đƣợc tuyển chọn từ các dòng phân lập đƣợc
Mục đích: Chọn được những dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme collagenase mạnh nhất từ các dòng tuyển chọn.
Nguyên tắc: Hoạt tính enzyme collagenase được xác định dựa vào hàm lượng nhóm - NH2 giải phóng ra khi cho dịch thô enzyme collagenase tương tác với cơ chất collagen thông qua phương pháp Ninhydrin, hàm lượng - NH2 được tính toán dựa theo đường chuẩn leucine.
Các tiến hành:
Dựng đường chuẩn leucine
- Chuẩn bị 6 ống nghiệm, cho vào mỗi ống nghiệm thành phần các chất theo bảng 9 và 10.
Bảng 9. Nồng độ pha dung dịch leucine
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Nồng độ dung dịch leucine chuẩn µg/ml 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Dung dịch leucine 10 µg/ml (ml) 0 1 2 3 4 5
Nước chất (ml) 10 9 8 7 6 5
Tổng thể tích (ml) 10 10 10 10 10 10
Bảng 10. Thành phần hoá chất dựng đƣờng chuẩn leucine
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Nồng độ dung dịch leucine chuẩn µg/ml 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Thể tích dung dịch leucine mỗi nồng độ (ml) 2 2 2 2 2 2
Dung dịch Ninhydrin 2% (ml) 2 2 2 2 2 2
Ethanol 50% (ml) 6 6 6 6 6 6
Tổng thể tích (ml) 10 10 10 10 10 10
(*Ghi chú: Lặp lại 3 lần/nồng độ)
(*Nguồn: Hoàng Tấn Quảng, 2010)
- Đo giá trị OD ở bước sóng 570nm. - Vẽ biểu đồ đường chuẩn.
Tách chiết enzyme:
Chọn các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase mạnh nuôi trong môi trường tăng sinh chứa collagen 48 giờ. Sau đó hút 1ml dịch vi khuẩn, ly tâm 13.000 vòng/10 phút, loại bỏ phần sinh khối, lấy phần dịch trong sử dụng như enzyme ngoại bào.
Xác định hoạt tính enzyme collagenase:
Tiến hành xác định ở các thời điểm 1, 2, 3, 4 ngày sau khi chủng vi khuẩn vào môi trường tăng sinh chứa collagen.
Ủ 10mg collagen trong 10 phút ở nhiệt độ 37o
C trong 0,8ml dung dịch đệm Tris - HCl 50mM (pH 7,5). Phản ứng enzyme được thực hiện trên máy lắc ổn ở nhiệt độ 35oC khi cho 0,2ml dịch enzyme thô vào hỗn hợp ở trên. Tiến hành phản ứng trong 30 phút và dừng phản ứng bằng 1ml dung dịch acid acetic 0,1M. Hàm lượng nhóm - NH2 giải phóng được xác định bằng phương pháp Ninhydrin (Tô Kim Anh, 2004).
Phương pháp Ninhydrin: Hỗn hợp trên phản ứng với 2ml dung dịch ninhydrin
2% (pha trong ethanol 50%) được ủ lắc ở nhiệt độ 100oC, trong 30 phút, sau đó hỗn hợp được làm nguội trong nước đá 5 phút. Định mức hỗn hợp đến 10ml bằng ethanol 50%. Hỗn hợp phản ứng màu được đo độ hấp thụ quang trên máy đo quang phổ ở
bước sóng 570nm. Hàm lượng nhóm - NH2 được tính toán theo đường chuẩn leucine 0,1 - 0,5µg/ml (Hoàng Tấn Quảng, 2010).
“Một đơn vị hoạt tính enzyme collagenase được tính bằng số µmol leucine tương
đương giải phóng trong điều kiện phản ứng”.
Đơn vị hoạt tính enzyme trong 1ml enzyme được tính theo công thức:
k V T V X U E t). . . ( Trong đó:
U: Hoạt tính enzyme (U/ml).
X: Hàm lượng leucine trong dung dịch đo (µg/ml). Vt: Tổng thể tích phản ứng (10ml).
T: Thời gian phản ứng (30 phút). VE: Thể tích enzyme (0,2ml).
k: Hệ số pha loãng (k = 5, hệ số chuyển từ 0,2ml đến 1ml).
3.3.4. Xác định một số đặc tính hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase mạnh đƣợc tuyển chọn
Mục đích: Xác định rõ hơn về đặc điểm nhận biết các dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme collagenase mạnh được tuyển chọn và thuận lợi cho việc định danh các dòng vi khuẩn để tiến hành những nghiên cứu sâu hơn.
3.3.4.1. Xác định một số đặc tính hình thái vi khuẩn
Quan sát hình thái vi khuẩn
Nguyên tắc: Mỗi dòng vi khuẩn được kiểm tra dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000, quan sát mô tả đặc tính hình thái vi khuẩn.
Tiến hành quan sát hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép và xác định dưới kính hiển vi quang học.
Nhuộm Gram vi khuẩn
Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất, màng tế bào với thuốc tím kết tinh và Iod mà hình thành nên hai nhóm phức chất khác nhau.
- Nhóm phức chất thứ nhất: Vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn 70o. Vi sinh vật có phức chất này thuộc nhóm Gram dương.
- Nhóm phức chất thứ hai: Không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn 70o và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc nhóm Gram âm.
Hình 10. Các bƣớc trong giai đoạn nhuộm Gram
(*Nguồn: http://tulieu.violet.vn/document/show/entry_id/139015 ngày 03/08/2013 ngày 21/12/2013) 3.3.4.2. Xác định một số đặc tính sinh hóa Nguyên tắc: - Đặc tính amylase - Đặc tính catalase - Đặc tính indol - Đặc tính Methyl Red (MR) - Đặc tính VP (Voges Proskauer)
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc
4.1.1. Số lƣợng dòng vi khuẩn phân lập đƣợc
Từ ba mẫu mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc ban đầu (có nguồn gốc ở huyện Châu Đốc, tỉnh An Giang), phân lập được 41 dòng vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí. Trong 41 dòng phân lập được, có 13 dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu mắm cá cơm (chiếm 31,7%), 16 dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu mắm cá linh (chiếm 39,0%) và 12 dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu mắm cá sặc (chiếm 29,3%) (Bảng 11). Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng phát triển tốt trên môi trường chứa gelatin (giai đoạn phân lập) và trên môi trường chứa collagen (giai đoạn sau khi tách ròng). Điều này chứng tỏ các dòng vi khuẩn này có khả năng sử dụng cả 2 loại cơ chất gelatin và collagen như nguồn dinh dưỡng chủ yếu cho sự phát triển của vi khuẩn.
Các dòng vi khuẩn được đặt tên theo thứ tự mẫu phân lập với ký hiệu CVx, CV là tên dòng vi khuẩn và x là số thứ tự phân lập vi khuẩn theo nguồn (Bảng 12).
Bảng 11. Số lƣợng dòng vi khuẩn theo nguồn gốc phân lập
STT Nguồn gốc phân lập Số lƣợng dòng VK Tên dòng VK
1 Mắm cá cơm 13 Từ dòng CV1 đến CV13
2 Mắm cá linh 16 Từ dòng CV14 đến CV29
3 Mắm cá sặc 12 Từ dòng CV30 đến CV41
Tổng 3 41
4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc
Sau giai đoạn phân lập, các dòng vi khuẩn tách ròng được cấy chuyển trên môi trường có bổ sung collagen để quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn.
Bảng 12. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc
STT Dòng
VK
Đặc điểm khuẩn lạc
Hình dạng Độ nổi Dạng bìa Màu sắc
1 CV1 Không đều Mô Nguyên Trắng đục
2 CV2 Không đều Lài Răng cưa Trắng hơi đục
3 CV3 Không đều Mô Nguyên Trắng đục
6 CV6 Không đều Mô Nguyên Trắng đục
7 CV7 Không đều Lài Răng cưa Trắng đục
8 CV8 Không đều Lài Răng cưa Trắng trong
9 CV9 Không đều Lài Răng cưa Trắng trong
10 CV10 Không đều Mô Nguyên Trắng đục
11 CV11 Tròn Mô Nguyên Trắng hơi đục
12 CV12 Tròn Mô Nguyên Trắng đục
13 CV13 Tròn Lài Nguyên Trắng đục
14 CV14 Không đều Lài Răng cưa Trắng trong
15 CV15 Không đều Mô Nguyên Trắng hơi đục
16 CV16 Không đều Lài Răng cưa Trắng
17 CV17 Không đều Mô Răng cưa Hơi vàng
18 CV18 Không đều Lài Nguyên Trắng
19 CV19 Tròn Mô Nguyên Trắng trong
20 CV20 Không đều Mô Nguyên Trắng đục
21 CV21 Tròn Mô Nguyên Trắng trong
22 CV22 Không đều Mô Răng cưa Hơi vàng
23 CV23 Không đều Mô Răng cưa Trắng đục
24 CV24 Không đều Mô Răng cưa Trắng trong
25 CV25 Không đều Mô Nguyên Trắng đục
26 CV26 Không đều Mô Nguyên Trắng trong
27 CV27 Không đều Mô Nguyên Hơi vàng
28 CV28 Không đều Lài Răng cưa Trắng trong
29 CV29 Tròn Mô Nguyên Vàng đậm
30 CV30 Không đều Lài Răng cưa Trắng đục
31 CV31 Không đều Mô Nguyên Hơi vàng
32 CV32 Không đều Lài Răng cưa Trắng trong
33 CV33 Không đều Lài Răng cưa Trắng
34 CV34 Tròn Mô Nguyên Trắng đục
35 CV35 Tròn Mô Nguyên Trắng hơi đục
36 CV36 Không đều Mô Nguyên Hơi vàng
37 CV37 Không đều Lài Nguyên Trắng trong
38 CV38 Không đều Mô Nguyên Trắng đục
39 CV39 Không đều Mô Nguyên Hơi vàng
40 CV40 Tròn Mô Nguyên Trắng hơi đục
41 CV41 Tròn Mô Nguyên Vàng đậm
Các dòng vi khuẩn phân lập được khá đa dạng về đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bao gồm nhiều dạng khác nhau. Trong đó, phần lớn là dạng khuẩn lạc không đều có 30 dòng (chiếm 73,2%), 11 dòng có khuẩn lạc tròn (chiếm 26,8%). Độ nổi khuẩn lạc chủ yếu có 2 dạng, 27 dòng có khuẩn lạc dạng nổi mô (chiếm 65,9%) và 14 dòng dạng nổi lài (chiếm 34,1%). Tương tự, các dòng vi khuẩn phân lập được cũng có 2 dạng bìa chính là dạng bìa răng cưa với 15 dòng (chiếm 36,6%) và dạng bìa nguyên với 26 dòng (chiếm 63,4%). Màu sắc khuẩn lạc tương đối phong phú, 3 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng (chiếm 7,3%), 13 dòng có khuẩn lạc màu trắng đục (chiếm 31,7%), 5 dòng có khuẩn lạc màu trắng hơi đục (chiếm 12,2%), 12 dòng có khuẩn lạc màu trắng trong (chiếm 29,3%), 6 dòng có khuẩn lạc màu vàng nhạt (chiếm 14,6%) và 2 dòng có khuẩn lạc màu vàng đậm (chiếm 4,9%) (Bảng 12).
Hình 11. Hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn
Sau quá trình quan sát và ghi nhận lại một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc, các dòng vi khuẩn được trữ trong dung dịch glycerol 50% với tỷ lệ giữa dịch vi khuẩn và glycerol 50% là 1:1, ở nhiệt độ -20oC để tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo.
4.2. Đánh giá và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc enzyme collagenase từ các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc
Sau khi đồng nhất mật số vi khuẩn (Bảng 16, Phụ lục 2), các dòng vi khuẩn tiếp tục được nuôi trong môi trường tăng sinh chứa collagen ở nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút, thời gian 48 giờ. Enzyme thô của các dòng vi khuẩn thu được bằng cách ly tâm 1ml dịch vi khuẩn với tốc độ 13.000 vòng/phút để thực hiện phản ứng với cơ chất
khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase, thực hiện đồng thời với cơ chất gelatin để xác định khả năng cho hoạt tính enzyme gelatinase của các dòng vi khuẩn phân lập được. Kết quả được thể hiện thông qua vòng phân giải không màu xung quanh giếng thạch trên môi trường chứa cơ chất phù hợp khi nhuộm với dung dịch TCA 35% (Hình 12).
Hình 12. Vòng phân giải của các dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme collagenase
Tất cả 41 dòng vi khuẩn phân lập được đều thể hiện hoạt tính enzyme gelatinase, tuy nhiên chỉ có 19 dòng có hoạt tính enzyme collagenase (chiếm 46,3%). Các dòng vi khuẩn tạo vòng phân giải có kích thước khác nhau tương ứng với khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase trên cơ chất collagen khác nhau, biến thiên trong khoảng từ 0,33mm - 14mm, dòng CV41 cho kết quả kích thước vòng phân giải lớn nhất (14mm) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với tất cả các dòng vi khuẩn còn lại, kích thước lớn gấp 42 lần so với dòng CV2 (có kích thước vòng phân giải nhỏ nhất 0,33mm). Các dòng CV5, CV18, CV37 có kích thước vòng phân giải khá lớn 7,67 - 8,67mm. Ngoại trừ dòng CV41 và ba dòng vi khuẩn trên, các dòng còn lại có kích thước vòng phân giải khá thấp (dưới 6,5mm). Trong đó, các dòng CV3, CV10, CV33, CV35 có kích thước vòng phân giải thấp nhất (0,33 - 1mm), thấp hơn 14 - 42 lần so với dòng CV41 (Hình 13 và Bảng 19, Phụ lục 3).
Hình 13. Biểu đồ thể hiện khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn
Ghi chú: - Số liệu thống kê trên hình là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.
- Các giá trị trung bình ở mỗi thanh ngang có các mẫu tự theo sau khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ ở mức 5%.
Với 22 dòng vi khuẩn không có khả năng tạo vòng phân giải, đặt ra giả thuyết các dòng này chưa đủ mạnh để sinh enzyme collagenase sau 2 ngày nuôi tăng sinh. Tuy nhiên, khi tăng thời gian tăng sinh lên 3, 4 và 5 ngày, đồng thời tăng thời gian phản ứng với TCA 35% lên 24 - 48 giờ, các dòng này vẫn không tạo vòng phân giải. Điều này chứng tỏ, 22 dòng vi khuẩn này không có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase. 6,33bcd 1,00ef 8,67bc 1,33ef 2,00def 1,00ef 3,33cdef 1,33ef 1,67ef 7,67bc 0,33f 5,33bcde 6,33bcd 1,67ef 1,00ef 7,67bc 4,33bcdef 1,33ef 14a 0 2 4 6 8 10 12 14 16 CV2 CV3 CV5 CV7 CV8 CV10 CV11 CV16 CV17 CV18 CV22 CV23 CV32 CV33 CV35 CV37 CV39 CV40 CV41 D òn g vi k h u ẩn Đƣờng kính vòng phân giải (mm)
Kích thước đường kính vòng phân giải chưa đánh giá đầy đủ khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase của mỗi dòng vi khuẩn phân lập được, do thí nghiệm tiến hành khảo sát trong cùng một điều kiện về tốc độ lắc (120 vòng/phút), nhiệt độ (35oC), độ pH (pH 6,9 - 7,5), thời gian (48 giờ). Vì vậy, kết quả đo trên được xem như bước tiền đề để xác định chính xác hơn về khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase.
Sáu dòng vi khuẩn CV2, CV5, CV18, CV32, CV37, CV41 có kích thước vòng phân giải lớn nhất (6,33 - 14mm) trong 19 dòng có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase được chọn để khảo sát hoạt tính enzyme collagenase trong thời gian bốn ngày nhằm mục đích tìm được dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme mạnh nhất (khi xét về yếu tố thời gian).
4.3. Hoạt tính enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn chọn
Sáu dòng có hoạt tính enzyme collagenase mạnh nhất dựa vào kích thước vòng phân giải được chọn để tiến hành xác định hoạt tính enzyme. Sau khi đồng nhất mật số (Bảng 17, Phụ lục 2), chủng các dòng vi khuẩn vào môi trường tăng sinh chứa collagen ở nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút trong thời gian 48 giờ. Ly tâm thu dịch enzyme thô tương tác với cơ chất collagen theo phương pháp Ninhydrin để xác định hoạt tính enzyme collagenase qua 4 ngày theo dõi. Kết quả đo hoạt tính enzyme được thể hiện trong hình 14 và bảng 21 (Phụ lục 3).
Kết quả đo cho thấy, cả sáu dòng vi khuẩn đều thể hiện hoạt tính enzyme collagenase với cơ chất collagen, tuy nhiên có sự khác biệt về thời điểm cho hoạt tính enzyme mạnh nhất. So sánh các dòng vi khuẩn ở biểu đồ hình 14 cho thấy, lượng enzyme collagenase được tiết ra ở mỗi dòng khác nhau qua các ngày. Cụ thể, dòng CV5, CV18, CV37, CV41 cho hoạt tính enzyme cao nhất vào ngày thứ hai, trong đó dòng CV41 có hoạt tính enzyme collagenase cao nhất là 2,85 U/ml, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với tất cả các dòng còn lại, so với dòng CV2 (có hoạt tính thấp nhất trong cùng ngày là 1,375 U/ml) dòng CV41 lớn gấp đôi. Tiếp đến là dòng CV37, CV18, CV32, CV5 lần lượt với 2,033 U/ml, 1,908 U/ml, 1,808 U/ml, 1,783 U/ml. Sang ngày thứ ba, hoạt tính enzyme của bốn dòng trên bắt đầu giảm, ngoài trừ hai dòng CV2, CV32 cho hoạt tính enzyme tăng mạnh nhất, lần lượt là 1,892 U/ml và 2,000 U/ml, khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các dòng còn lại trong cùng ngày. Cả sáu dòng đều giảm hoạt tính enzyme collagenase ở ngày thứ bốn.
Bảng 13. Hoạt tính enzyme collagenase theo thời gian của các dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn
Dòng VK Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4
CV2 0,517e 1,375d 1,892b 0,617bc CV5 0,817d 1,783c 1,35e 0,267c CV18 1,442b 1,908bc 1,717c 1,067ab CV32 1,308c 1,808c 2a 1,075ab CV37 0,942d 2,03b 1,25f 0,475bc CV41 2,017a 2,85a 1,533d 1,192a
Ghi chú: - Số liệu thống kê trên hình là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.
- Các giá trị trung bình tính ở các mẫu tự theo sau khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5% tính theo ngày.
Nguyên nhân sự khác nhau về thời gian cho hoạt tính enzyme collagenase mạnh nhất giữa các dòng vi khuẩn có thể do mỗi dòng vi khuẩn có đặc tính phát triển riêng nên sẽ tăng trưởng mạnh nhất trong những khoảng thời gian không giống nhau.