Sau khi xác định một số đặc tính hình thái các dòng vi khuẩn CV32, CV37, CV41 được chọn, tiến hành kiểm tra một số thử nghiệm sinh hóa amylase, catalase, Indol, MR và VP. Kết quả được thể hiện trong bảng 15 và hình 15.
Bảng 15. Kết quả thử nghiệm một số đặc tính sinh hóa của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn
STT Dòng VK Amylase Catalase Indol Methyl Red Voges
proskauer
1 CV32 + + - - -
2 CV37 + (-) + + - -
3 CV41 + + - - -
(*Ghi chú: +: Phản ứng dương tính, -: Phản ứng âm tính, +(-): Phần lớn là phản ứng dương tính)
Thông tin từ bảng 14 và hình 14cho thấy, ba dòng vi khuẩn đều cho phản ứng âm tính với thử nghiệm MR và VP. Phản ứng dương tính với thử nghiệm catalase và amylase, mặc dù có sự khác biệt nhỏ ở dòng CV37 khi hỗn hợp cho phản ứng mất màu xanh tím đặc trưng (so với ống đối chứng) nhưng vẫn còn có màu hơi đậm so với hai dòng CV32, CV41 đã mất màu xanh tím hoàn toàn và chuyển sang màu trắng, chứng tỏ dòng CV37 tác dụng chưa đủ mạnh để làm mất màu xanh tím hoàn toàn nên ghi nhận phần lớn là phản ứng dương tính. Tiếp tục thử nghiệm indol, dòng CV32 và CV41 cho kết quả âm tính, còn dòng CV37 cho kết quả dương tính.
Hình 15. Kết quả một số thử nghiệm sinh hóa của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn
(*Ghi chú: amylase (A), MR (B), indol (C), VP (D) vc (E))
Kết quả kiểm tra một số đặc tính hình thái và một số thử nghiệm sinh hóa của ba dòng vi khuẩn được chọn ở trên xem như tiền đề cho việc định danh xác định tên vi khuẩn, qua đó thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về khả năng ứng dụng của các dòng vi khuẩn phân lập được.
CV32 2 CV37 2 CV41 ĐC CV32 2 CV37 2 CV41 ĐC CV32 2 CV37 2 CV41 ĐC CV32 2 CV37 2 CV41 ĐC B A D C CV32 CV37 CV41 ĐC E
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Với ba mẫu mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc đã phân lập được 41 dòng vi khuẩn hiếu khí có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase.
Các dòng vi khuẩn phân lập được khá đa dạng về đặc điểm khuẩn lạc, phần lớn khuẩn lạc có dạng không đều (chiếm 73,2%), độ nổi mô (chiếm 65,9%), dạng bìa nguyên (chiếm 63,4%), màu trắng đục (31,7%), tốc độ phát triển trung bình (chiếm 48,8%), vi khuẩn dạng hình cầu (chiếm 82,9%) và tất cả các dòng đều di dộng.
19 trong số 41 dòng vi khuẩn phân lập được thể hiện khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase dựa vào kích thước vòng thủy phân trên cơ chất.
Sáu dòng vi khuẩn có kích thước vòng halo lớn nhất được chọn để xác định hoạt tính enzyme collagenase, dòng vi khuẩn CV41 cho hoạt tính enzyme cao nhất 2,850 U/ml vào ngày thứ hai, tiếp đến là dòng vi khuẩn CV37 cho hoạt tính 2,033 U/ml vào ngày thứ hai và dòng vi khuẩn CV32 cho hoạt tính 2 U/ml vào ngày thứ ba.
Đặc tính hình thái của ba dòng vi khuẩn được chọn cho thấy cả ba dòng đều thuộc nhóm Gram âm, dòng CV32 và CV37 có dạng hình cầu, dòng CV41 có dạng hình que ngắn.
Đặc tính sinh hóa, dòng CV32 cho kết quả dương tính với thử nghiệm Amylase, Catalase và Indol; âm tính với thử nghiệm MR và VP. Dòng CV37 cho kết quả dương tính với thử nghiệm Catalase và Indol, phần lớn là dương tính với thử nghiệm Amylase; âm tính với thử nghiệm MR và VP. Dòng CV 41 cho kết quả dương tính với thử nghiệm amylase và catalase; âm tính với thử nghiệm Indol, MR và VP.
Từ các kết quả quan sát và ghi nhận được, dòng vi khuẩn CV41 có thể được tuyển chọn như dòng vi khuẩn có khả năng để sản xuất enzyme collagenase tốt nhất trong 41 dòng vi khuẩn phân lập được.
5.2. Đề nghị
Định danh dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagen được tuyển chọn từ trong 41 dòng vi khuẩn phân lập được.
Khảo sát yếu tố pH ảnh hưởng đến sự phát triển và hoạt động của dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagen được tuyển chọn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2009. Giáo trình Vi sinh vật đại cương. Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Cần Thơ, trang 76.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền. 2005. Xây dựng quy trình phát hiện Escherichia Coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và thử nghiệm ứng dụng. Luận văn thạc sĩ. Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Thành phố Hồ
Chí Minh.
Hoàng Tấn Quảng, et al. 2010. Đa dạng của quần thể bưởi Thanh trà (Citrus grandis
(L.) Osbeck) ở Hương Trà , Thừ a Thiên Hu ế. Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(2):
213-220.
Lâm Thiên Nga. 2011. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose từ cá ăn
cỏ. Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Cần
Thơ.
Lê Ngọc Tú, et al. 1994. Hóa học thực phẩm. Nxb. Khoa học và kỹ thuật Hà Nội,
trang 292.
Nguyễn Quỳnh Anh. 1985. Thu nhận, ứng dụng pepsin và acid protease của Aspergillus niger trong y tế và chăn nuôi. Luận án tiến sĩ khoa học. Trường Đại
học Bách khoa Hà Nội.
Nguyễn Thị Huyền, et al. 2012. Tách chiết collagen từ da cá Tra bằng phương pháp hóa học. Tạp chí nghiên cứu khoa học. Trường Đại học Nha Trang, 2:31-36. Nguyễn Văn Hạnh. 2009. Kiểm nghiệm vi sinh vật. Trường Đại học Bách khoa Hà
Nội.
Nguyễn Văn Hiếu. 2012. Nghiên cứu thu nhận protease kiềm tái tổ hợp có hoạt tính
enzyme keratinase từ vi khuẩn và ứng dụng trong công nghiệp thuộc da. Luận án
tiến sĩ. Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
Phạm Quốc Thắng, Đồng Thanh Thu và Vũ Kim Thành. 1983. Nghiên cứu sản xuất pancreatin. Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
Tô Kim Anh. 2004. Nghiên cứu công nghệ thu nhận enzyme collagenase từ vi khuẩn
Tiếng Anh
Bailey, A.J., et al. 1984. The chemistry of intramuscular collagen. In “Recent advances in the chemistry of meat”. Royal Society of Chemistry, 3:22-27.
Bond, M.D. and H.E. Van Wart. 1984. Purification and separation on individual collagenase of Clostriddium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemisty, 23:3077-3079.
Brocklehurt, K., B.S. Baines and M.P.J. Kierstan. 1981. Papain and other constituents of Cariva papaya L. In “Topic in enzyme fermentation Biotechnology”. Ellis
Horwood Ltd. Chicago.
Endo, A., et al. 1987. Purification and properties of collagenase from a streptomyces species. J. Biochem, 102:163-170.
Fukushima, J., et al. 1990. Molecular cloning and partial DNA sequencing of the collagenase gene of Vibrio alginolyticus. Microbiol. Immunol. 34: 977-984. Furcolo, G., M. Marziali and L. Businco. 1996. Food allergy: recent findings. Pediatr.
Med. Chir, 18:551-557.
Gallop, M.P., S. Seifter and E. Meilman. 1957. Studies on collagen I. The partial purification, assay and mode of activation of bacterial collagenase. J. Biol. Chem, 227:891-906.
Gilles, A.M. and B. Keil. 1976. Cleavage of β - casein by collagenases from
Achromobacter iophagus and Clostridium histolyticum. FEBS letters, 6:369-372.
Goldbreg, G.I., et al. 1986. Human fibroblast collagenase: Complete primary structure and homology to oncogene transformation induced rat protein. J. Biol. Chem,
261:6600-6605.
Gupta, A., et al. 2005. One - step purification and characterization of an alkaline protease from haloalkaliphilic Bacillus sp. J. Chromatogr. A, 1075:103-108. Hanada, K., et al. 1973. The isolation of collagenase and its enzymological and
physico - chemical properties. Agric. Biol. Chem, 37:1771-1781. Harper, E.. 1980. Collagenase. A. Rev. Biochem, 49:1063-1078.
Hisano, T., et al. 1989. Isolation and properties of a collagenase with caseinolytic activity from a Pseudomonas sp. J. Fremen. Bioeng, 68:399-403.
Jongjareonrak, A., et al. 2005. Isolation and characterisation of acid and pepsin solubilised collagens from skin of Brownstripe red snapper (Lutjanus vitta). Food
Chem, 93:475-484.
Joseph, R., et al. 1978. Purification and characterisation of a marine bacterial collagenase. Biochemistry, 14:2857-2863.
Kanayama, Y. and Y. Saika. 2005. Purification and properties of a new type of protease produced by Microbacterium liquefaciens. Biosci. Biotechnol. Biochem, 69:916-921.
Kawahara, H., et al. 1993. Isolation and characterization of a new type of collagenase producing bacterium, Bacillus alvei DC-1. Biosci. Biotech. Biochem, 57:1372-
1373.
Medina, P. and L. Baresi. 2007. Rapid identification of gelatin and casein hydrolysic using TCA. J. Microb. Methods, 69:391-393.
Merkel, J.R., J.H. Dreisbach and H.B. Ziegler. 1975. Collagenolytic activity of some marine bacteria. Appl Microbiol, 2:145–151.
Muyonga, J.H., et al. 2004. Characterization of acid soluble collagen from skins of young and adult Nile perch (Lates nilotics). Food Chem, 85:81-89.
Nagano, H. and K.A. To. 1999. Purification of collagenase and specificity of its related enzyme from Bacillus subtilis FS-2. Biosci. Biotechnol. Biochem, 63:181- 183.
Peterkofsky, B., et al. 1982. Bacterial collagenase. Methods enzymol, 82:453-471. Raper, K.B., D.I. Fennell. 1965. The genus Aspergillus. Baltimore: Williams and
Wilkins.
Sasagawa, Y., et al. 1993. Purification and properties of collagenase from Cytophaga sp. L43-1 strain. Biosci, Biotechnol, Biochem, 57:1894-1898.
Seifter, S. and E. Harper. 1971. The enzyme collagenase. Chap 18. In The Enzymes, Vol.3, ed by Boyer P.D., Academic Press, New York, pp.649-697.
Singh, A., et al. 1994. Production of thermostable acic protease by Aspergillus niger. Lett. Appl. Microbiol, 18:177-180.
Takeuchi, H., et al. 1992. Structural gene and complete amino acid sequence of Vibrio
alginolyticus collagenase. Biochem. J, 281:703-708.
bone, and fins. Food chemistry, 15:277-281.
Timar, J., H. Botyanszki and J. Babo. 1998. The antiproliferative action of a melphalan hexapeptide with collagenase - cleavable site. Cancer chemotherapy and pharmacology, 41:292-298.
Tran, L.H. and H. Nagano. 2002. Isolation and characteristics of Bacillus subtilis CN2 and its collagenase production. J. Food Sci, 67:1184-1187.
Watanabe, K., et al. 2004. Collagenolytic proteases from bacteria. Appl. Microb. Biotechnol, 63:520-526.
Watanable, H., et al. 1994. Mouse cartilage matrix decifiency (cmd) cause by a 7 bp deletion in the aggrecan gene. Nat genet, 7:154-157.
Whitham, S.E., et al. 1986. Comparison of human stromelysin and collagenase by cloning and sequence analysis. J. Biochem, 240: 913-916.
Trang website http://luanvan.co/luan-van/trich-ly-collagen-va-ung-dung-354/ (ngày 02/07/2013). http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1111/(ISSN)1747-0285 (ngày 02/07/2013). http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-trich-ly-collagen-tu-da-ca-basa-8580/ (ngày 21/07/2013). http://luanvan.net.vn/luan-van/de-tai-trich-ly-collagen-tu-da-ca-basa-35688/ (ngày 21/07/2013). http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=3380 (ngày 22/07/2013). http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-trich-ly-collagen-tu-da-ca-Tra-8580/ (ngày 22/07/2013). http://chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/noidungtinhhinhthuchien?categoryId=1 00002927&articleId=10052123 (ngày 22/07/2013). http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-cong-nghe-trich-ly-collagen-va-ung-dung-collagen- trong-linh-vuc-y-khoa-8830/ (ngày 23/07/2013). http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%A1_tra (ngày 25/07/2013). http://en.wikipedia.org/wiki/Collagenase (ngày 02/09/2013) www.hangngoainhap.com.vn/33-hanamai-collagen-cua-nhat-collagen-dang-bot-chiet- xuat-tu-ca.html (ngày 09/9/2013) http://www.kilobooks.com/archive/index.php/t-64525.html (ngày 08/10/2013)
http://suckhoedoisong.vn/bac-si-gia-dinh/cac-loai-thuc-pham-de-gay-di-ung-va-cach- de-phong-20140207221507562.htm (ngày 10/10/2013) http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-san-xuat-gelatine-va-ung-dung-49662/ (ngày 11/10/2013) http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-tong-quan-tai-lieu-ve-ung-dung-gelatin-trong- cong-nghe-thuc-pham-10202/ (ngày 11/10/2013) http://baigiang.violet.vn/present/show?entry_id=7256338 (ngày 09/11/2013) http://www.slideshare.net/haholuki/kiem-nghiem-vi-sinh-vat-part1 (ngày 09/11/2013) http://tulieu.violet.vn/document/show/entry_id/139015 ngày 03/08/2013 (ngày 21/12/2013) http://luanan.nlv.gov.vn/luanan?a=d&d=TTkGWOSupvzG1999.1.51&e=---vi-20-- 1--img-txIN---# (ngày 02/01/2014). http://luanvan.co/luan-van/nghien-cuu-phan-lap-tuyen-chon-sinh-tong-hop-enzym- colagenaza-va-ung-dung-trong-thuc-pham-2568/ (ngày 02/01/2014). http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=3.4.24.3 (ngày02/01/2014). http://s4.zetaboards.com/BioFood_Tech/topic/9128063/1/ (ngày 07/01/2014) http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-nghien-cuu-phan-lap-tuyen-chon-va-tao-chung-giong- bang-ky-thuat-di-truyen-de-sinh-tong-hop-enzyme-galactosidase-10516/ (ngày 13/01/2014). http://www.wattpad.com/747994-phan-tich-vi-sinh-thuc-pham?p=6 (ngày 20/01/2014). http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-xay-dung-qui-trinh-phat-hien-escherichia-coli- trong-thuc-pham-bang-phuong-phap-pcr-polymerase-chain-reaction-va-42873/ (ngày 20/01/2014). http://skhcn.hue.gov.vn/Portal/?GiaoDien=11&ChucNang=341&NewsID=201203261 51527 (ngày 04/04/2014) http://www.worthington-biochem.com/cls/default.html (ngày 26/04/2014) http://123doc.vn/document/321128-nghien-cuu-ung-dung-cong-nghe-enzyme-trong- che-bien-mot-so-nong-san-thuc-pham.htm (ngày 05/05/2014)
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1. HÌNH ẢNH
1. Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm
Hình 16. Cân điện tử
Hình 17. Máy lắc (A) và Tủ ủ vi khuẩn (B)
Hình 18. Tủ cấy vi khuẩn (A) và kính hiển vi quang học (B)
B A
2. Một số hình ảnh trong quá trình thực hiện thí nghiệm
Hình 19. Gelatin dạng tinh thể (A) và bột collagen (B)
Hình 20. Dịch vi khuẩn dòng CV41 trƣớc và sau khi tăng sinh ở nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút
Hình 21. Vòng phân giải của một số dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme gelatinase
A B
CV41 CV37
Hình 22. Phản ứng màu Ninhydrin
(1). Cho dung dịch Ninhydrin vào.
(2). Dung dịch bắt đầu chuyển sang màu tím. (3). Màu đậm hơn sau khi ủ lắc.
(4). Định mức đến 10ml để đo OD.
Hình 23. Dãy ống nghiệm dựng đƣờng chuẩn (0,1-0,5µg/ml) PHỤ LỤC 2: PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH VI KHUẨN 1. Xác định một số đặc tính hình thái vi khuẩn
Quan sát hình thái vi khuẩn
Tiến hành quan sát hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép và xác định dưới kính hiển vi quang học.
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:
- Nhỏ 20µl nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
1 2 3 4
- Dùng kính đậy vật, đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45º, rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí. Quan sát dưới vật kính x100.
Nhuộm Gram vi khuẩn
Các bước nhuộm Gram: Làm tiêu bản
- Nhỏ 1 giọt nước đã khử trùng lên giữa lame.
- Dùng que cấy lấy 1 ít sinh khối vi khuẩn từ khuẩn lạc rời rồi cho vào giọt nước, trải đều thật mỏng theo hình xoắn ốc.
- Hơ nóng mặt dưới của lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn. Nhuộm tiêu bản
- Nhỏ 1 - 2 giọt Crystal violet từ mẫu đã cố định, để 60 giây. Rửa nước vài giây.
- Nhỏ dung dịch Iod, để 60 giây. Rửa nước, sau đó rửa cồn và rửa lại bằng nước.
- Nhỏ 1 - 2 giọt Fushin hay Safranin, để 60 giây. Rửa nước vài giây. - Làm khô nước bằng giấy thấm và hơ trên ngọn lửa đèn cồn.
- Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x100.
(*Nguồn: Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2009)
2. Xác định một số đặc tính sinh hóa
Thử nghiệm Amylase
Mục đích: Phát hiện các dòng vi khuẩn có hệ enzym amylase từ các dòng mạnh được tuyển chọn.
Nguyên tắc: Vi khuẩn có hoạt tính amylase sẽ phân cắt tinh bột tạo thành những phân tử glucose, nên khi nhỏ dung dịch Iod sẽ không tạo thành màu xanh tím đặc trưng. Với vi khuẩn không có hoạt tính amylase thì xảy ra phản ứng giữa tinh bột và Iod cho màu xanh tím.
Cách tiến hành: Chủng 1ml vi khuẩn vào mỗi ống nghiệm chứa 1ml nước muối 0,1%. Cho 1ml tinh bột 0,1% vào, lắc đều, ủ ở nhiệt độ 30°C trong 30 phút, lấy ra nhỏ 2 - 3 giọt dung dịch Iod. Và đọc kết quả:
- Dương tính (+): Mất màu hỗn hợp tinh bột và Iod. - Âm tính (-): Hỗn hợp có màu xanh tím đặc trưng.
Thử nghiệm Catalase
Mục đích: Phát hiện các các dòng vi khuẩn có hệ enzym catalase từ các dòng mạnh được tuyển chọn.
Nguyên tắc: Enzyme catalase hiện diện ở các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Với vi khuẩn có hoạt tính enzyme catalase sẽ xuất hiện bọt khí khi có sự hiện diện của hydrogen peroxide (H2O2).
H2O2 H2O + O2 (bọt khí)
Cách tiến hành: Nhỏ 2 - 3 giọt H2O2 3% lên lame sạch chứa dịch vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy lỏng và quan sát kết quả:
- Dương tính (+): Có hiện tượng sủi bọt khí.
- Âm tính (-): Không xảy ra hiện tượng sủi bọt khí.
Thử nghiệm Indol
Mục đích: Phát hiện các dòng vi khuẩn có khả năng sinh Indol (có hệ enzyme tryptophanase) từ các dòng mạnh được tuyển chọn.
Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxy hóa bởi một số vi khuẩn có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc Indol. Việc phát hiện Indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với thuốc thử Kovac’s chứa gốc p - Dimethylaminbenzaldehyde (p - DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone