Thị Hòa DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp : Base pair DNA : Deoxyribonucleic Acid E.coli : Escherichia coli EAEC : Enteroadherent E coli EHEC : Enterohaemorragic E coli EIEC : Enteroinvasive E coli EPEC : Enteropathogenic E coli ETEC : Enterotoxigenic E coli MRSA : Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus NDM : New Delhi Metallo Beta lactamase PCR : Polymerase Chain Reaction SNP : Single Nucleotide Polymorphism STEC : Shiga Toxin producing E coli TKT : Thực khuẩn thể UPEC : Uropathogenic E coli MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Từ Alexander Fleming (1881-1955) tìm kháng sinh penicillin nay, số lượng kháng sinh nghiên cứu lên tới 5000 Sự đời kháng sinh xem thần dược mang lại sống cho hàng trăm triệu người giới Do tình trạng dùng thuốc kháng sinh không theo đơn, không liều lượng… dẫn đến việc số lượng kháng sinh bào chế không bắt kịp với xuất loại vi khuẩn gây bệnh Khả kháng lại kháng sinh vi sinh vật ngày đe dọa đến việc điều trị bệnh nhiễm trùng vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm gây Trên giới Việt Nam tình trạng kháng kháng sinh diễn ngày phổ biến ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp Việt Nam vào nhóm nước kháng sinh bị kháng cao giới Trong E.coli số vi khuẩn kháng thuốc mạnh Từ trạng mà nhà nghiên cứu tìm cách sử dụng bacteriophage, gọi tắt phage hay gọi thực khuẩn thể (TKT) làm liệu pháp điều trị bệnh nhiễm khuẩn thay cho thuốc kháng sinh Các nhà khoa học Viện nghiên cứu Eliava Phage Therapy Center bào chế số loại TKT tương ứng tiêu diệt vi khuẩn đặc hiệu chống lại chứng tiêu chảy E.coli, Shigella hay Vibrio ngăn nhiễm trùng vết thương tác nhân gây bệnh da Staphylococci, Streptococci So với kháng sinh, TKT vượt trội nhiều mặt Thứ nhất, chúng phân bố rộng rãi mơi trường phân lập từ nước biển, nước ngọt, nước thải đất [44] Thứ hai, TKT công vi khuẩn mục tiêu khơng làm hại vi khuẩn có lợi [15] Thứ ba, liệu pháp phage thực đơn giản, độc tính thấp nhanh chóng Đặc biệt, dù vi khuẩn kháng lại chủng TKT này, cịn vơ vàn chủng TKT khác để thay Nghiên cứu trước 10 TKT cho thấy TKT chữa khỏi 90% bệnh nhiễm trùng siêu vi khuẩn mạn tính (viêm màng não, viêm phúc mạc, viêm tủy xương, ) người gây mầm bệnh vi khuẩn kháng kháng sinh Staphylococcus aureus , Pseudomonas aeruginosa, E coli [43] Ở Việt Nam, tình trạng kháng kháng sinh diễn ngày phổ biến mà nghiên cứu TKT mẫu nước chưa nhiều Để đóng góp vào hướng nghiên cứu nhằm góp phần đưa giải pháp khắc phục tình trạng kháng kháng sinh , bước đầu tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập Bacteriophage phân giải vi khuẩn Escherichia coli từ môi trường nước”, với mục tiêu: Phân lập Bacteriophage có khả phân giải E.coli gây bệnh 33 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM DROP-TEST Từ thực nghiệm thu kết đĩa thạch có E.coli xuất vết tan so với thạch có vi khuẩn vùng nhỏ giọt TKT thô lên Thử nghiệm đánh giá E.coli chủng chuẩn cho kết tương tự Điều chứng tỏ TKT dung dịch thơ ban đầu có phản ứng ly giải với E.coli tiếp tục tiến hành kỹ thuật phân lập TKT (b) (a) Hình 3.1 Kết thử nghiệm drop-test E.coli (a) (b) Chủng E.coli phân lập từ mẫu bệnh phẩm Chủng E.coli chuẩn 3.2 KẾT QUẢ KIỂM TRA VẾT TAN CỦA TKT Sau thu kết thử nghiệm drop-test, tiến hành phản ứng ly giải TKT agar hai lớp thu hình ảnh vết tan trải đĩa thạch Qua quan sát thấy bề mặt đĩa thạch có vết tan khác hình dạng kích thước nên cho nhiều 34 loại TKT cho vi khuẩn vật chủ Từ tách dòng phân lập chủng TKT khác cho vật chủ (b) (a) Hình 3.2 Kết khảo sát vết tan thực khuẩn thể agar a b Khơng pha lỗng Độ pha lỗng 10-2 3.3 KẾT QUẢ TÁCH DỊNG THỰC KHUẨN THỂ Sau thu hình ảnh vết tan riêng rẽ, chúng tơi tiếp tục tiến hành pha lỗng vết tan dung dịch SM Buffer với mức nồng độ khác làm thử nghiệm agar hai lớp để đánh giá độ đồng hình dạng vết tan Sau lần lặp lại bước thu kết có đồng hình dạng vết tan hình sau: 35 Hình 3.3 Kết tách dòng thực khuẩn thê 3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT PHỔ KÝ CHỦ Sau tiến hành thử nghiệm drop-test chủng vi khuẩn khác bao gồm P.aeruginosa, K pneumoniae S aureus, thu kết không xuất vết tan tất đĩa thạch Điều chứng tỏ TKT thu đặc hiệu chủng E coli mà không đặc hiệu chủng vi khuẩn mà chúng tơi thử nghiệm Hình 3.4 Kết khảo sát phổ ký chủ vi khuẩn P.aeruginosa, K pneumoniae S aureus (thứ tự từ trái sang phải) 36 3.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI Đoạn gen chứa DNA tách từ chủng E coli chuẩn chủng phân lập từ bệnh phẩm khuếch đại phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu theo quy trình 2.3.6, sau sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% Kết minh họa hình 3.5 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen độc lực fimH vi khuẩn E coli gel agarose 1.5% Giếng M: Marker 1kb Giếng (+): đối chứng dương, DNA tách từ chủng E.coli chuẩn ATCC (25922) Giếng E1, E2: chủng E coli tách từ mẫu bệnh nhân Giếng (-): đối chứng âm Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR cho thấy tất mẫu gồm băng sáng nhất, rõ nét, khơng có băng phụ, khơng bị smear, kích thước khoảng 500bp 37 Chương BÀN LUẬN 4.1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP THỰC KHUẨN THỂ TKT có mặt tất nơi tồn vi khuẩn với phân bố đa dạng, phong phú Vì ngồi mơi trường nước, phân lập TKT đất ruột vật nuôi Việc phân lập TKT khơng q khó khăn, phụ thuộc vào mật độ TKT mẫu, khả hoạt động vật chủ, quy trình thao tác thực Phát TKT có khả phân giải E.coli đóng góp phần vào hướng điều trị thay kháng sinh TKT cho đối tượng bị nhiễm chủng vi khuẩn kháng thuốc Từ nhà nghiên cứu tiếp tục thực phương pháp định danh TKT xác định TKT đặc hiệu với loại vi khuẩn để áp dụng vào điều trị Một số nghiên cứu thành công việc phân lập TKT: Tanji ctv (2004) phân lập TKT ký sinh E coli từ phân đất trại nuôi gia súc Tokyo, Nhật Bản Nguyễn Cửu Thị Hương Giang ctv (1979) phân lập TKT ký sinh vi khuẩn Pseudomonas gây bệnh trồng [1] Trong quy trình nghiên cứu phân lập TKT, phương pháp khảo sát vết tan agar hai lớp sử dụng phổ biến Đây phương pháp đơn giản, tốn chi phí nguyên vật liệu, thao tác dễ thực hiệu cao Từ q trình thao tác kỹ thuật, chúng tơi rút số điều cần lưu ý sau: việc chọn loại môi trường phù hợp với phát triển vi khuẩn đồng thời dễ quan sát vết tan TKT Thứ hai trạng thái lớp thạch không khô ẩm ảnh hưởng đến trình ly giải vi khuẩn Thứ ba phải giữ lớp thạch sau nhiệt độ thích hợp để tạo thành lớp thạch mịn, khơng bị vón cục Thứ tư khơng nên trộn mạnh hỗn hợp dung dịch tạo bọt lên mặt thạch mà nên gõ nhẹ ngón tay, đảo ngược 38 ống falcon sử dụng máy trộn Vortex cài đặt thấp ống eppendorf Cuối không nên để đĩa thạch tủ ấm thời gian quy định vi khuẩn phát triển mạnh che lấp vết tan gây sai lệch kết Phân lập TKT việc làm cần thiết để xác định loại vi khuẩn có bị tiêu diệt TKT hay không, dựa vào khả gây bệnh vi khuẩn vật chủ mà tiêu diệt mang lại ý nghĩa 4.2 PHƯƠNG PHÁP TÁCH DỊNG TKT Việc tách dịng TKT có vai trị việc xác định chủng TKT, kiểm tra tính chất chế hoạt động loại TKT, từ ứng dụng vào việc điều trị bệnh Huff ctv (2002) thành công sử dụng TKT điều trị viêm đường hô hấp E coli gây gà thịt Mỹ [1] Kết phản ứng ly giải vi khuẩn TKT agar hai lớp cho thấy TKT hoạt động theo chế làm giảm loại bỏ màng tế bào vi khuẩn [8] TKT bám vào điểm thụ cảm tế bào vi khuẩn bề mặt cuối sau tiêm vật liệu di truyền vào sử dụng máy trao đổi chất vật chủ để nhân lên, dẫn đến phân giải tế bào giải phóng TKT bên màng tế bào [9] Phương pháp tách dòng liên quan đến ứng dụng trộn TKT có loại vật chủ làm tăng phổ ký chủ [16] 4.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT PHỔ KÝ CHỦ Đa số TKT lây nhiễm loại vi khuẩn định Tuy nhiên số nghiên cứu phạm vi vật chủ TKT chứng minh biến đổi cao tính đặc hiệu, từ TKT có phạm vi vật chủ cực hẹp lồi đến TKT lây nhiễm vi khuẩn qua chi Do TKT có tính đặc hiệu cao ký chủ nên TKT có phổ ký chủ rộng hữu ích việc kiểm soát dịch bệnh vi khuẩn gây Bên cạnh đó, để tăng hiệu điều trị bệnh vi khuẩn gây phối hợp nhiều TKT khác Như vậy, 39 sử dụng kết hợp nhóm thực khuẩn thể có phổ ký chủ rộng phân lập từ nước để điều trị bệnh Phạm vi vật chủ TKT yếu tố việc dự đốn cách thức TKT hình thành cộng đồng vi khuẩn [18] Khi gen mã hóa độc lực chuyển giao lồi vi khuẩn khả TKT chống lại mầm bệnh vi khuẩn tăng lên [21] Trong số 13 phage phân lập từ phyllosphere, phage có khả lây nhiễm hai lồi Pseudomonas Erwinia cịn hầu hết có khả lây nhiễm nhiều mầm bệnh P syringae [17] Kết thu cho thấy mẫu nước chứa TKT đặc hiệu chủng E coli 4.4 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH GEN ĐỘC LỰC FIMH CỦA E.COLI FimH gen độc lực giúp E coli bám dính vào thụ thể xâm nhập vào tế bào khác Sự có mặt gen nguyên nhân gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng đường tiết niệu đường hô hấp Nghiên cứu Trương Thị Bích Vân ctv (2018) xác định tỉ lệ gen fimH gây bệnh gà tỉnh Đồng sông Cửu Long Kaczmarek cộng đánh giá phát gen mã hóa yếu tố độc lực số chủng E coli có kháng nguyên K1 chủng E coli khơng có K1 [49] Các nhà nghiên cứu phát gen fimH tồn tất chủng E coli có kháng ngun K1 97% chủng khơng có kháng nguyên K1 Hơn nữa, việc phân tích gen fimH SNP công cụ để nghiên cứu dịch tễ học chủng E coli liên quan đến cộng đồng bệnh viện, đồng thời sử dụng xét nghiệm sàng lọc rẻ, dễ dàng để phân tích kiểu gen UPEC [50] Do đó, nghiên cứu yếu tố độc lực vi khuẩn dẫn đến việc phát triển phương pháp để chẩn đốn phịng ngừa bệnh liên quan đến nhiễm trùng đường tiết niệu UTI 40 (Urinary Tract Infection) Kết xác định có gen fimH chủng vi khuẩn E.coli phân lập từ bệnh nhân chủng chuẩn, chứng tỏ chủng vi khuẩn nghiên cứu có khả gây bệnh Điều góp phần nâng cao ý nghĩa việc phân lập TKT có khả ly giải chủng vi khuẩn mang gen độc lực 41 KẾT LUẬN Căn vào kết phân tích trên, nghiên cứu phân lập Bacteriophage – Thực khuẩn thể có khả phân giải vi khuẩn E.coli gây bệnh người TÀI LIỆU THAM KHẢO Louie M, Azavedo J, Handelsman M, Clark C, Ally B, Dytoc M (1993) Expression and characterization of the eaeA gene product of Escherichia coli serotype O157:H7 Infect Immun 61, 4085 - 4092 Terrance MA, Genevieve ABG, Mildred RB, Koohmaraie M (2002) Prevalence and Characterization of Non-O157 Shiga Toxin - Producing Escherichia coli on Carcasses in Commercial Beef Cattle Processing Plants App Environ Microbiol 68, 4847 - 4852 O’Flynn G, Ross R.P, Fitzgerald G.F, Coffey A (2004) Evaluation of a cocktail of three bacteriophages for biocontrol of Escherichia coli O157: H7 App Environ Microbiol 70, 3417–3424 Jothikumar N, Reddy C.G, Sundaria R.B, Saigopalb D.V.R (2000) Isolation of coliphages specific to enterotoxigenic E.coli (ETEC) J Environ Monit 2, 372–374 Cerveny, K E., DePaola, A Duckworth, D H.,Gulig, P.A (2002) Phage therapy of local and systemicdisease caused by Vibrio vulnificus in irondextran-treated mice Infect Immun 70(11), 6251-6262 Bacteriophage therapy treats patient near death with MDR Acinetobacter baumannii - Outbreak News Today Kropinski ctv (2009) Double agar – plaque assay Alves DR, Gaudion A, Bean JE, Perez Esteban P, Arnot TC, Harper DR et al (2014) Combined use of bacteriophage k and a novel bacteriophage to reduce staphylococcus aureus biofilm formation Appl Environ Microbiol 80(21): 6694–703 Donlan RM (2009) Preventing biofilms of clinically relevant organisms using bacteriophage Trends Microbiol 17(2), 66–72 10 Brussow H, Canchaya C, Hardt WD (2004) Phages and the evolution of bacterial pathogens: from genomic rearrangements to lysogenic conversion Microbiol Mol Biol Rev 68, 560–602 11 Twort, F.W (1915) An investigation on the nature of ultra - microscopic viruses The Lancet 186 (4814): 1241–1243 12 D'Herelle F (1917) Sur un microbe invisible antagoniste des bacilles dysenteriques [An invisible microbe that is antagonistic to the dysentery bacillus] Comptes Rendus (in French) 165: 373–375 13 Shasha SM, Sharon N, Inbar M (February 2004) "Bacteriophages as antibacterial agents" Harefuah (in Hebrew) 143 (2), 121–5, 166 14 “Felix d’Herelle and Our Microbial Future” (2012) Future Microbiology 1337–1339 15 Sulakvelidze, A and E Kutter (2005) Bacteriophage Therapy in Humans Bacteriophages: Biology and Applications CRC Press, Boca Rutan FL., 381-436 16 Oliveira, F R el at (2009) Emergency of seedlings of Moringa oleifera Lam irrigated with water of different levels of salinity Biosci J 25 (5): 66–74 17 Koskella B, Meaden S.( 2013) Understanding bacteriophage specificity in natural microbial communities Viruses.5(3):806-23 18 Gómez P., Buckling A (2011) Bacteria-phage antagonistic coevolution in soil Science 332:106–109 19 Kutateladze M, Adamia R (2008) Phage therapy experience at the Eliava Institute Med Mal Infect 38, 426–430 20 Fish R, Kutter E, Wheat G, Blasdel B, Kutateladze M, Kuhl S(2016) Bacteriophage treatment of intransigent diabetic toe ulcers: a case series J Wound Care 7, S27–S33 21 Griffiths R.I et al (2011) The bacterial biogeography of British soils Environ Microb 13:1642–1654 22 Kutateladze M, Adamia R (2010) Bacteriophages as potential new therapeutics to replace or supplement antibiotics Trends Biotechnol 28, 591–595 23 Foxman B (2010) The epidemiology of urinary tract infection Nat Rev Urol 7, 653-60 24 Kaper JB, Nataro JP, Mobley HL (2004) Pathogenic Escherichia coli Nature Rev Microbiol 2, 123-40 25 Kim KS (2012) Current concepts on the pathogenesis of Escherichia coli meningitis: implications for therapy and prevention Curr Opin Infect Dis 25, 273-8 26 Lanata CF, Fischer-Walker CL, Olascoaga AC, Torres CX, Aryee MJ, Black RE (2013) Child Health Epidemiology Reference Group of the World Health Organization and UNICEF Global causes of diarrheal disease mortality in children