vi khuẩn phân lập đƣợc
Mục đích: Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase mạnh từ các dòng phân lập được.
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn phân lập được phát triển trong cơ chất collagen và khả năng phân giải collagen của TCA (Trichloroacetic acid). Đối với những dòng vi khuẩn không có khả năng phân giải collagen sẽ có màu trắng đục trên môi trường, vì TCA có khả năng phản ứng với thành phần collagen trong môi trường. Đối với những dòng vi khuẩn có nhóm enzyme collagenase thì nó sẽ phân giải được collagen tạo vòng trong xung quanh giếng thạch (lỗ đục agar chứa dịch enzyme thô) khi có mặt dung dịch TCA.
Quy trình gồm các bước:
- Dùng kim cấy lấy khuẩn lạc ròng cho vào môi trường tăng sinh chứa collagen đã chuẩn bị từ trước.
- Nuôi vi khuẩn trong môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút, thời gian 48 giờ.
- Đồng nhất mật số vi khuẩn. Vi khuẩn sau khi đồng nhất mật số được nuôi trong môi trường tăng sinh chứa collagen ở nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút, thời gian 48 giờ.
- Sau 48 giờ, rút 1ml dịch vi khuẩn ly tâm 13.000 vòng/10 phút, loại bỏ phần sinh khối, lấy phần dịch trong sử dụng như enzyme ngoại bào (dịch enzyme thô).
- Nhỏ 25µl dịch enzyme thô trên giếng thạch của môi trường chứa collagen đã chuẩn bị trước (giếng thạch có đường kính 7mm), để dịch khếch tán đều xung quanh giếng thạch, để khô, úp ngược đĩa petri và ủ 48 giờ ở nhiệt độ 35oC trong điều kiện hiếu khí (lặp lại 3 lần/mẫu). Vi khuẩn phát triển trên đĩa được kiểm tra bằng dung dịch TCA 35% (Medina et al., 2007) trong 1 giờ và quan sát kết quả.
- Đo vòng tròn thủy phân (vòng halo) xung quanh giếng thạch. - Chỉ tiêu quan sát: Hoạt tính phân giải được tính dựa vào công thức:
ĐK vòng phân giải = [ĐK vòng thủy phân - ĐK giếng thạch] (mm)
(*Ghi chú: ĐK: Đường kính) (*Nguồn: Võ Chí Bắc et al., 2010)
Phương pháp đếm mật số vi khuẩn:
- Nuôi vi khuẩn trong môi trường tăng sinh chứa collagen 48 giờ, nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút.
- Tiến hành pha loãng mẫu cần đếm ở các nồng độ 10-7, 10-8, 10-9, 10-10.
- Dùng micropipette hút 5µl mỗi nồng độ cho vào các đĩa môi trường thạch chứa collagen (lặp lại 3 lần/mẫu). Ủ ở nhiệt độ 35oC trong 48 giờ.
- Đếm mật số vi khuẩn thông qua số khuẩn lạc bằng phương pháp đếm trực tiếp trên đĩa petri.
- Công thức tính số lượng tế bào vi khuẩn bằng trong một đơn vị thể tích:
Số tế bào/ml = A x B x 200 (CFU/ml)
Trong đó:
A: Số khuẩn lạc đếm được trung bình của 3 giọt (số khuẩn lạc/5µl). B: Mức độ pha loãng.
200: Hệ số chuyển từ 5µl đến 1ml.
Lưu ý: Thực hiện tương tự với cơ chất là gelatin để tìm ra những dòng vi khuẩn
có khả năng sinh tổng hợp enzyme gelatinase, qua đó đánh giá chính xác hơn về khả năng sinh tổng hợp enzyme của các dòng vi khuẩn phân lập.