2.2.5.1. Nghiên cứu enzyme collagenase trên thế giới
Trên Thế gới, những nghiên cứu về enzyme collagenase đều chủ yếu tập trung vào tìm kiếm và làm phong phú quỹ gen enzyme từ nhiều nguồn khác nhau. Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu hướng vào tìm kiếm những nguồn gen biểu thị vốn rất đa dạng trong giới vi sinh vật. Từ đây mở ra khả năng thu nhận enzyme collagenase có hoạt tính enzyme cao bằng công nghệ đơn giản, dễ kiểm soát và chi phí thấp hơn so với việc thu nhận enzyme từ nguồn khác. Thêm vào lợi thế của enzyme vi sinh vật thường có khoảng hoạt động rộng hơn và khả năng phân cắt mạnh hơn đối với nhiều enzyme khác.
Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase được phát hiện phần lớn phân lập từ môi trường đất như C. histolyticum, P. marinoglutinosa, Pseudomonas sp.. Tuy nhiên, những vi sinh vật này lại sinh ra độc tố (Kawahara, 1993). Bên cạnh đó, cũng có một số vi sinh vật như Bacillus cereus CNA1, Klebsiella pneumoniae
CNL3 được phân lập từ những thực phẩm lên men của Châu Á có hoạt tính enzyme collagenase (Warinda Suphatharaprateep et al., 2011). Việc ứng dụng enzyme collagenase trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm hay y học phải là những enzyme collagenase vi sinh vật an toàn, không sinh độc tố, điển hình là dòng vi khuẩn Bacillus subtilis FS-2 được ứng dụng khá nhiều trong lĩnh vực thực phẩm. Nagano et al. (1999) đã tiến hành nghiên cứu tách chiết enzyme collagenase từ dòng
Bacillus subtilis FS-2 và thu được nhiều kết quả khả quan.
Qua đó, đảm bảo sản phẩm tạo ra không gây nguy hiểm cho đối tượng sử dụng. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm các nguồn cho enzyme collagenase an toàn, hoạt lực cao với các đặc tính quý đến nay vẫn là mục tiêu nghiên cứu của nhiều nhà khoa học.
2.2.5.2. Nghiên cứu enzyme collagenase ở Việt Nam
Ở Việt Nam, có rất nhiều công trình nghiên cứu về enzyme protease đã được công bố và một số kết quả nghiên cứu đã có ứng dụng cụ thể như sử dụng acid protease trong y tế và chăn nuôi (Nguyễn Quỳnh Anh, 1985), trong sản xuất thử pancreatin (Phạm Quốc Thăng et al., 1983), sử dụng enzyme protease trong sản xuất bia, thử nghiệm thay thế enzyme protease - K trong kỹ thuật gen, trong sản xuất nước mắm hay tận dụng phế liệu thủy sản và một số sản phẩm khác. Tuy vậy, nghiên cứu về enzyme collagenase lại rất hạn chế và rất ít công trình công bố về vấn đề này. Đã có nhiều thử nghiệm sử dụng enzyme collagenase trong điều trị bỏng từ enzyme collagenase thương phẩm tại Viện bỏng Quốc gia, nhưng hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng thu nhận enzyme collagenase.
Năm 2004, Tô Kim Anh đã thực hiện nghiên cứu phân lập, tuyển chọn, tạo chủng giống sinh tổng hợp enzyme collagenase và ứng dụng trong thực phẩm. Nghiên cứu này là một nhánh thuộc đề tài nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chế biến một số nông sản thực phẩm của Ngô Tiến Hiển (2004). Nghiên cứu đã ghi nhận được những kết quả hữu ích cho việc ứng dụng thu nhận enzyme trong thực phẩm. Cụ thể, nghiên cứu đã tuyển chọn được dòng vi khuẩn Bacillus subtilis FS-2 từ một số thực phẩm lên men ở khu vực Châu Á và khảo sát các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase. Bước đầu xây dựng hoàn chỉnh quy trình thu nhận chế phẩm enzyme collagenase từ chủng Bacillus subtilis FS-2 tự nhiên, quy trình tinh chế và xác định đặc tính enzyme collagenase đồng thời phân lập gen mã hóa sinh tổng hợp enzyme collagenase bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). Ngoài ra, cũng thu nhận nhiều kết quả khi ứng dụng chế phẩm enzyme collagenase vào sản xuất để kiểm tra tính an toàn của chế phẩm, khả năng phân hủy collagen, khả năng làm mềm thịt, khả năng phân hủy một số protein dị ứng và sử dụng enzyme collagenase trong sản xuất nước mắm bằng cách thăm dò khả năng phân hủy da cá của enzyme collagenase thương phẩm với enzyme collagenase của Bacillus subtilis FS-2 sau 4
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Thời gian và địa điểm
Thời gian: Từ tháng 09/2013 đến tháng 04/2014.
Địa điểm: PTN Sinh học phân tử thực vật, PTN hóa sinh thực phẩm thuộc Viện NC&PT Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.2.Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu thí nghiệm
- Mẫu là ba loại mắm cá: mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc (có nguồn gốc tại huyện Châu Đốc, tỉnh An Giang).
- Gelatin dùng làm cơ chất phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase.
- Collagen dùng làm cơ chất cấy chuyển sau khi đã tách ròng các dòng vi khuẩn trên cơ chất gelatin.
3.2.2. Thiết bị và hóa chất
3.2.2.1. Thiết bị
- Bộ micropipette Nichipet Ex - Nhật Bản. - Cân điện tử Sartorius Teg 101 - Đức. - Lò vi sóng LG MS2029U - Hàn Quốc. - Máy đo OD Genesye 10UV - Đức.
- Máy lắc mẫu New Brunswich Scientific - Hoa Kỳ. - Máy ly tâm Hermle Z160m - Đức.
- Máy khuấy từ IKA C-MAG HS7 - Đức. - Nồi khử trùng nhiệt ướt Phinternational - Ý. - pH kế Eutech Instrument - Malaysia.
- Tủ cấy vi sinh vật Telstar - Tây Ban Nha. - Tủ lạnh trữ mẫu - 4oC Sanyo - Nhật Bản.
- Tủ lạnh trữ mẫu - 20oC Electrolux Comfort plus - Nhật Bản. - Tủ ủ vi sinh vật Brinder - Đức.
Một số dụng cụ khác như: đĩa petri, lame, lamen, que thủy tinh, que cấy, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, ống đong, ống nghiệm, đầu côn (vàng, xanh, trắng), cồn Ethanol (70oC và 96oC), đèn cồn, bọc nylon, dây thun, bật lửa, găng tay, khẩu trang y tế,...
3.2.2.2. Hóa chất
Thành phần môi trường phân lập vi khuẩn:
Bảng 6. Thành phần môi trƣờng Czapek cải tiến
Tên hóa chất Khối lƣợng (gram)/lít môi trƣờng
Gelatin/Collagen 10 KH2PO4 1,5 MgSO4 0,5 FeSO4 0,01 Agar 20 Nước cất 1 lít pH 7,3 0,2
(*Nguồn: Raper và Fennell, 1965)
Bảng 7. Thành phần môi trƣờng tăng sinh
Tên hóa chất Khối lƣợng (gram)/lít môi trƣờng
Gelatin/Collagen 10 KH2PO4 1,5 MgSO4 0,5 FeSO4 0,01 Nước cất 1 lít pH 7,3 0,2
(*Nguồn: Raper và Fennell, 1965)
Hóa chất đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase (phương pháp đo vòng phân giải): dung dịch TCA 35% (Trichloroacetic acid), collagen.
Hóa chất khảo sát hoạt tính enzyme collagenase: cồn ethanol 50%, dung dịch ninhydrin 2% (pha bằng cồn ethanol 50%), dung dịch Acetic acid 0,1M, dung dịch đệm Tris - HCl 50mM (pH 7,5), leucine, collagen, nước cất khử trùng.
Hóa chất nhuộm gram: Crystal violet, Iod, cồn ethanol (70o), Fuchsin và nước cất khử trùng.
Hóa chất thử nghiệm sinh hóa:
- Thử nghiệm Amylase: Tinh bột 1%, NaCl 0,1%, dung dịch Iod 0,02N. - Thử nghiệm Catalase: H2O2 3%.
- Thử nghiệm Indol:
- Thử nghiệm Methyl Red (MR):
+ Thuốc thử MR 0,02% pha trong cồn 96o với tỉ lệ cồn với nước là 3 : 2, bảo quản nhiệt độ 4oC.
+ Môi trường Glucose Phosphate (MR - VP broth): Peptone (7g), KH2PO4 (5g), glucose (5g) trong 1 lít môi trường, pH 6,9 0,2.
- Thử nghiệm Voges Proskauer (VP): + Thuốc thử KOH 40%.
+ Môi trường Glucose Phosphate (MR - VP broth): Peptone (7g), KH2PO4 (5g), glucose (5g) trong 1 lít môi trường, pH 6,9 0,2.
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase trên môi trƣờng Czapek cải tiến môi trƣờng Czapek cải tiến
Mục đích: Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase phát triển trên hai môi trường chứa gelatin và môi trường chứa collagen.
Nguyên tắc: Chọn những khuẩn lạc phát triển được trên môi trường chứa gelatin sau khi cấy trải, tiến hành cấy chuyển đến khi tách ròng từng dòng vi khuẩn. Sau đó, cấy chuyển khuẩn lạc từ môi trường chứa gelatin sang môi trường chứa collagen.
Cách tiến hành:
Quy trình phân lập vi khuẩn:
Thu mẫu
Đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu
Cấy trải trên đĩa petri môi trường bổ sung gelatin, ủ nhiệt độ 35oC trong 48 giờ ở điều kiện hiếu khí
Cấy chuyển sang đĩa môi trường bổ sung gelatin mới và kiểm tra độ ròng
Cấy chuyển trên môi trường bổ sung collagen
Quan sát hình thái khuẩn lạc
Trữ giống vi khuẩn
Lưu ý: Đĩa petri và môi trường phân lập được khử trùng nhiệt ướt ở 121oC, áp suất 1atm trong 20 phút. Khi nhiệt độ khử trùng đã hạ xuống khoảng 70oC - 80oC thì lấy ra và phân phối vào đĩa petri. Các thao tác phân phối và để nguội môi trường được tiến hành trong tủ cấy đã được khử trùng bằng tia UV.
Chuẩn bị mẫu
Thu mẫu: Mẫu là ba loại mắm cá: mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc.
Mắm cá được chế biến theo phương pháp thủ công truyền thống với nguyên liệu chính là cá và muối. Mẫu có nguồn gốc ở huyện Châu Đốc, tỉnh An Giang và được mua tại chợ Xuân Khánh, Thành phố Cần Thơ.
Đồng nhất mẫu: Cân 5gram mỗi loại mắm cá hòa với 15ml nước cất khử trùng,
lấy 10ml dịch trích mỗi mẫu cho vào bình tam giác có chứa 90ml môi trường tăng sinh chứa gelatin, tất cả đem ủ trong 48 giờ ở nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút.
Pha loãng mẫu
Sau 48 giờ lắc ủ, tiến hành pha loãng mẫu đến nồng độ 10-8.
Bảng 8. Nồng độ pha loãng mẫu
Nồng độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
Thể tích mẫu (µl) 100 100 100 100 100 100 100 100
Thể tích nƣớc cất (µl) 900 900 900 900 900 900 900 900
Tổng thể tích (µl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
Cấy trải vi khuẩn
Chọn 4 nồng độ pha loãng là 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 để tiến hành cấy trải.
Dùng micropipette hút 30µl dịch vi khuẩn ở mỗi nồng độ, nhỏ vào giữa đĩa môi trường phân lập vi khuẩn, dùng que trải đều giọt vi khuẩn khắp đĩa thạch và để khô mẫu tự nhiên. Úp ngược đĩa petri và ủ nhiệt độ 35oC trong 48 giờ, sau đó tiến hành tách ròng từng khuẩn lạc khác nhau.
Cấy chuyển
Tiến hành cấy chuyển để tách ròng từng khuẩn lạc (tất cả các thao tác đều được thực hiện trong tủ cấy vô trùng bao gồm đồng nhất mẫu, cấy trải, cấy chuyển). Các
khuẩn lạc vi khuẩn ròng được trữ trên môi trường ống thạch nghiêng (nhiệt độ 4oC) hoặc trữ trong dung dịch glycerol 50% (nhiệt độ - 20oC).
3.3.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc vi khuẩn phân lập đƣợc
Mục đích: Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase mạnh từ các dòng phân lập được.
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn phân lập được phát triển trong cơ chất collagen và khả năng phân giải collagen của TCA (Trichloroacetic acid). Đối với những dòng vi khuẩn không có khả năng phân giải collagen sẽ có màu trắng đục trên môi trường, vì TCA có khả năng phản ứng với thành phần collagen trong môi trường. Đối với những dòng vi khuẩn có nhóm enzyme collagenase thì nó sẽ phân giải được collagen tạo vòng trong xung quanh giếng thạch (lỗ đục agar chứa dịch enzyme thô) khi có mặt dung dịch TCA.
Quy trình gồm các bước:
- Dùng kim cấy lấy khuẩn lạc ròng cho vào môi trường tăng sinh chứa collagen đã chuẩn bị từ trước.
- Nuôi vi khuẩn trong môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút, thời gian 48 giờ.
- Đồng nhất mật số vi khuẩn. Vi khuẩn sau khi đồng nhất mật số được nuôi trong môi trường tăng sinh chứa collagen ở nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút, thời gian 48 giờ.
- Sau 48 giờ, rút 1ml dịch vi khuẩn ly tâm 13.000 vòng/10 phút, loại bỏ phần sinh khối, lấy phần dịch trong sử dụng như enzyme ngoại bào (dịch enzyme thô).
- Nhỏ 25µl dịch enzyme thô trên giếng thạch của môi trường chứa collagen đã chuẩn bị trước (giếng thạch có đường kính 7mm), để dịch khếch tán đều xung quanh giếng thạch, để khô, úp ngược đĩa petri và ủ 48 giờ ở nhiệt độ 35oC trong điều kiện hiếu khí (lặp lại 3 lần/mẫu). Vi khuẩn phát triển trên đĩa được kiểm tra bằng dung dịch TCA 35% (Medina et al., 2007) trong 1 giờ và quan sát kết quả.
- Đo vòng tròn thủy phân (vòng halo) xung quanh giếng thạch. - Chỉ tiêu quan sát: Hoạt tính phân giải được tính dựa vào công thức:
ĐK vòng phân giải = [ĐK vòng thủy phân - ĐK giếng thạch] (mm)
(*Ghi chú: ĐK: Đường kính) (*Nguồn: Võ Chí Bắc et al., 2010)
Phương pháp đếm mật số vi khuẩn:
- Nuôi vi khuẩn trong môi trường tăng sinh chứa collagen 48 giờ, nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút.
- Tiến hành pha loãng mẫu cần đếm ở các nồng độ 10-7, 10-8, 10-9, 10-10.
- Dùng micropipette hút 5µl mỗi nồng độ cho vào các đĩa môi trường thạch chứa collagen (lặp lại 3 lần/mẫu). Ủ ở nhiệt độ 35oC trong 48 giờ.
- Đếm mật số vi khuẩn thông qua số khuẩn lạc bằng phương pháp đếm trực tiếp trên đĩa petri.
- Công thức tính số lượng tế bào vi khuẩn bằng trong một đơn vị thể tích:
Số tế bào/ml = A x B x 200 (CFU/ml)
Trong đó:
A: Số khuẩn lạc đếm được trung bình của 3 giọt (số khuẩn lạc/5µl). B: Mức độ pha loãng.
200: Hệ số chuyển từ 5µl đến 1ml.
Lưu ý: Thực hiện tương tự với cơ chất là gelatin để tìm ra những dòng vi khuẩn
có khả năng sinh tổng hợp enzyme gelatinase, qua đó đánh giá chính xác hơn về khả năng sinh tổng hợp enzyme của các dòng vi khuẩn phân lập.
3.3.3. Xác định hoạt tính enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn từ các dòng phân lập đƣợc đƣợc tuyển chọn từ các dòng phân lập đƣợc
Mục đích: Chọn được những dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme collagenase mạnh nhất từ các dòng tuyển chọn.
Nguyên tắc: Hoạt tính enzyme collagenase được xác định dựa vào hàm lượng nhóm - NH2 giải phóng ra khi cho dịch thô enzyme collagenase tương tác với cơ chất collagen thông qua phương pháp Ninhydrin, hàm lượng - NH2 được tính toán dựa theo đường chuẩn leucine.
Các tiến hành:
Dựng đường chuẩn leucine
- Chuẩn bị 6 ống nghiệm, cho vào mỗi ống nghiệm thành phần các chất theo bảng 9 và 10.
Bảng 9. Nồng độ pha dung dịch leucine
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Nồng độ dung dịch leucine chuẩn µg/ml 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Dung dịch leucine 10 µg/ml (ml) 0 1 2 3 4 5
Nước chất (ml) 10 9 8 7 6 5
Tổng thể tích (ml) 10 10 10 10 10 10
Bảng 10. Thành phần hoá chất dựng đƣờng chuẩn leucine
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Nồng độ dung dịch leucine chuẩn µg/ml 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Thể tích dung dịch leucine mỗi nồng độ (ml) 2 2 2 2 2 2
Dung dịch Ninhydrin 2% (ml) 2 2 2 2 2 2
Ethanol 50% (ml) 6 6 6 6 6 6
Tổng thể tích (ml) 10 10 10 10 10 10
(*Ghi chú: Lặp lại 3 lần/nồng độ)
(*Nguồn: Hoàng Tấn Quảng, 2010)
- Đo giá trị OD ở bước sóng 570nm. - Vẽ biểu đồ đường chuẩn.
Tách chiết enzyme:
Chọn các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase mạnh nuôi trong môi trường tăng sinh chứa collagen 48 giờ. Sau đó hút 1ml dịch vi khuẩn, ly tâm 13.000 vòng/10 phút, loại bỏ phần sinh khối, lấy phần dịch trong sử dụng như enzyme ngoại bào.
Xác định hoạt tính enzyme collagenase:
Tiến hành xác định ở các thời điểm 1, 2, 3, 4 ngày sau khi chủng vi khuẩn vào môi trường tăng sinh chứa collagen.
Ủ 10mg collagen trong 10 phút ở nhiệt độ 37o
C trong 0,8ml dung dịch đệm Tris - HCl 50mM (pH 7,5). Phản ứng enzyme được thực hiện trên máy lắc ổn ở nhiệt độ 35oC khi cho 0,2ml dịch enzyme thô vào hỗn hợp ở trên. Tiến hành phản ứng trong 30 phút và dừng phản ứng bằng 1ml dung dịch acid acetic 0,1M. Hàm lượng nhóm - NH2 giải phóng được xác định bằng phương pháp Ninhydrin (Tô Kim Anh, 2004).
Phương pháp Ninhydrin: Hỗn hợp trên phản ứng với 2ml dung dịch ninhydrin
2% (pha trong ethanol 50%) được ủ lắc ở nhiệt độ 100oC, trong 30 phút, sau đó hỗn hợp được làm nguội trong nước đá 5 phút. Định mức hỗn hợp đến 10ml bằng ethanol 50%. Hỗn hợp phản ứng màu được đo độ hấp thụ quang trên máy đo quang phổ ở
bước sóng 570nm. Hàm lượng nhóm - NH2 được tính toán theo đường chuẩn