NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận nà

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG

NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2017

LỜI CẢM ƠN

Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn ThS Cao Bá Cường, nguời thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Đặc biệt là sự giúp đỡ, động viên của gia đình, bạn bè tôi trong suốt thời gian làm khóa luận

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tôt nhất, tuy nhiên do buổi đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô giáo để khóa luận hoàn chỉnh hơn

Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 4 tháng 5 năm 2017 Sinh viên

Trịnh Thị Hoài Thu

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin khẳng định những gì viết trong khóa luận “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già” là kết qủa nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự

hướng dẫn trực tiếp của ThS Cao Bá Cường, giảng viên khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Tất cả những số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, không trùng với bất cứ tài liệu nào

Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2017 Sinh viên

Trịnh Thị Hoài Thu

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

5 Nội dung nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về màng CVK 4

1.1.1 Vi sinh vật tổng hợp CVK 4

1.1.2 Cấu trúc của CVK 4

1.1.3 Đặc tính của màng CVK tạo bởi A xylinum 5

1.1.4 Môi trường nuôi cấy A xylinum 5

1.1.5 Các phương pháp sản xuất CVK từ A xylinum 7

1.1.5.1 Lên men tĩnh 7

1.1.5.2 Lên men động 7

1.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn trên thế giới và tại Việt Nam 8

1.2.1 Trên thế giới 8

1.2.2 Ở Việt Nam 9

1.3 Tổng quan về Berberin 9

1.3.1 Công thức hóa học và tính chất 9

1.3.1.1 Công thức hóa học 10

1.3.1.2 Nguồn gốc 10

1.3.1.3 Tính chất vật lý 10

1.3.1.4 Tính chất hóa học 11

1.3.1.5 Tác dụng 11

1.4 Tình hình nghiên cứu Berberin trên thế giới và tại Việt Nam 12

1.4.1 Trên thế giới 12

1.4.2 Ở Việt Nam 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Vật liệu nghiên cứu 14

2.1.1 Giống vi khuẩn 14

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất 14

2.2 Thiết bị và dụng cụ 14

2.2.1 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 14

2.2.2 Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp tạo màng CVK 15

2.3.2 Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc 16

2.3.3 Phương pháp xây dựng đường chuẩn của BH 18

2.3.4 Phương pháp pha môi trường đệm PBS ( Phosphate buffered saline) 20 2.3.5 Phương pháp đưa thuốc BH vào màng CVK để hấp thụ 20

2.3.6 Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK 21

2.3.7 Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng từ màng CVK 21

2.3.8 Phương pháp phân tích dược động học giải phóng của BH 22

2.3.9 Phương pháp xử lý thống kê 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Màng BC được nuôi cấy từ môi trường nước dừa già 23

3.2 Thu màng CVK thô từ môi trường 24

3.3 Tinh chế màng CVK 24

3.4 Lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK 25

3.5 Xác định lượng thuốc BH giải phóng khỏi màng CVK 26

3.6 Dược động học giải phóng thuốc BH của màng CVK – BH 31

1 Kết luận 34

2 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của BH 10

Hình 2.1 Dùng máy khuấy từ khuấy đều môi trường nuôi cấy 16

Hình 2.2: Sơ đồ tinh chế màng CVK 17

Hình 2.3: Phương trình đường chuẩn của BH 19

Hình 3.1: Màng CVK được nuôi cấy trong môi trường nước dừa già 23

Hình 3.2: Màng CVK thô 24

Hình 3.3: CVK ngâm trong HCl Hình 3.4: Màng CVK sau khi được tinh chế 25

Hình 3.5: Màng CVK dày 0.7cm 25

Hình 3.7: Màng CVK đang hấp thụ thuốc 26

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn OD giải phóng thuốc BH của màng CVK 28

Hình 3.9: Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH =12 30

Hình 3.10: Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH = 2 30

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già 6 Bảng 2.1 Môi trường tạo màng CVK 15 Bảng 2.2: Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch BH ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n = 3) 19 Bảng 2.3: Môi trường đệm PBS với pH 2, 12 20 Bảng 3.1: Khối lượng hấp thụ thuốc BH cuả màng CVK 26 Bảng 3.2: Giá trị OD của BH giải phóng từ màng CVK - BH trong môi trường pH = 2, pH =12 với các độ dày màng khác nhau (n = 3) 27 Bảng 3.3: Tỉ lệ thuốc BH được giải phóng tại các thời điểm lấy mẫu (n = 3) 29 Bảng 3.4: Hệ số tương quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau (n = 3) 32

Berberin có một ưu thế là khi dùng điều trị các nhiễm trùng đường ruột berberin sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh, khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng không mong muốn gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột

Berberin rất lành tính, rất hiếm gặp trường hợp dùng mà bị dị ứng Tuy nhiên đối với những người quá mẫn cảm với thuốc và phụ nữ có thai thì không dùng vì berberin có khả năng gây co bóp tử cung làm ảnh hưởng tới thai nhi

Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) là sản phẩm của một loài vi khuẩn,

đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum Cellulose vi khuẩn và cellulose thực

vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose vi khuẩn bao gồm các liên kết β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hóa khác nhau CVK có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa các hợp chất cao phân tử như

chắc Trên thế giới Cellulose vi khuẩn ngày càng được quan tâm nhiều hơn bởi khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, xử lý nước thải, bảo vệ môi trường… Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu

Kết quả cho thấy màng CVK có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc

Với mục đích tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng A xylium,

từ đó chế tạo màng sinh học để nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc qua màng nhằm hạn chế các tác dụng phụ, khắc phục tính ít tan trong nước và tăng khả dụng sinh học của berberin trong việc điều trị bệnh Đó là lí do chúng tôi đã chọn đề tài:

“Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già”

2 Mục đích nghiên cứu

- Chế tạo màng CVK từ vi khuẩn Acetobacter xylium

- Thiết kế chế tạo hệ thống gồm màng CVK nạp thuốc và nghiên cứu khả năng giải phóng để tạo ra hệ thống giải phóng chậm, kéo dài của thuốc, điều này có thể giúp tăng lượng thuốc hấp thụ vào cơ thể, khắc phục những tác dụng không mong muốn của thuốc Berberin, phát huy được tối đa hiệu quả của thuốc trong điều trị bệnh đường ruột

3 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK, thuốc Berberin dạng chế phẩm và dạng tinh khiết, nước dừa già…

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu in vitro

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng TN Sinh lý học người động vật khoa Sinh- KTNN, Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm

Hà Nội 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

- Ý nghĩa khoa học: Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK

Về mặt khoa học thì việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK vào việc khắc phục hạn chế của thuốc berberin sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới không chỉ dừng lại ở việc khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng trên nhiều các loại thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển hơn

Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của màng CVK để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính cả màng CVK, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều các lĩnh

vực khác nhau

- Ý nghĩa thực tiễn

+ Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter xylinum

+ Từ màng CVK đã được tạo ra được dùng làm hệ thống nhằm khắc phục được những tác dụng phụ không mong muốn

+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn

5 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu quy trình nuôi cấy A xylinum với các nguyên liệu có sẵn

(nước dừa già)

- Thu sản phẩm CVK từ dịch nuôi cấy và tiến hành xử lý màng CVK thu được sau khi nuôi cấy

- Thử nghiệm tác dụng của màng CVK trong quá trình giải phóng thuốc

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về màng CVK

1.1.1 Vi sinh vật tổng hợp CVK

Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A

xylinum được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp

cellulose hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất Cấu trúc của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau

A xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter

Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào [6]

Theo khóa phân loại của Bergey, A xylinum thuộc:

 Lớp: Schizomycetes

 Bộ: Pseudomonadales

 Bộ phụ: Pseudomonadieae

 Họ: Pseudomonadaceae

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang khoảng

0.6 – 0.8 μm, dài khoảng 2-3 μm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy thì hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [6]

1.1.2 Cấu trúc của CVK

Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp lại với nhau thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1.5 nm Đây là những thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một vài loại thực vật Các thớ sợ thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi sợi

tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải Dải có chiều dày 3-4nm, và chiều dài 130-177nm ( Yamanaka et al, 2000) Các dải siêu mịn của cellulose

vi khuẩn có chiều dài từ 1-9µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki at al, 2001)

Màng CVK do A xylinum tạo ra có cấu trúc hóa học đồng nhất với PC, tuy

nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [4]

1.1.3 Đặc tính của màng CVK tạo bởi A xylinum

- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành phần tỉ lệ Iα cao

- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là cellulose I

- Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: Khả năng giữ nước đáng

kể, lực ẩm cao Màng CVK có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút 60 -

- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt

- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: Tinh thể cellulose vi khuẩn có

độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao

- Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ

1.1.4 Môi trường nuôi cấy A xylinum

Môi trường nuôi cấy A xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh

dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố

tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [3]

Nước dừa già là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong nước dừa già chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tố tăng trưởng như 1,3 –

diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol, … Vì vậy A xylinum

rất thích hợp phát triển trong môi trường này [6]

Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để lâu làm cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất kém [6]

Thành phần của nước dừa già [6] được trình bày như ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già

Phosphorus (mg/100g) 20 Vitamin B6 (mg/100g) 0.032 Kali (mg/100g) 250 Folate (µg/100g) 3

Môi trường dinh dưỡng để lên men A xylinum được cho vào các khay

lên men có bề mặt thoáng rộng Trong quá trình lên men các khay được đậy bằng 9 giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30ᴼC Sợi cellulose mới được tổng hợp

sẽ di chuyển lên bề mặt của môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulose nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên Sau 7-10 ngày có thể thu CVk [3, 31]

1.1.5.2 Lên men động

Vi khuẩn A xylinum thường được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy

lắc Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy

đã chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc ổn nhiệt

ở 28-30ᴼC, 180-200 vòng/phút CVK được tạo ra từ môi trường lắc có dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường Lượng O2 hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và khả

năng tổng hợp CVK của vi khuẩn A xylinum Do đó, quá trình lên men đạt

hiệu quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sử dụng để lên men [3, 31]

1.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn trên thế giới và tại Việt Nam

1.2.1 Trên thế giới

Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A xylinum và những ứng dụng của

nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Nghiên cứu của Wei B và cộng sự (2011) cho thấy màng khô CVK thu được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn; Merck KGaA, Darmstadt, Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 kg/cm2 và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24h chống lại hoạt động của S Aureus và B Subtilis [11]

Tác giả Brown (1989), dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho

tế bào Brown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm

Dựa vào đặc tính đặc biệt của CVK như khả năng thấm nước cao, khả năng kết dính chặt chẽ và trơ về mặt hóa học nên CVK có vai trò như màng sinh học Người ta đã dùng màng sinh học để thay thế da tạm thời Ở Brazil, người ta cũng đã ứng dụng thành công màng CVK để làm da nhân tạo

Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng CVK là dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm Các tác giả: Hamlyn và cs (1997), Cienchansk (2004), Legeza và cs (2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs (2006) sử dụng màng CVK đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí bản quyền về làm

màng CVK từ A.xylium dùng trị bỏng Các tác giả Jonas và Farad (1998),

Czaja và cs (2006) đã dùng màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng

da cho phụ nữ [2] Luan J và cs (2012) [12] đã nghiên cứu màng CVK cho băng vết thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến được sử dụng trong điều trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng Kết quả cho thấy sau khi sử dụng màng CVK ngâm tẩm bạc sulfadiazine đắp lên vết thương, hoạt động

kháng khuẩn đối với P aeruginosa, E coli và S aureus đạt hiệu quả tốt hơn

dạng kem bôi hay dung dịch thông thường

1.2.2 Ở Việt Nam

Từ năm 2000, Bộ môn Vi Sinh - Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố

Hồ Chí Minh đã bước đầu nghiên cứu dùng màng CVK từ A xylinum phối

hợp với hoạt chất tái sinh mô của dầu mù u điều trị vết bỏng thực nghiệm cho kết quả tốt

Nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự đã có một số

công trình nghiên cứu về màng CVK từ A xylium và bước đầu nghiên cứu về

các đặc tính màng CVK thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học điều trị

bỏng ở VN [3]

Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như

Quỳnh đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter

xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, kết quả

cho thấy màng CVK tạo bởi A xylinum BNH2 tổng hợ có sợi cellulose nhỏ,

dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển vọng ứng dụng làm

màng trị bỏng [4]

Từ những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trên đã chứng minh CVK

có khả năng tuyệt vời trong việc hấp thu và giải phóng một số loại thuốc qua

da Đây cũng là một hướng đi khả quan trong việc nghiên cứu phát triển ứng dụng màng CVK trong việc hấp thu và giải phóng thuốc BH

1.3 Tổng quan về Berberin

1.3.1.1 Công thức hóa học

- Tên quốc tế: Berberine hydrochloride

- Tên khoa học: 5,6-dihydro-8,9-dimethoxyl-1,3- dioxa 6a - azoniaindeno (5,6

- a) anthracen clorid dihydrat

BH thường có lẫn tạp chất alcaloid khác nhau như: palmatin, jatrorrhizin Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhzin không quá 5%

1.3.1.3 Tính chất vật lý

Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi có vị rất đắng Độ chảy khi ở dạng base là 145ºC (bị phân hủy) Độ tan dạng base tan chậm trong nước, hơi tan trong ethanol, khó tan trong ether Dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400

trong nước, dễ tan trong nước sôi, tan trong ethanol, thực tế không tan trong cloroform và ether Dạng muối Sulfat dễ tan trong nước, tan trong ethanol [13]

1.3.1.4 Tính chất hóa học

Berberin có tính chất như một base yếu, tạo muối bằng cách thay thế nhóm

OH, việc tạo muối Berberin không giống như các alcaloid khác mà muối tạo

thành giống muối của hydroxyd kim loại, nghĩa là có loại phân tử nước [1]

Hóa tính của oxy: Berberin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh, N không vững bền trong môi trường kiềm mạnh, dễ hỗ biến mở vòng cho chức andehyd gọi là berberial [1]

Hóa tính mạnh kép: Berberin có thể mất mạch kép tại nhân giữa để cho các hydro alkaloid không màu [1]

1.3.1.5 Tác dụng

BH có tác dụng kháng khuẩn được dùng chủ yếu trong các bệnh rối loạn

đường tiêu hóa [13]

Berberin có tác dụng kháng khuẩn với shigella, tụ cầu và liên cầu khuẩn, thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh trùng gây bệnh ( kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đường ruột) [14] Những năm gần đây, một số nghiên cứu mới nhất ở nước ngoài đã xác định berberin có tác dụng chống lại nhiều loại vi khuẩn gram dương (nhuộm theo phương pháp gram vi khuẩn bắt màu tím), gram âm (bắt màu đỏ) và các vi khuẩn kháng axit Ngoài ra, nó còn

có tác dụng chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh

BH có tác dụng kìm khuẩn tả và E coli, đặc biệt khi dùng sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột, khi dùng phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đường ruột

Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy, berberin còn có tác dụng hạ huyết áp, cường tim và chống loạn nhịp Các nhà khoa học cũng phát hiện ra khả năng

ức chế bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co cơ, giảm cholesterol và triglyceride, chống đái tháo đường, giảm viêm cho người bị viêm khớp Không dùng berberin cho người quá mẫn với thuốc, phụ nữ có thai (vì thuốc

có khả năng gây co bóp tử cung làm ảnh hưởng tới thai nhi)

1.4 Tình hình nghiên cứu Berberin trên thế giới và tại Việt Nam

1.4.1 Trên thế giới

Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming Zhang và Guang [15] nghiên cứu tạo ra Chitosan tráng (bọc) nano-liposome cho việc phân phối uống berberine hydrochloride Kết quả cho thấy chitosan bọc nano-liposome là hiệu quả hơn so với những người không tráng cho việc cung cấp bằng miệng của BH

Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả và tính an toàn của Berberin trong điều trị bệnh nhân tiểu đường loại 2 [16]

Ryan Bradley, ND, MPH, và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về Berberin

trong bệnh tiểu đường [31]

Gần đây, Lin Huang và cs [17] nghiên cứu việc sử dụng màng CV cho việc kiểm soát in vitro của thuốc berberin Ngoài thẩm thấu qua da, thí nghiệm kiểm soát sự giải phóng thuốc berberin qua màng CV còn được thử nghiệm

mô phỏng trong dạ dày, ruột Các kết quả thu được cho thấy thuốc berberin đã được giải phóng từ màng CV với một tốc độ chậm

1.4.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về Berberin như:

- Vũ Bình Dương, Nguyễn Trọng Diệp, Nguyễn Thị Thùy, Hoàng Văn Lương (2010), Nghiên cứu bào chế viên nén Berberin giải phóng tại đích đại tràng, kết quả đã nghiên cứu bào chế viên nén Bereberin clorid 100 mg giải phóng

tại đích đại tràng theo cơ chế phân hủy bởi hệ vi sinh vật đại tràng [9]

- Phan Quốc Kinh đã nghiên cứu những Alkaloid chiết xuất từ các cây thuốc Việt Nam [8]

- Nguyễn Liêm - chiết xuất Berberin bằng áp lực nóng

- Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm - góp phần nghiên cứu cải tiến quy trình sản xuất Berberin từ cây vàng đắng

- Hồ Đắc Trinh - chiết Berberin clorid trong vàng đắng bằng dung dịch acid

sulfuric loãng [5]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Giống vi khuẩn

Giống vi khuẩn A xylinum thuần chủng được cung cấp bởi phòng thí nghiệm

vi sinh trường ĐHSP Hà Nội 2

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất

 Nguyên liệu: Nước dừa già

 Hóa chất: Sử dụng các hóa chất đặc biệt và các hóa chất thông thường

có nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam

 Bể rung siêu âm S60/H

 Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

 Cân kĩ thuật TE412

 Cân phân tích

 Khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức)

 Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản)