ngày nhằm mục đích tìm được dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme mạnh nhất (khi xét về yếu tố thời gian).
4.3. Hoạt tính enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn chọn
Sáu dòng có hoạt tính enzyme collagenase mạnh nhất dựa vào kích thước vòng phân giải được chọn để tiến hành xác định hoạt tính enzyme. Sau khi đồng nhất mật số (Bảng 17, Phụ lục 2), chủng các dòng vi khuẩn vào môi trường tăng sinh chứa collagen ở nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút trong thời gian 48 giờ. Ly tâm thu dịch enzyme thô tương tác với cơ chất collagen theo phương pháp Ninhydrin để xác định hoạt tính enzyme collagenase qua 4 ngày theo dõi. Kết quả đo hoạt tính enzyme được thể hiện trong hình 14 và bảng 21 (Phụ lục 3).
Kết quả đo cho thấy, cả sáu dòng vi khuẩn đều thể hiện hoạt tính enzyme collagenase với cơ chất collagen, tuy nhiên có sự khác biệt về thời điểm cho hoạt tính enzyme mạnh nhất. So sánh các dòng vi khuẩn ở biểu đồ hình 14 cho thấy, lượng enzyme collagenase được tiết ra ở mỗi dòng khác nhau qua các ngày. Cụ thể, dòng CV5, CV18, CV37, CV41 cho hoạt tính enzyme cao nhất vào ngày thứ hai, trong đó dòng CV41 có hoạt tính enzyme collagenase cao nhất là 2,85 U/ml, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với tất cả các dòng còn lại, so với dòng CV2 (có hoạt tính thấp nhất trong cùng ngày là 1,375 U/ml) dòng CV41 lớn gấp đôi. Tiếp đến là dòng CV37, CV18, CV32, CV5 lần lượt với 2,033 U/ml, 1,908 U/ml, 1,808 U/ml, 1,783 U/ml. Sang ngày thứ ba, hoạt tính enzyme của bốn dòng trên bắt đầu giảm, ngoài trừ hai dòng CV2, CV32 cho hoạt tính enzyme tăng mạnh nhất, lần lượt là 1,892 U/ml và 2,000 U/ml, khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các dòng còn lại trong cùng ngày. Cả sáu dòng đều giảm hoạt tính enzyme collagenase ở ngày thứ bốn.
Bảng 13. Hoạt tính enzyme collagenase theo thời gian của các dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn
Dòng VK Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4
CV2 0,517e 1,375d 1,892b 0,617bc CV5 0,817d 1,783c 1,35e 0,267c CV18 1,442b 1,908bc 1,717c 1,067ab CV32 1,308c 1,808c 2a 1,075ab CV37 0,942d 2,03b 1,25f 0,475bc CV41 2,017a 2,85a 1,533d 1,192a
Ghi chú: - Số liệu thống kê trên hình là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.
- Các giá trị trung bình tính ở các mẫu tự theo sau khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5% tính theo ngày.
Nguyên nhân sự khác nhau về thời gian cho hoạt tính enzyme collagenase mạnh nhất giữa các dòng vi khuẩn có thể do mỗi dòng vi khuẩn có đặc tính phát triển riêng nên sẽ tăng trưởng mạnh nhất trong những khoảng thời gian không giống nhau.
Theo báo cáo của Tô Kim Anh (2004), dòng vi khuẩn Bacillus subtilis Fs-2
(được biết với điều kiện tối ưu cho phản ứng enzyme ở nhiệt độ 50oC, pH 9,0, cơ chất đặc hiệu là collagen và gelatin) phân lập từ các mẫu thực phẩm lên men truyền thống ở khu vực Châu Á (như tương, chao, mắm cá,…) nuôi trong môi trường ngoài cơ chất collagen, còn bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng là yeast extract (dịch chiết nấm men) ở pH 7,2 - 7,5, lắc ủ trong thời gian sáu giờ sau, nhiệt độ 35oC. Hoạt tính enzyme collagenase được xác định theo phương pháp Ninhydrin, thông qua đường chuẩn leucine cho hoạt tính enzyme cao nhất 0,126 U/ml, giá trị này thấp hơn rất nhiều so với tất cả sáu dòng vi khuẩn được tuyển chọn trong nghiên cứu này, đặc biệt là dòng CV41 (hoạt tính 2,85 U/ml) cao gấp gần 23 lần. Sự khác biệt về điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, thời gian, nhiệt độ đã ảnh hưởng lớn đến lượng enzyme collagenase được sinh ra. Môi trường nếu được bổ sung thêm yeast extract, đồng nghĩa với cung cấp thêm nguồn protein cho vi sinh vật phát triển thì lượng enzyme tạo ra có thể nhiều hơn, tuy nhiên thời gian khảo sát hoạt tính enzyme vi khuẩn khá chênh lệnh giữa hai nghiên cứu dẫn đến hoạt tính đo được khác biệt cao.
Theo Warinda Suphatharaprateep et al. (2011), với nguồn phân lập là các sản phẩm cá lên men truyền thống của Thái Lan (nước mắm, pla-som, pla-ra và pla-pan-
dinh dưỡng glucose (0,5%) và yeast extract (0,1%) đã tìm ra hai dòng vi khuẩn
Bacillus subtilis CNA1 nhóm Gram dương và Klebseilla pneumonia CNL3 nhóm
Gram âm có hoạt tính enzyme collagenase. Khi tối ưu các điều kiện nuôi cấy, ghi nhận được dòng CNA1 (pH 7,5, nhiệt độ 37o
C, gelatin 1%, thời gian 24 giờ) có hoạt tính enzyme 22,07 U/ml và dòng CNL3 (pH 6,0, nhiệt độ 37oC, gelatin 1,5%, thời gian 48 giờ) có hoạt tính 10,53 U/ml. Hoạt tính enzyme hai dòng CNA1 và CNL3 đều cao hơn sáu dòng vi khuẩn được tuyển chọn, lớn hơn lần lượt gần 8 và 4 lần so với dòng CV41 phân lập được. Từ nghiên cứu này cho thấy, các dòng vi khuẩn phát triển được trên cơ chất gelatin hay collagen đều có khả năng cho hoạt tính enzyme collagenase. Và khả năng sinh enzyme của sáu dòng vi khuẩn tuyển chọn có thể tăng cao hơn khi được tối ưu các điều kiện nuôi cấy.
Dựa vào giá trị hoạt tính enzyme khảo sát qua bốn ngày được đo bằng phương pháp Ninhydrin của sáu dòng vi khuẩn trên, ba dòng có hoạt tính enzyme collagenase mạnh nhất là CV41, CV37 ở ngày thứ hai, CV32 ở ngày thứ ba được chọn để xác định một số đặc điểm hình thái vi khuẩn và thử nghiệm sinh hóa để hỗ trợ cho việc định danh. Với mục đích tìm được dòng vi khuẩn tốt nhất để ứng dụng sản xuất enzyme collagenase hiệu quả khi xét về yếu tố hiệu suất và thời gian vi khuẩn sinh enzyme.
4.4. Kiểm tra một số đặc tính hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase mạnh đƣợc tuyển chọn 4.4.1. Đặc tính hình thái
Ba dòng vi khuẩn CV32, CV37 và CV41 được chọn để xác định hình dạng, nhuộm Gram, khả năng di động. Kết quả được trình bày ở bảng 14 và hình 14.
Bảng 14. Kết quả nhuộm Gram của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn
STT Dòng VK Hình dạng Gram Di động
1 CV32 Cầu Âm Có
2 CV37 Cầu Âm Có
3 CV41 Que ngắn Âm Có
Kết quả thu nhận được cho thấy cả ba dòng CV32, CV37, CV41 có hình dạng vi khuẩn khác nhau, dòng CV32 và CV37 có dạng hình cầu nhỏ, dòng CV41 có dạng hình que ngắn; và đều có chung đặc điểm là thuộc nhóm Gram âm cũng như khả năng di động. Mặc dù, các dòng vi khuẩn này được phân lập từ cùng nguồn là mắm cá sặc, tuy nhiên mỗi dòng mang những đặc điểm hình dạng khuẩn lạc, độ nổi, dạng bìa, màu sắc và tốc độ phát triển khác nhau.
Hình 14. Kết quả nhộm Gram của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn
(*Ghi chú: CV32 (1), CV37 (2) và CV41 (3))
4.4.2. Đặc tính sinh hóa
Sau khi xác định một số đặc tính hình thái các dòng vi khuẩn CV32, CV37, CV41 được chọn, tiến hành kiểm tra một số thử nghiệm sinh hóa amylase, catalase, Indol, MR và VP. Kết quả được thể hiện trong bảng 15 và hình 15.
Bảng 15. Kết quả thử nghiệm một số đặc tính sinh hóa của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn
STT Dòng VK Amylase Catalase Indol Methyl Red Voges
proskauer
1 CV32 + + - - -
2 CV37 + (-) + + - -
3 CV41 + + - - -
(*Ghi chú: +: Phản ứng dương tính, -: Phản ứng âm tính, +(-): Phần lớn là phản ứng dương tính)
Thông tin từ bảng 14 và hình 14cho thấy, ba dòng vi khuẩn đều cho phản ứng âm tính với thử nghiệm MR và VP. Phản ứng dương tính với thử nghiệm catalase và amylase, mặc dù có sự khác biệt nhỏ ở dòng CV37 khi hỗn hợp cho phản ứng mất màu xanh tím đặc trưng (so với ống đối chứng) nhưng vẫn còn có màu hơi đậm so với hai dòng CV32, CV41 đã mất màu xanh tím hoàn toàn và chuyển sang màu trắng, chứng tỏ dòng CV37 tác dụng chưa đủ mạnh để làm mất màu xanh tím hoàn toàn nên ghi nhận phần lớn là phản ứng dương tính. Tiếp tục thử nghiệm indol, dòng CV32 và CV41 cho kết quả âm tính, còn dòng CV37 cho kết quả dương tính.
Hình 15. Kết quả một số thử nghiệm sinh hóa của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn
(*Ghi chú: amylase (A), MR (B), indol (C), VP (D) vc (E))
Kết quả kiểm tra một số đặc tính hình thái và một số thử nghiệm sinh hóa của ba dòng vi khuẩn được chọn ở trên xem như tiền đề cho việc định danh xác định tên vi khuẩn, qua đó thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về khả năng ứng dụng của các dòng vi khuẩn phân lập được.
CV32 2 CV37 2 CV41 ĐC CV32 2 CV37 2 CV41 ĐC CV32 2 CV37 2 CV41 ĐC CV32 2 CV37 2 CV41 ĐC B A D C CV32 CV37 CV41 ĐC E
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Với ba mẫu mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc đã phân lập được 41 dòng vi khuẩn hiếu khí có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase.
Các dòng vi khuẩn phân lập được khá đa dạng về đặc điểm khuẩn lạc, phần lớn khuẩn lạc có dạng không đều (chiếm 73,2%), độ nổi mô (chiếm 65,9%), dạng bìa nguyên (chiếm 63,4%), màu trắng đục (31,7%), tốc độ phát triển trung bình (chiếm 48,8%), vi khuẩn dạng hình cầu (chiếm 82,9%) và tất cả các dòng đều di dộng.
19 trong số 41 dòng vi khuẩn phân lập được thể hiện khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase dựa vào kích thước vòng thủy phân trên cơ chất.
Sáu dòng vi khuẩn có kích thước vòng halo lớn nhất được chọn để xác định hoạt tính enzyme collagenase, dòng vi khuẩn CV41 cho hoạt tính enzyme cao nhất 2,850 U/ml vào ngày thứ hai, tiếp đến là dòng vi khuẩn CV37 cho hoạt tính 2,033 U/ml vào ngày thứ hai và dòng vi khuẩn CV32 cho hoạt tính 2 U/ml vào ngày thứ ba.
Đặc tính hình thái của ba dòng vi khuẩn được chọn cho thấy cả ba dòng đều thuộc nhóm Gram âm, dòng CV32 và CV37 có dạng hình cầu, dòng CV41 có dạng hình que ngắn.
Đặc tính sinh hóa, dòng CV32 cho kết quả dương tính với thử nghiệm Amylase, Catalase và Indol; âm tính với thử nghiệm MR và VP. Dòng CV37 cho kết quả dương tính với thử nghiệm Catalase và Indol, phần lớn là dương tính với thử nghiệm Amylase; âm tính với thử nghiệm MR và VP. Dòng CV 41 cho kết quả dương tính với thử nghiệm amylase và catalase; âm tính với thử nghiệm Indol, MR và VP.
Từ các kết quả quan sát và ghi nhận được, dòng vi khuẩn CV41 có thể được tuyển chọn như dòng vi khuẩn có khả năng để sản xuất enzyme collagenase tốt nhất trong 41 dòng vi khuẩn phân lập được.
5.2. Đề nghị
Định danh dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagen được tuyển chọn từ trong 41 dòng vi khuẩn phân lập được.
Khảo sát yếu tố pH ảnh hưởng đến sự phát triển và hoạt động của dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagen được tuyển chọn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2009. Giáo trình Vi sinh vật đại cương. Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Cần Thơ, trang 76.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền. 2005. Xây dựng quy trình phát hiện Escherichia Coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và thử nghiệm ứng dụng. Luận văn thạc sĩ. Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Thành phố Hồ
Chí Minh.
Hoàng Tấn Quảng, et al. 2010. Đa dạng của quần thể bưởi Thanh trà (Citrus grandis
(L.) Osbeck) ở Hương Trà , Thừ a Thiên Hu ế. Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(2):
213-220.
Lâm Thiên Nga. 2011. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose từ cá ăn
cỏ. Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Cần
Thơ.
Lê Ngọc Tú, et al. 1994. Hóa học thực phẩm. Nxb. Khoa học và kỹ thuật Hà Nội,
trang 292.
Nguyễn Quỳnh Anh. 1985. Thu nhận, ứng dụng pepsin và acid protease của Aspergillus niger trong y tế và chăn nuôi. Luận án tiến sĩ khoa học. Trường Đại
học Bách khoa Hà Nội.
Nguyễn Thị Huyền, et al. 2012. Tách chiết collagen từ da cá Tra bằng phương pháp hóa học. Tạp chí nghiên cứu khoa học. Trường Đại học Nha Trang, 2:31-36. Nguyễn Văn Hạnh. 2009. Kiểm nghiệm vi sinh vật. Trường Đại học Bách khoa Hà
Nội.
Nguyễn Văn Hiếu. 2012. Nghiên cứu thu nhận protease kiềm tái tổ hợp có hoạt tính
enzyme keratinase từ vi khuẩn và ứng dụng trong công nghiệp thuộc da. Luận án
tiến sĩ. Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
Phạm Quốc Thắng, Đồng Thanh Thu và Vũ Kim Thành. 1983. Nghiên cứu sản xuất pancreatin. Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
Tô Kim Anh. 2004. Nghiên cứu công nghệ thu nhận enzyme collagenase từ vi khuẩn
Tiếng Anh
Bailey, A.J., et al. 1984. The chemistry of intramuscular collagen. In “Recent advances in the chemistry of meat”. Royal Society of Chemistry, 3:22-27.
Bond, M.D. and H.E. Van Wart. 1984. Purification and separation on individual collagenase of Clostriddium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemisty, 23:3077-3079.
Brocklehurt, K., B.S. Baines and M.P.J. Kierstan. 1981. Papain and other constituents of Cariva papaya L. In “Topic in enzyme fermentation Biotechnology”. Ellis
Horwood Ltd. Chicago.
Endo, A., et al. 1987. Purification and properties of collagenase from a streptomyces species. J. Biochem, 102:163-170.
Fukushima, J., et al. 1990. Molecular cloning and partial DNA sequencing of the collagenase gene of Vibrio alginolyticus. Microbiol. Immunol. 34: 977-984. Furcolo, G., M. Marziali and L. Businco. 1996. Food allergy: recent findings. Pediatr.
Med. Chir, 18:551-557.
Gallop, M.P., S. Seifter and E. Meilman. 1957. Studies on collagen I. The partial purification, assay and mode of activation of bacterial collagenase. J. Biol. Chem, 227:891-906.
Gilles, A.M. and B. Keil. 1976. Cleavage of β - casein by collagenases from
Achromobacter iophagus and Clostridium histolyticum. FEBS letters, 6:369-372.
Goldbreg, G.I., et al. 1986. Human fibroblast collagenase: Complete primary structure and homology to oncogene transformation induced rat protein. J. Biol. Chem,
261:6600-6605.
Gupta, A., et al. 2005. One - step purification and characterization of an alkaline protease from haloalkaliphilic Bacillus sp. J. Chromatogr. A, 1075:103-108. Hanada, K., et al. 1973. The isolation of collagenase and its enzymological and
physico - chemical properties. Agric. Biol. Chem, 37:1771-1781. Harper, E.. 1980. Collagenase. A. Rev. Biochem, 49:1063-1078.
Hisano, T., et al. 1989. Isolation and properties of a collagenase with caseinolytic activity from a Pseudomonas sp. J. Fremen. Bioeng, 68:399-403.
Jongjareonrak, A., et al. 2005. Isolation and characterisation of acid and pepsin solubilised collagens from skin of Brownstripe red snapper (Lutjanus vitta). Food
Chem, 93:475-484.
Joseph, R., et al. 1978. Purification and characterisation of a marine bacterial collagenase. Biochemistry, 14:2857-2863.
Kanayama, Y. and Y. Saika. 2005. Purification and properties of a new type of protease produced by Microbacterium liquefaciens. Biosci. Biotechnol. Biochem, 69:916-921.
Kawahara, H., et al. 1993. Isolation and characterization of a new type of collagenase producing bacterium, Bacillus alvei DC-1. Biosci. Biotech. Biochem, 57:1372-
1373.
Medina, P. and L. Baresi. 2007. Rapid identification of gelatin and casein hydrolysic using TCA. J. Microb. Methods, 69:391-393.
Merkel, J.R., J.H. Dreisbach and H.B. Ziegler. 1975. Collagenolytic activity of some marine bacteria. Appl Microbiol, 2:145–151.
Muyonga, J.H., et al. 2004. Characterization of acid soluble collagen from skins of young and adult Nile perch (Lates nilotics). Food Chem, 85:81-89.
Nagano, H. and K.A. To. 1999. Purification of collagenase and specificity of its related enzyme from Bacillus subtilis FS-2. Biosci. Biotechnol. Biochem, 63:181- 183.
Peterkofsky, B., et al. 1982. Bacterial collagenase. Methods enzymol, 82:453-471. Raper, K.B., D.I. Fennell. 1965. The genus Aspergillus. Baltimore: Williams and
Wilkins.
Sasagawa, Y., et al. 1993. Purification and properties of collagenase from Cytophaga sp. L43-1 strain. Biosci, Biotechnol, Biochem, 57:1894-1898.
Seifter, S. and E. Harper. 1971. The enzyme collagenase. Chap 18. In The Enzymes, Vol.3, ed by Boyer P.D., Academic Press, New York, pp.649-697.
Singh, A., et al. 1994. Production of thermostable acic protease by Aspergillus niger. Lett. Appl. Microbiol, 18:177-180.
Takeuchi, H., et al. 1992. Structural gene and complete amino acid sequence of Vibrio
alginolyticus collagenase. Biochem. J, 281:703-708.
bone, and fins. Food chemistry, 15:277-281.
Timar, J., H. Botyanszki and J. Babo. 1998. The antiproliferative action of a melphalan hexapeptide with collagenase - cleavable site. Cancer chemotherapy and pharmacology, 41:292-298.
Tran, L.H. and H. Nagano. 2002. Isolation and characteristics of Bacillus subtilis CN2 and its collagenase production. J. Food Sci, 67:1184-1187.
Watanabe, K., et al. 2004. Collagenolytic proteases from bacteria. Appl. Microb.