Nghiên cứu ứng dụng enzyme collagenase để tách chiết collagen từ nhiều nguyên vật liệu như gia súc, gia cầm, nhất là từ các phụ phẩm phế thải trong ngành chế biến thủy sản (cá da trơn, tôm) đang được nhiều nhà khoa học quan tâm, vì thành phần chính trong những phụ - phế phẩm này (nhiều nhất là da và xương) là collagen. Đặc biệt, collagen từ thủy sản được đánh giá có khả năng ứng dụng cao không những trong ngành thực phẩm mà còn trong ngành mỹ phẩm và dược phẩm (Meena et al., 1999 và Bryan Jeunet al., 2002). Để cuối cùng tạo ra sản phẩm an toàn, giá thành hợp lý với người sử dụng, đồng thời góp phần làm giảm lượng lớn chất phế thải tránh ô nhiễm môi trường và mang lại nguồn lợi kinh tế lớn.
2.2.4.2. Trong công nghiệp thực phẩm
a. Làm mềm và cải thiện chất lượng thịt
Cấu trúc phân tử của collagen và tương tác của nó với các cấu tử khác trong mô liên kết là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới đặc tính cấu trúc của thịt và sản phẩm thịt (Bailey, 1984). Các liên kết chéo trong phân tử collagen tăng theo tỉ lệ thuận so với độ tuổi động vật và vì thế làm tăng độ rắn chắc của thịt (Lê Ngọc Tú et al., 1994). Một trong những giải pháp làm tăng độ mềm của thịt là phân cắt cấu trúc xoắn của phân tử collagen, làm duỗi mạch protein để đạt được cấu trúc và độ mềm mong muốn, không kèm theo sự phân cắt các sợi myosin.
Các enzyme được dùng làm mềm thịt từ trước tới nay thường là papain, bromelain, ficin, trong đó papain được xem là enzyme hiệu quả nhất do có khả năng tác động lên các vùng xoắn đầu mạch trong phân tử collagen (Brocklehurt et al., 1981). Tác dụng cơ bản của những enzyme này là hoạt động thuỷ phân protein không đặc hiệu và phân cắt toàn bộ phân tử protein. Vì thế, việc sử dụng các loại enzyme này hoặc không có mấy tác dụng trong cải thiện thịt chứa nhiều collagen, hoặc ngược lại, có thể gây ra hiện tượng phân cắt quá mức cấu trúc của thịt và tạo ra thịt chất lượng không tốt. Rất nhiều công nghệ tiến bộ được áp dụng để cải thiện thịt sau khi làm mềm bằng các loại enzyme này. Mặc dù vậy, cấu trúc thịt nhận được sau quá trình làm mềm vẫn không đạt được yêu cầu về cấu trúc, hoặc quá cứng, hoặc quá mềm làm giảm chất lượng cảm quan thịt. Hương vị thịt bị biến đổi, đôi khi bị biến đổi đến mức không thể chấp nhận được. Với việc không có khả năng tác động lên collagen khi sử dụng các chế phẩm enzyme này nên khả năng cải thiện chất lượng thịt cho hiệu quả thấp (đối với thịt chứa nhiều collagen).
Khả năng sử dụng enzyme collagenase làm mềm, nâng cao chất lượng thịt đã được thử nghiệm và công bố trong một số nghiên cứu gần đây. Enzyme collagenase đặc biệt hiệu quả trong trường hợp nâng cao khả năng khai thác và tận dụng thịt chứa nhiều collagen như thịt bò, cá hồi. Khai thác ưu thế này có sử dụng enzyme collagenase cho phép để sản xuất ngay cả các sản phẩm cao cấp như xúc xích hoặc bít- tết, nâng cao giá trị của sản phẩm tạo ra.
Ngày nay, cùng với sự gia tăng dân số, nhu cầu về số lượng và chất lượng thực phẩm ngày càng lớn (trong đó có các loại thịt). Thịt bò là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và được tiêu thụ mạnh ở nhiều nước, nhất là ở các nước phương Tây.
Để nâng cao hơn nữa mức tiêu thụ loại thịt này cần có công nghệ làm mềm thịt tạo ra các sản phẩm thịt cấu trúc được nâng cao chất lượng từ thịt bò.
b. Biến đổi cấu trúc protein
Trong công nghiệp thực phẩm, các enzyme protease được dùng để thay đổi cấu trúc protein nhằm cải biến một số tính chất dinh dưỡng hoặc chức năng của chúng. Vai trò của enzyme ở đây là thực hiện phản ứng thủy phân từng phần, làm biến đổi cấu trúc protein. Enzyme collagenase là một trong số những enzyme protease được dùng với mục đích biến đổi cấu trúc protein để đạt được hiệu quả mong muốn. Khi bị biến đổi một phần, các tính chất chức năng và cảm quan của protein được cải thiện như khả năng giữ nước, khả năng nhũ tương hóa, tạo bọt, độ dai,…
c. Hiện tượng dị ứng thực phẩm và khả năng sử dụng enzyme collagenase làm giảm tính dị ứng
Sử dụng enzyme collagenase làm giảm tính gây dị ứng của một số protein thực phẩm. Các trường hợp dị ứng thực phẩm thực sự phổ biến trong vòng 15 năm trở lại đây. Nhiều báo cáo về hiện tượng này cho thấy số lượng người bị dị ứng do thực phẩm gây nên tăng dần trên quy mô toàn cầu (Furcolo et al., 1996).
Mặc dù tính chất của các protein gây dị ứng còn chưa được xác định đầy đủ, nhưng nói chung các protein gây dị ứng có kích thước phân tử khoảng 10 - 70kDa, có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch (cảm ứng sự sản sinh kháng thể IgE đặc hiệu chất dị ứng). Các protein này khá bền với nhiệt trong quá trình chế biến và ít bị phân cắt bởi các enzyme protease. Trong nhiều trường hợp, các chất gây dị ứng được xác định là các protein cụ thể. Theo khảo sát, sữa bò, trứng, bột mì, bột gạo và cá là các thực phẩm gây dị ứng thường gặp nhất (Furcolo et al., 1996). Nhóm tác giả Watanabe et al. (1994) đã đề cập đến khả năng tạo ra các sản phẩm không gây dị ứng khi xử lý protein gây dị ứng với enzyme collagenase, cho thấy chúng có tính chất công nghệ thích hợp hơn là khi xử lý với các enzyme protease thông thường khác do các enzyme này phân giải quá mức protein. Nghiên cứu này đã mở đường cho ý tưởng sử dụng enzyme collagenase như một công cụ có khả năng trong việc tác động lên cấu trúc protein và làm giảm khả năng gây dị ứng các protein dạng này mà vẫn giữ được các tính chất công nghệ cần thiết của chúng.
2.2.4.3. Trong y tế, dƣợc phẩm và mỹ phẩm
Năm 1998, vai trò xúc tác và mục đích của enzyme collagenase trong việc ngăn chặn sự phát triển các khối u do khả năng phân cắt trình tự hexapeptide melphalan Pro - Gln - Gly - Ile - Mel - Gly tạo thành tripeptide melaphan Ile - Mel - Gly có độc tính tế bào cao đã được phát hiện (Timar, 1998). Đây được xem như một khả năng hứa hẹn cho sản xuất các chế phẩm thuốc có hoạt tính enzyme collagenase cao để ngăn ngừa khối u.
Nhờ khả năng phân cắt đặc hiệu collagen, enzyme collagenase được sử dụng như công cụ hữu ích để phân tách các thành phần cấu trúc trong mô liên kết, phân tách tế bào trong mạng lưới mô liên kết. Ngoài ra, enzyme collagenase có thể được sử dụng trong nghiên cứu các tiến trình của một số loại bệnh và cơ chế làm lành vết thương (Seifter và Harper, 1971). Hiện nay, enzyme collagenase đã được công nhận để điều trị bệnh co cứng Dupuytren, sử dụng enzyme collagenase dưới dạng thuốc bôi hoặc các băng viết thương trong điều trị bỏng. Enzyme collagenase còn là một loại thuốc để điều trị cho những bệnh nhân nam bị cong dương vật (còn gọi là bệnh Peyronie), được Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) thông qua với công dụng mới của thuốc xiaflex (enzyme collagenase clostridium histolyticum).
Hình 9. Bệnh co cứng Dupuytren
(*Nguồn: http://pozemedicale.org/Poze_Boli_Piele/Contractura_Dupuytren_1.png ngày 03/01/2014)
Enzyme collagenase và các sản phẩn polymer thủy phân của chúng cũng được sử dụng trong y tế như chỉ phẫu thuật, các vỏ viên thuốc hay sử dụng trong công nghiệp hóa chất, sản xuất vật liệu tráng ảnh,…
Bên cạnh sử dụng enzyme collagenase cho những ứng dụng trên, enzyme collagenase còn là enzyme có khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như công nghiệp da, công nghiệp mỹ phẩm trong sản xuất các loại kem tảy da chết,…
Một số ứng dụng của enzyme collagenase trong y học:
Phân tách mô tế bào: Enzyme collagenase có tầm quan trọng đặc biệt khi phân tách các mô quá nhiều sợi (thớ), hoặc quá nhạy cảm cho phép sử dụng trypsin, chất mà không ảnh hưởng lên các vật liệu sợi và phá hủy các vật liệu không bền. Sự phân tách thường được thực hiện hoặc bằng cách ngâm toàn bộ cơ quan hoặc bằng cách ủ một mẫu nhỏ của mô cùng với enzyme hòa tan. Enzyme collagenase đã được ứng dụng thành công cho việc phân lập rộng rãi và đa dạng các loại tế bào.
Phân tách các tế bào tiểu đảo Langerhan của tuyến tụy: Enzyme collagenase ứng
dụng quan trọng trong sự phân lập các tế bào tiểu đảo Langerhan của tuyến tụy khi trong tiểu đảo này có nhiều tế bào khác nhau. Trong quá trình này có một số nhân tố giới hạn sự thành công của phương pháp bao gồm những sự khác nhau đáng kể trong việc chuẩn bị cho enzyme collagenase hoạt động, các nhân tố gây độc cho tế bào β - cell và tác dụng của enzyme collagenase lên tính di truyền miễn dịch và tính động học của tế bào tiểu đảo.
Phân lập các tế bào cơ tim: Enzyme collagenase cũng được sử dụng trong việc
phân lập các tế bào cơ tim. Sự phân tách các mô được tiến hành bằng cách ngâm nguyên vẹn cơ quan trong dung dịch enzyme, trong đó enzyme collagenase được chọn lựa hoặc một mình hoặc kết hợp với một enzyme khác chẳng hạn enzyme hyaluronidase hoặc trypsin. Enzyme collagenase có thể được sử dụng khi phân tách một cách hoàn toàn bằng cách ngâm mô nhỏ vào dịch enzyme.
Phân lập các tế bào gan: Các tế bào gan được phân lập sử dụng trong nghiên cứu
các tế bào thúc đẩy sự phát triển của khối u, trong nghiên cứu các cơ chế điều khiển tế bào, trong dược phẩm và các hệ thống phân tích chất gây ung thư. Thêm vào đó, phân lập các tế bào gan cho cấy ghép đang được sử dụng như là một mô hình điều trị cho các bệnh nhân bị hỏng chức năng gan hoặc bị sai lệch cơ chế trao đổi chất phụ thuộc vào gan.
Phân lập các tế bào khối u: Toàn bộ các tế bào khối u cần phải được phân lập để
nghiên cứu từ các mô ung thư nhằm mục đích điều chế vaccine để phòng chống ung thư.
Chẩn đoán các tế bào ung thư phổi: Sự tăng enzyme collagenase hoạt động trong
đại thực bào phân lập từ cuống phổi là dấu hiệu chuẩn để chẩn đoán các tế bào ung thư phổi.
Phân lập tế bào từ các mô khác: Enzyme collagenase được ứng dụng thành công
trong việc phân lập các tế bào từ mô xương, mô sụn, tuyến giáp trạng, mô buồng trứng, mô dạ con, mô biểu bì, màng trong của tế bào, các tế bào thần kinh và các tế bào khác.
2.2.5. Tình hình nghiên cứu enzyme collagenase trên thế giới và Việt Nam 2.2.5.1. Nghiên cứu enzyme collagenase trên thế giới 2.2.5.1. Nghiên cứu enzyme collagenase trên thế giới
Trên Thế gới, những nghiên cứu về enzyme collagenase đều chủ yếu tập trung vào tìm kiếm và làm phong phú quỹ gen enzyme từ nhiều nguồn khác nhau. Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu hướng vào tìm kiếm những nguồn gen biểu thị vốn rất đa dạng trong giới vi sinh vật. Từ đây mở ra khả năng thu nhận enzyme collagenase có hoạt tính enzyme cao bằng công nghệ đơn giản, dễ kiểm soát và chi phí thấp hơn so với việc thu nhận enzyme từ nguồn khác. Thêm vào lợi thế của enzyme vi sinh vật thường có khoảng hoạt động rộng hơn và khả năng phân cắt mạnh hơn đối với nhiều enzyme khác.
Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase được phát hiện phần lớn phân lập từ môi trường đất như C. histolyticum, P. marinoglutinosa, Pseudomonas sp.. Tuy nhiên, những vi sinh vật này lại sinh ra độc tố (Kawahara, 1993). Bên cạnh đó, cũng có một số vi sinh vật như Bacillus cereus CNA1, Klebsiella pneumoniae
CNL3 được phân lập từ những thực phẩm lên men của Châu Á có hoạt tính enzyme collagenase (Warinda Suphatharaprateep et al., 2011). Việc ứng dụng enzyme collagenase trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm hay y học phải là những enzyme collagenase vi sinh vật an toàn, không sinh độc tố, điển hình là dòng vi khuẩn Bacillus subtilis FS-2 được ứng dụng khá nhiều trong lĩnh vực thực phẩm. Nagano et al. (1999) đã tiến hành nghiên cứu tách chiết enzyme collagenase từ dòng
Bacillus subtilis FS-2 và thu được nhiều kết quả khả quan.
Qua đó, đảm bảo sản phẩm tạo ra không gây nguy hiểm cho đối tượng sử dụng. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm các nguồn cho enzyme collagenase an toàn, hoạt lực cao với các đặc tính quý đến nay vẫn là mục tiêu nghiên cứu của nhiều nhà khoa học.
2.2.5.2. Nghiên cứu enzyme collagenase ở Việt Nam
Ở Việt Nam, có rất nhiều công trình nghiên cứu về enzyme protease đã được công bố và một số kết quả nghiên cứu đã có ứng dụng cụ thể như sử dụng acid protease trong y tế và chăn nuôi (Nguyễn Quỳnh Anh, 1985), trong sản xuất thử pancreatin (Phạm Quốc Thăng et al., 1983), sử dụng enzyme protease trong sản xuất bia, thử nghiệm thay thế enzyme protease - K trong kỹ thuật gen, trong sản xuất nước mắm hay tận dụng phế liệu thủy sản và một số sản phẩm khác. Tuy vậy, nghiên cứu về enzyme collagenase lại rất hạn chế và rất ít công trình công bố về vấn đề này. Đã có nhiều thử nghiệm sử dụng enzyme collagenase trong điều trị bỏng từ enzyme collagenase thương phẩm tại Viện bỏng Quốc gia, nhưng hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng thu nhận enzyme collagenase.
Năm 2004, Tô Kim Anh đã thực hiện nghiên cứu phân lập, tuyển chọn, tạo chủng giống sinh tổng hợp enzyme collagenase và ứng dụng trong thực phẩm. Nghiên cứu này là một nhánh thuộc đề tài nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chế biến một số nông sản thực phẩm của Ngô Tiến Hiển (2004). Nghiên cứu đã ghi nhận được những kết quả hữu ích cho việc ứng dụng thu nhận enzyme trong thực phẩm. Cụ thể, nghiên cứu đã tuyển chọn được dòng vi khuẩn Bacillus subtilis FS-2 từ một số thực phẩm lên men ở khu vực Châu Á và khảo sát các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase. Bước đầu xây dựng hoàn chỉnh quy trình thu nhận chế phẩm enzyme collagenase từ chủng Bacillus subtilis FS-2 tự nhiên, quy trình tinh chế và xác định đặc tính enzyme collagenase đồng thời phân lập gen mã hóa sinh tổng hợp enzyme collagenase bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). Ngoài ra, cũng thu nhận nhiều kết quả khi ứng dụng chế phẩm enzyme collagenase vào sản xuất để kiểm tra tính an toàn của chế phẩm, khả năng phân hủy collagen, khả năng làm mềm thịt, khả năng phân hủy một số protein dị ứng và sử dụng enzyme collagenase trong sản xuất nước mắm bằng cách thăm dò khả năng phân hủy da cá của enzyme collagenase thương phẩm với enzyme collagenase của Bacillus subtilis FS-2 sau 4
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Thời gian và địa điểm
Thời gian: Từ tháng 09/2013 đến tháng 04/2014.
Địa điểm: PTN Sinh học phân tử thực vật, PTN hóa sinh thực phẩm thuộc Viện NC&PT Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.2.Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu thí nghiệm
- Mẫu là ba loại mắm cá: mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc (có nguồn gốc tại huyện Châu Đốc, tỉnh An Giang).
- Gelatin dùng làm cơ chất phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase.
- Collagen dùng làm cơ chất cấy chuyển sau khi đã tách ròng các dòng vi khuẩn trên cơ chất gelatin.
3.2.2. Thiết bị và hóa chất
3.2.2.1. Thiết bị
- Bộ micropipette Nichipet Ex - Nhật Bản. - Cân điện tử Sartorius Teg 101 - Đức. - Lò vi sóng LG MS2029U - Hàn Quốc. - Máy đo OD Genesye 10UV - Đức.
- Máy lắc mẫu New Brunswich Scientific - Hoa Kỳ. - Máy ly tâm Hermle Z160m - Đức.
- Máy khuấy từ IKA C-MAG HS7 - Đức. - Nồi khử trùng nhiệt ướt Phinternational - Ý. - pH kế Eutech Instrument - Malaysia.
- Tủ cấy vi sinh vật Telstar - Tây Ban Nha. - Tủ lạnh trữ mẫu - 4oC Sanyo - Nhật Bản.
- Tủ lạnh trữ mẫu - 20oC Electrolux Comfort plus - Nhật Bản.