phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa trùn quế (perionyx excavatus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG ĐẠM TỪ HỆ TIÊU HÓA TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS BÙI THỊ MINH DIỆU SINH VIÊN THỰC HIỆN HUỲNH NHƯ Ý MSSV: 3102798 LỚP: CNSH K36TT Cần Thơ, Tháng 5/2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG ĐẠM TỪ HỆ TIÊU HÓA TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts BÙI THỊ MINH DIỆU Cần Thơ, Tháng 5/2015 SINH VIÊN THỰC HIỆN HUỲNH NHƯ Ý MSSV: 3102798 LỚP: CNSH K36TT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Huỳnh Như Ý Ts Bùi Thị Minh Diệu DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2015 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp LỜI CẢM TẠ -* Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô, đặc biệt thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học giảng dạy kiến thức cho em suốt trình học tập Xin chân thành cảm ơn Cô Bùi Thị Minh Diệu cán hướng dẫn đề tài em Trong suốt trình học tập thực luận văn, cô giúp đỡ, truyền thụ kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn Cô Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập, người quan tâm, chia sẻ, giúp đỡ động viên em suốt trình học tập nghiên cứu Cảm ơn bạn Nguyễn Trung Duẩn, Nguyễn Ngọc Thanh, tập thể lớp Công nghệ sinh học tiên tiến khóa 36 Cảm ơn cán quản lý phòng thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đề tài anh chị nhiệt tình chia sẻ kiến thức kinh nghiệm cho em hoàn thành tốt đề tài Ngoài ra, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè người thân giúp đỡ em vật chất lẫn tinh thần suốt trình học tập, nghiên cứu thực luận văn tốt nghiệp Kính chúc quý thầy cô, anh chị tất bạn sinh viên dồi sức khỏe thành công công việc Cần thơ, ngày 19 tháng năm 2015 Huỳnh Như Ý TÓM LƯỢC Vấn đề ô nhiễm môi trường, đặc biệt ô nhiễm nguồn nước mối đe dọa sống sức khỏe người Một nguyên nhân gây vấn nạn lượng đạm cao từ chất thải chăn nuôi Đã có nhiều nghiên cứu tiến hành nhằm tìm phương án tốt để xử lý ô nhiễm môi trường nước Trùn quế (Perionyx excavatus) loài sinh vật đất có nguồn thức ăn chất thải giàu đạm biết đến với nhiều lợi ích nông nghiệp xử lý môi trường Do đó, đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa trùn quế (Perionyx excavatus)” tiến hành nhằm phân lập dòng vi khuẩn có khả sử dụng đạm hệ tiêu hóa trùn quế để đưa vào ứng dụng xử lý ô nhiễm môi trường Từ ba mẫu trùn quế thu thập địa điểm nguồn chất khác (phân bò rác thải hữu cơ), sau trình nuôi cấy phân lập 31 dòng vi khuẩn có khả sử dụng đạm Căn vào phát triển 31 dòng vi khuẩn môi trường dinh dưỡng tối thiểu bổ sung ammonium nitrate nitrite dạng hợp chất với nồng độ tăng dần tuyển chọn hai dòng vi khuẩn R575 V411 Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh hóa hai dòng vi khuẩn R575 V411 nhận định hai dòng thuộc chi Bacillus theo khóa phân loại Bergey Kết hợp với kết so sánh đoạn gen 16S RNA hai dòng R575 V411 với liệu ngân hàng gen NCBI thông qua phần mềm BLAST kết luận hai dòng vi khuẩn Bacillus firmus Từ khóa: ammonium, nitrate, nitrite, Perionyx excavatus, trình tự DNA, trùn quế Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG CẢM TẠ TÓM LƯỢC i MỤC LỤC .ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v CÁC TỪ VIẾT TẮT .vi CHƯƠNG 1.GIỚI THIỆU iv 1.1 Đặt vấn đề - 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan trùn quế 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Đặc tính sinh học trùn quế 2.1.3 Đặc tính sinh lý trùn quế 2.1.4 Sự sinh sản phát triển 2.1.5 Lợi ích trùn quế 2.2 Chu trình nitơ 2.2.1 Quá trình cố định đạm 2.2.2 Quá trình nitrate hóa Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ 2.2.3 Quá trình phản nitrate hóa 2.2.4 Vi khuẩn khử đạm 2.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử 12 2.3.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 12 2.3.2 Kỹ thuật điện di DNA 14 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn có khả sử dụng đạm 15 2.4.1 Trên giới 14 2.4.2 Trong nước 15 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Phương tiện 16 3.1.1 Thời gian địa điểm 17 3.1.2 Nguyên vật liệu 17 3.1.3 Phương tiện nghiên cứu 17 3.1.4 Hóa chất, môi trường 18 3.2 Phương pháp 20 3.2.1 Phân lập vi khuẩn có khả sử dụng đạm từ trùn quế 20 3.2.2 Khảo sát sơ tuyển dòng vi khuẩn có khả sử dụng ammonium, nitrate nitrite 22 3.2.3 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả sử dụng ammonium, nitrate nitrite 22 3.2.4 Khảo sát đặc tính hình thái, sinh hóa dòng vi khuẩn có khả sử dụng ammonium, nitrate nitrite 23 3.2.5 Nhận diện dòng vi khuẩn có khả sử dụng ammonium, nitrate nitrite 25 Chuyên ngành Công nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết phân lập vi khuẩn có khả sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa trùn quế 30 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn có khả sử dụng đạm 30 4.1.2 Đặc điểm dòng vi khuẩn phân lập 30 4.2 Kết kiểm tra khả sử dụng ammonium, nitrate nitrite dòng vi khuẩn phân lập 33 4.3 Khảo sát đặc tính hình thái, sinh hóa dòng vi khuẩn phân lập 38 4.4 Nhận diện dòng vi khuẩn có khả sử dụng ammonium, nitrate nitrite 41 4.4.1 Dựa vào khóa phân loại Bergey 41 4.4.2 Nhận diện kỹ thuật sinh học phân tử 41 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 52 Phụ lục Kết 52 Phụ lục Hình ảnh thiết bị 60 Chuyên ngành Công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1 Thành phần hóa chất pha chế môi trường dinh dưỡng tối thiểu 18 Bảng 3.2 Thành phần môi trường bổ sung ammonium, nitrate nitrite 19 Bảng 3.3 Thành phần hóa chất phản ứng PCR 27 Bảng 4.1 Tổng hợp kết phân lập dòng vi khuẩn có khả sử dụng đạm 30 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái 31 dòng vi khuẩn phân lập 31 Bảng 4.3 Khả phát triển dòng vi khuẩn môi trường dinh dưỡng tối thiểu bổ sung NH4+, NO3-, NO2 10mM 33 Bảng 4.4 Khả phát triển dòng vi khuẩn môi trường dinh dưỡng tối thiểu bổ sung NH4+, NO3-, NO2- 1000mM 36 Bảng 4.5 Tổng kết kết khảo sát phát triển vi khuẩn môi trường dinh dưỡng tối thiểu bổ sung NH4+, NO3-, NO2- nồng độ 10mM đến 1000mM 37 Bảng 4.6 Kích thước dòng số dòng vi khuẩn phân lập 38 Bảng 4.7 Kết khảo sát phản ứng catalase dòng vi khuẩn 39 Bảng 4.8 Khả sinh enzyme oxydase dòng vi khuẩn phân lập 40 Chuyên ngành Công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1 Trùn quế (Perionyx excavatus) Hình 2.2 Lợi ích trùn quế Hình 2.3 Chu trình nitơ Hình 2.4 Vi khuẩn Pseudomonas 10 Hình 2.5 Vi khuẩn Bacillus firmus 12 Hình 3.1 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 28 Hình 4.1 Các dạng khuẩn lạc vi khuẩn lạc vi khuẩn phân lập 33 Hình 4.2 Biểu đồ kết khảo sát phát triển vi khuẩn môi trường dinh dưỡng tối thiểu bổ sung NH4+, NO3-, NO2- với nồng độ tăng dần 38 Hình 4.3 Kết nhuộm Gram 39 Hình 4.4 Kết so sánh trình tự DNA dòng R575 với ngân hàng gen NCBI phần mềm BLAST 42 Hình 4.5 Kết so sánh trình tự DNA dòng V411 với ngân hàng gen NCBI phần mềm BLAST 43 Hình phụ lục Một số thiết bị sử dụng thí nghiệm 60 Chuyên ngành Công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cao Ngọc Điệp 2010 Vi khuẩn nội sinh thực vật NXB Đại học Cần Thơ Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp 2008 Giáo trình thực tập vi sinh vật đại cương Trường Đại học Cần Thơ Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Thành Nhân Lê Quang Khôi 2010 Phân lập vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri chất thải trại chăn nuôi heo ứng dựng xử lý nitrogen nước thải Tạp chí Công nghệ Sinh học Đại học Cần Thơ, 8(4): 18771884 Huỳnh Thị Cẩm Tú 2009 Phân lập vi khuẩn khử đạm ao nuôi tôm sú Bạc Liêu Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Ngô Mỹ Ngân 2010 Phân lập vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa trại chăn nuôi bò sữa Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến Phạm Văn Ty 1976 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật NXB Khoa hoc kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Tỵ 1997 Vi sinh vật học Nhà Xuất Bản Giáo Dục Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu 2005 Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp ứng dụng NXB Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thành Nhân 2008 Phân lập nhận diện số dòng vi khuẩn khử đạm từ chất thải trại chăn nuôi Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 46 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ Phan Trường Khanh 2007 Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri đất đồng sông Cửu Long ứng dụng xử lý nước ammonium nước điều kiện phòng thí nghiệm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Phùng Ngọc Bích 2009 Phân lập vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri từ ao nuôi cá tra Cần Thơ, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Tô Thị Lài 2008 Xử lý ammonium nước ao cá tra vi khuẩn Pseudomonas stutzeri qui mô phòng thí nghiệm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Trần Linh Thước, 2003 Phương pháp phân tích vi sinh vật NXB Giáo dục Chương IV V Tiếng Anh Arellano, R.P., I Barois and E Arand 1995 Earthworm carrying capacity for coffee pulp using Eisenia andrei and Perionyx excavatus Soil Biol Biochem Aslim, B., N Saglam and Y Beyatli 2002 Determination of some properties of bacillus isolated from soil Turkish Journal of Biology, 26: 41 – 48 Bashan, Y., G Holguin and L.Ê de-Bashan 2004 Azospirillum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and enviromental advances (1997 - 2003) I 50: 521 – 577 Bennasar, A., R Rosselló - Mora, J Lalucat and E.R.B Moore 1996 16S rRNA gene sequence analysis relative to genomovars of Pseudomonas stutzeri and proposal of Pseudomonas balearica sp nov International Journal of Systematic Bacteriology, 46: 200–205 Bitton G 2005 Wastewater Microbiology, 3nd edition John Wiley and Sons, Inc, New Jersey, pp 643 – 656 Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 47 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ Boddey, R M and J Dobereiner 1984 Nitrogen fixation associated with grasses and cereal In: Current development in biological nitrogen fixation (NS Subba Rao, ed) Oxford and IBH Publication, pp: 277 Braker G., A Fesefeldt and KP Witzel 1998 Development of PCR primer systems for amplification of nitrite reductase genes (nirK and nirS) to detect denitrifying bacteria in environmental samples Appl Environ Microbiol, 1998; 64: 3769–3775 Brandon, M G., C Lazcano, M Lores and J Dominguez 2010 Detritivorous earthworms modify microbial community structure and accelerate plant residue decomposition Applied Soil Ecology, 44: 237–244 Darwin F., and C Seward 1903 More letter of Charler Darwin, London, pp 508 Doxbereiner, J and F P Pedrosa 1987 Nitrogen-fixation Bacteria in Nonleguminous Crop Plants Springer – Verlag, Berlin Drake, H L and M A Horn 2007 As the Worm Turns: The Earthworm Gut as a Transient Habitat for Soil Microbial Biomes Annual Review of Microbiology, 61:169-189 Edwards, C A and P J Bohlen 1996 Biology and ecology of earthworms Chapman and Hall, London, U.K., 426 pp Evans, H J and L E Barber 1977 Biological Nitrogen Fixation for Food and Fiber Production Science 197: 332-339 Farabee 2012 HJ "Excretory System" Retrieved Heylen, K., B Vanpray., L Wittebolle, W Verstraete, N Boon and P de Vo 2006 "Cultivation of denitrifying bacteria: optimization of isolation conditions and diversity study", Appl Environ Microbiol, vol 72, p.2637-2643 Holt, J G., N R Krieg, P H A Sneath, J T Staley and S T Williams 1994 Bergey's manual of determinative bacteriology 9th edition Baltimore (MD): Williams & Wilkins Micrococcus, pp.559 Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 48 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ Killham, K and J I Prosser 2007 The Prokaryotes In: Paul EA (ed) Soil Microbiology, Ecology and Biochemistry 3rd edition Academic Press: Canada, pp 119–143 Lavelle, P., D Bignell, M Lepage, V Wolters, P Roger, P Ineson, O W Heal and S Dhillion 1997 Soil function in a changing world: The role of invertebrate ecosystem engineers European J Soil Boil, 33:151-193 Lee, H W., S Y Lee, J W Lee, J B Park, E S Choi and Y K Park 2002 Molecular characterization of microbial community in nitrate-removing activated sludge FEMS Microb Ecol, 41, pp 85 - 94 Lin, J T and V Stewart 1998 Nitrate assimilation by bacteria Adv Microb Physiol, 1998;39:1-30, 379 Moreno-Vivian, C., P Cabello, M Martinez-Luque, R Blasco and F Castillo 1999 Prokaryotic nitrate reduction: molecular properties and functional distinction among bacterial nitrate reductases Journal J Bacteriol, 181 (21): 6573-6584 Mulder A 1989 “Anoxic Ammonia Oxidation" International Application Published under the paten Cooperation Treaty (PCT) PCT/NL89/00004 Neumann, B., A Pospiech and H.U Schairrer, 1992 Rapid isolation of genomic DNA from Gram-negative bacteria Trends Gent, 8: 332-333 Purkhold U., M Wagner., G Timmermann., A Pommerening-Röser and H-P Koops HP 2003 16S rRNA and amoA-based phylogeny of 12 novel betaproteobacterial ammonia-oxidizing isolates: extension of the dataset and proposal of a new lineage within the nitrosomonads Int J Syst Evol Microbiol, 53: 1485–1494 Rivett, M O., S R Buss, P Morgan, J W N Smith and C D Bemment 2008 Nitrate attenuation in groundwater: a review of biogeochemical controlling processes Water Res, 42: 4215–4232 Robertson, L A and J G Kuenen 1990 Combined heterotrophic nitrification and aerobic denitrification in Thiosphaera pantotropha and other bacteria, Antonie Leeuwenhoek, 57: 139 - 152 Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 49 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ Schramm, A., S K Davidson, J A Dodsworth, H L Drake, D A Stahl and N Dubilier 2003 "Acidovorax-like symbionts in the nephridia of earthworms." Environmental Microbiology, 5: 804-809 Sikorski, J., R Rossello-Mora and M G Lorenz 1999 Analysis of genotypic diversity and relationships among Pseudomonas stutzeri strains by PCR-based genomic fingerprinting and multilocus enzyme electrophoresis Syst Appl Microbiol, 22: 393-402 Sikorski, J., M Moehle and W Wackernagel 2002 Identification of complex composition, strong strain diversity and directional selection in local Pseudomonas stutzeri populations from marine sediment and soils Appl Environ Microbiol, 68 (2), pp 865-873 Thakuria, D., O Schmidt, D Finan, D Egan and F M Doohan 2009 Gut wall bacteria of earthworms: a natural selection process The ISME Journal, 4: 357-366 Urata, K and T, Satoh 1991 Enzyme localization and orientation of the active site of dissimilatory nitrite reductase from Bacillus firmus Arch.Microbiol, 156: 24–27 Verbaendert, I., D Paul., B Nico and H Kim 2011 Denitrification in Gram-positive bacteria: an underexplored trait Biochem Soc Trans, 39(1): 254-258 Zumft, W G 1997 Cell biology and molecular basis of denitrification Microbiol Mol Biol Rev, 61: 533-616 Trang Web: http://www.ctu.edu.vn/colleges/agri/gtrinh/ (ngày 20/5/2014) http://www.dpi.nsw.gov.au/agriculture/resources/soils/biology/earthworms (ngày 22/5/2014) http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/nitrogen.htm (ngày 16/7/2014) http://www.nature.com/ismej/journal/v4/n3/full/ismej2009124a.html (ngày 16/7/2014) http://ijsb.sgmjournals.org/content/53/5/1485.full (ngày 16/7/2014) Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 50 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3229-oxydase-test-protocol (ngày 12/8/2014) http://digital.lrc.ctu.edu.vn/digital/?s=19# (ngày 20/11/2014) http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_157057246 (ngày 22/4/2015) http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_157057243 (ngày 22/4/2015) Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 51 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC Phụ lục Kết Bảng Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập STT Vi khuẩn Cơ chất Nguồn gốc B19 Phân bò Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử B83 Phân bò Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử B85 Phân bò Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử B112 Phân bò Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử B163 Phân bò Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử B222 Phân bò Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử B226 Phân bò Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử B414 Phân bò Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử B541 Phân bò Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử 10 B552 Phân bò Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử 11 B852 Phân bò Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử 12 R12 Rác thải hữu Hộ 158/59, đường Nguyễn Việt Hồng, An Phú, Ninh Kiều – Cần Thơ 13 R41 Rác thải hữu Hộ 158/59, đường Nguyễn Việt Hồng, An Phú, Ninh Kiều – Cần Thơ 14 R83 Rác thải hữu Hộ 158/59, đường Nguyễn Việt Hồng, An Phú, Ninh Kiều – Cần Thơ 15 R92 Rác thải hữu Hộ 158/59, đường Nguyễn Việt Hồng, An Phú, Ninh Kiều – Cần Thơ 16 R226 Rác thải hữu Hộ 158/59, đường Nguyễn Việt Hồng, An Phú, Ninh Kiều – Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 52 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ Hộ 158/59, đường Nguyễn Việt Hồng, An Phú, 17 R332 Rác thải hữu 18 R376 Rác thải hữu Hộ 158/59, đường Nguyễn Việt Hồng, An Phú, Ninh Kiều – Cần Thơ 19 R511 Rác thải hữu Hộ 158/59, đường Nguyễn Việt Hồng, An Phú, Ninh Kiều – Cần Thơ 20 R543 Rác thải hữu Hộ 158/59, đường Nguyễn Việt Hồng, An Phú, Ninh Kiều – Cần Thơ 21 R575 Rác thải hữu Hộ 158/59, đường Nguyễn Việt Hồng, An Phú, Ninh Kiều – Cần Thơ 22 V26 Phân bò Khu Hòa An – Đại học Cần Thơ 23 V28 Phân bò Khu Hòa An – Đại học Cần Thơ 24 V84 Phân bò Khu Hòa An – Đại học Cần Thơ 25 V226 Phân bò Khu Hòa An – Đại học Cần Thơ 26 V358 Phân bò Khu Hòa An – Đại học Cần Thơ 27 V411 Phân bò Khu Hòa An – Đại học Cần Thơ 28 V412 Phân bò Khu Hòa An – Đại học Cần Thơ 29 V446 Phân bò Khu Hòa An – Đại học Cần Thơ 30 V724 Phân bò Khu Hòa An – Đại học Cần Thơ 31 V853 Phân bò Khu Hòa An – Đại học Cần Thơ Ninh Kiều – Cần Thơ Bảng Tỷ lệ hình dạng dòng vi khuẩn phân lập Hình dạng Số lượng Tỷ lệ (%) Hình que 25 80,65 Hình cầu 19,35 Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 53 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ Bảng Khả phát triển dòng vi khuẩn phân lập môi trường dinh dưỡng tối thiểu bổ sung NH4+, NO3-, NO2- 100mM Môi trường NH4+ NO3- NO2- STT Vi khuẩn Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày B83 +++ +++ ++ ++ - - B85 +++ +++ ++ ++ ++ ++ B112 ++ ++ + + B163 ++ +++ ++ +++ - - B222 + + + + B226 ++ ++ ++ ++ - - B414 +++ +++ +++ +++ +++ +++ B541 +++ +++ +++ +++ +++ +++ B852 ++ +++ ++ ++ 10 R12 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 11 R41 +++ +++ +++ +++ ++ ++ 12 R83 +++ +++ ++ ++ 13 R92 +++ +++ + + - - 14 R226 +++ ++ ++ ++ ++ ++ 15 R543 +++ ++ ++ ++ - - 16 R575 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 17 V26 +++ +++ +++ +++ + + 18 V28 + + + + + + Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 54 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ 19 V84 +++ +++ ++ ++ 20 V226 ++ ++ + + - - 21 V358 +++ +++ +++ +++ - - 22 V411 +++ +++ +++ +++ ++ ++ 23 V412 +++ +++ +++ +++ ++ ++ 24 V446 +++ +++ +++ +++ - - 25 V724 +++ +++ +++ +++ - - 26 V853 +++ +++ +++ +++ - - ( ): không khảo sát; (-): không phát triển; (+): phát triển; (++): phát triển mạnh, (+++): phát triển mạnh Bảng Khả phát triển dòng vi khuẩn phân lập môi trường dinh dưỡng tối thiểu bổ sung NH4+, NO3-, NO2- 200mM Môi trường NH4+ NO3- NO2- STT Vi khuẩn Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày B83 +++ +++ ++ ++ B85 +++ +++ ++ ++ ++ ++ B112 + + + + B163 ++ +++ ++ +++ B226 ++ ++ ++ ++ B414 +++ +++ +++ +++ +++ +++ B541 +++ +++ +++ +++ ++ ++ B852 ++ +++ ++ ++ R12 +++ +++ +++ +++ +++ +++ Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 55 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ 10 R41 +++ +++ +++ +++ ++ ++ 11 R83 +++ +++ ++ ++ 12 R92 +++ +++ + + 13 R226 + + + + 14 R543 +++ ++ ++ ++ 15 R575 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 16 V26 +++ +++ +++ +++ + + 17 V84 + + + + 18 V226 + + + + 19 V358 +++ +++ ++ +++ 20 V411 +++ +++ +++ +++ ++ ++ 21 V412 +++ +++ +++ +++ ++ ++ 22 V446 +++ +++ +++ +++ 23 V724 +++ +++ +++ +++ 24 V853 +++ +++ ++ +++ ( ): không khảo sát; (-): không phát triển; (+): phát triển; (++): phát triển mạnh, (+++): phát triển mạnh Bảng Khả phát triển dòng vi khuẩn phân lập môi trường dinh dưỡng tối thiểu bổ sung NH4+, NO3-, NO2- 400mM Môi trường NH4+ NO3- NO2- STT Vi khuẩn Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày B83 +++ +++ ++ ++ Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 56 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ B85 +++ +++ ++ ++ - - B163 + + ++ ++ B226 ++ ++ ++ ++ B414 ++ ++ - - - - B541 + + ++ ++ - - B852 ++ +++ ++ ++ R12 ++ ++ ++ +++ - - R41 +++ +++ +++ +++ + + 10 R83 +++ +++ ++ ++ 11 R92 +++ +++ + + 12 R226 ++ ++ + + 13 R543 ++ ++ - - 14 R575 +++ +++ +++ +++ ++ ++ 15 V26 ++ ++ + + - - 16 V358 +++ +++ ++ +++ 17 V411 +++ +++ +++ +++ - - 18 V412 ++ ++ + + - - 19 V446 +++ +++ +++ +++ 20 V724 ++ +++ +++ +++ 21 V853 +++ +++ ++ ++ ( ): không khảo sát; (-): không phát triển; (+): phát triển; (++): phát triển mạnh, (+++): phát triển mạnh Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 57 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ Bảng Khả phát triển dòng vi khuẩn phân lập môi trường dinh dưỡng tối thiểu bổ sung NH4+, NO3-, NO2- 600mM Môi trường NH4+ NO3- STT Vi khuẩn Ngày Ngày Ngày Ngày B83 +++ +++ ++ ++ B85 +++ +++ ++ ++ B226 ++ ++ ++ ++ B852 ++ +++ - - R12 +++ +++ +++ +++ R41 +++ +++ +++ +++ R83 +++ +++ ++ ++ R92 +++ +++ - - R226 + + + + 10 R575 +++ +++ +++ +++ 11 V358 + + - - 12 V411 +++ +++ ++ ++ 13 V446 ++ ++ - - 14 V724 ++ +++ - - 15 V853 +++ +++ - - Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 58 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ Bảng Khả phát triển dòng vi khuẩn phân lập môi trường dinh dưỡng tối thiểu bổ sung NH4+, NO3-, NO2- 800mM Môi trường NH4+ NO3- STT Vi khuẩn Ngày Ngày Ngày Ngày B83 +++ +++ ++ ++ B85 +++ +++ ++ ++ B226 ++ ++ ++ ++ B852 ++ +++ - - R12 +++ +++ +++ +++ R41 +++ +++ ++ ++ R83 +++ +++ ++ ++ R92 +++ +++ - - R226 + + + + 10 R575 +++ +++ +++ +++ 11 V358 + + - - 12 V411 +++ +++ ++ ++ 13 V446 ++ ++ - - 14 V724 ++ +++ - - 15 V853 +++ +++ - - (-): không phát triển; (+): phát triển; (++): phát triển mạnh, (+++): phát triển mạnh Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 59 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ Phụ lục Hình ảnh thiết bị Kính hiển vi Tủ ủ Cân phân tích Máy lắc Máy đo pH Nồi khử trùng Hình Một số thiết bị sử dụng thí nghiệm Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 60 - Viện NC&PT Công nghệ sinh học [...]... nghiên cứu Phân lập và khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa trùn quế Đánh giá khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite của các dòng vi khuẩn phân lập được để tuyển chọn hai dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng các loại đạm tốt nhất với nồng độ tăng dần Nhận diện hai dòng vi khuẩn tuyển chọn được dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA và các đặc... sinh vật có khả năng sử dụng đạm trong hệ tiêu hóa của trùn quế để đưa vào ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa của trùn quế tạo tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng xử lý ô nhiễm môi trường Chuyên ngành Công nghệ sinh học -1- Vi n NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường... trình khử đạm được xem là then chốt trong chu trình nitơ Quá trình này được ứng dụng để loại trừ ammonium và nitrate một cách hiệu quả thông qua sự phối hợp hoạt động của hai nhóm vi sinh vật, vi khuẩn nitrate hóa và vi khuẩn khử nitrate (Lee et al., 2002) Đề tài Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa trùn quế (Perionyx excavatus) được tiến hành nhằm tìm ra những vi sinh... các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite a So sánh các đặc điểm hình thái và sinh hóa của các dòng vi khuẩn tuyển chọn được với khóa phân loại Bergey Dựa vào sự giống nhau giữa các đặc điểm về hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn tuyển chọn được với mô tả trong khóa phân loại của Bergey để đưa ra kết luận sơ bộ về vị trí phân loại của các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn Chuyên... môi trường 3.2.2 Khảo sát và sơ tuyển các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite - Từ các dòng vi khuẩn ròng, tiến hành nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng tối thiểu có chứa ammonium hoặc nitrate hoặc nitrite ở dạng hợp chất (NH4Cl, NaNO3, KNO2) - Sau 24 – 48 giờ nuôi cấy, dựa vào khả năng phát triển để đánh giá khả năng sử dụng đạm của từng dòng: + Chủng vi khuẩn nào không phát... vi c giải mã gen quyết định đến khả năng khử đạm nhằm nói lên tầm quan trọng của các vi khuẩn Gram dương trong hệ sinh thái 2.4.2 Trong nước Hiện nay tại Vi n nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ cũng đã có nhiều nghiên cứu về khả năng sử dụng đạm của vi khuẩn, đặc biệt là khả năng khử đạm Phan Trường Khanh (2007) đã thực hiện phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong... - Các chủng phân lập, sau khi đã tuyển chọn được trữ lại 3.2.3 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite - Khảo sát khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng tối thiểu có bổ sung NH4Cl, NaNO3, KNO2 (nồng độ 10 mM) Tiếp tục kiểm tra khả năng phát triển của chúng với các nồng độ tăng dần (100 mM, 200mM, 400 mM, 600 mM, 800 mM và 1000 mM)... đích Phân lập được các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite dựa trên môi trường chuyên biệt Chuyên ngành Công nghệ sinh học - 20 - Vi n NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ a Chuẩn bị và xử lý mẫu - Ba mẫu trùn quế được thu từ 2 nguồn cơ chất nuôi khác nhau: phân bò (thu từ khu Hòa An và phòng thí nghiệm Sinh học phân tử ) và rác... ngoài mỏng cơ trơn và một lớp bên trong dày hơn là cơ dọc (Edwards và Bohlen, 1996) Trùn quế có một đường tiêu hóa chạy thẳng từ miệng đến hậu môn Chuyên ngành Công nghệ sinh học -3- Vi n NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ Trùn quế hô hấp qua da và mao mạch, chúng hấp thu O2 và thải CO2 trong môi trường nước, điều này giúp trùn quế có khả năng sống trong... sinh trưởng (đồng hóa nitrate), chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyển hóa năng lượng (hô hấp nitrate) và tiêu hao điện tích nhằm cân bằng phản ứng oxy hóa khử (dị hóa nitrate) Trong khi đó, trùn quế là một loài sinh vật đất có khả năng chuyển hóa nitrate thành khí nitrogen tự do với hiệu quả cao và chi phí thấp nhờ vào các vi sinh vật khử đạm trong hệ tiêu hóa của chúng (Drake và Horn, 2007) ... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết phân lập vi khuẩn có khả sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa trùn quế 30 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn có khả sử dụng đạm 30 4.1.2 Đặc điểm dòng vi khuẩn phân. .. khuẩn có khả sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa trùn quế (Perionyx excavatus) tiến hành nhằm tìm vi sinh vật có khả sử dụng đạm hệ tiêu hóa trùn quế để đưa vào ứng dụng xử lý ô nhiễm môi trường 1.2 Mục tiêu. .. trùn quế 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn sử dụng đạm Ba mươi mốt dòng vi khuẩn có khả sử dụng đạm phân lập từ mẫu trùn quế nuôi từ nguồn chất: phân bò (thu từ khu Hòa An phòng thí nghiệm Sinh học phân