môi trƣờng Czapek cải tiến
Mục đích: Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase phát triển trên hai môi trường chứa gelatin và môi trường chứa collagen.
Nguyên tắc: Chọn những khuẩn lạc phát triển được trên môi trường chứa gelatin sau khi cấy trải, tiến hành cấy chuyển đến khi tách ròng từng dòng vi khuẩn. Sau đó, cấy chuyển khuẩn lạc từ môi trường chứa gelatin sang môi trường chứa collagen.
Cách tiến hành:
Quy trình phân lập vi khuẩn:
Thu mẫu
Đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu
Cấy trải trên đĩa petri môi trường bổ sung gelatin, ủ nhiệt độ 35oC trong 48 giờ ở điều kiện hiếu khí
Cấy chuyển sang đĩa môi trường bổ sung gelatin mới và kiểm tra độ ròng
Cấy chuyển trên môi trường bổ sung collagen
Quan sát hình thái khuẩn lạc
Trữ giống vi khuẩn
Lưu ý: Đĩa petri và môi trường phân lập được khử trùng nhiệt ướt ở 121oC, áp suất 1atm trong 20 phút. Khi nhiệt độ khử trùng đã hạ xuống khoảng 70oC - 80oC thì lấy ra và phân phối vào đĩa petri. Các thao tác phân phối và để nguội môi trường được tiến hành trong tủ cấy đã được khử trùng bằng tia UV.
Chuẩn bị mẫu
Thu mẫu: Mẫu là ba loại mắm cá: mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc.
Mắm cá được chế biến theo phương pháp thủ công truyền thống với nguyên liệu chính là cá và muối. Mẫu có nguồn gốc ở huyện Châu Đốc, tỉnh An Giang và được mua tại chợ Xuân Khánh, Thành phố Cần Thơ.
Đồng nhất mẫu: Cân 5gram mỗi loại mắm cá hòa với 15ml nước cất khử trùng,
lấy 10ml dịch trích mỗi mẫu cho vào bình tam giác có chứa 90ml môi trường tăng sinh chứa gelatin, tất cả đem ủ trong 48 giờ ở nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút.
Pha loãng mẫu
Sau 48 giờ lắc ủ, tiến hành pha loãng mẫu đến nồng độ 10-8.
Bảng 8. Nồng độ pha loãng mẫu
Nồng độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
Thể tích mẫu (µl) 100 100 100 100 100 100 100 100
Thể tích nƣớc cất (µl) 900 900 900 900 900 900 900 900
Tổng thể tích (µl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
Cấy trải vi khuẩn
Chọn 4 nồng độ pha loãng là 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 để tiến hành cấy trải.
Dùng micropipette hút 30µl dịch vi khuẩn ở mỗi nồng độ, nhỏ vào giữa đĩa môi trường phân lập vi khuẩn, dùng que trải đều giọt vi khuẩn khắp đĩa thạch và để khô mẫu tự nhiên. Úp ngược đĩa petri và ủ nhiệt độ 35oC trong 48 giờ, sau đó tiến hành tách ròng từng khuẩn lạc khác nhau.
Cấy chuyển
Tiến hành cấy chuyển để tách ròng từng khuẩn lạc (tất cả các thao tác đều được thực hiện trong tủ cấy vô trùng bao gồm đồng nhất mẫu, cấy trải, cấy chuyển). Các
khuẩn lạc vi khuẩn ròng được trữ trên môi trường ống thạch nghiêng (nhiệt độ 4oC) hoặc trữ trong dung dịch glycerol 50% (nhiệt độ - 20oC).