Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô (zea mays l) trồng trên đất xám tỉnh tây ninh

i MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC BẢNG .ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv TÓM TẮT BẰNG TIẾNG ANH v MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Đối tượng phạm vi nghiên cứu Thời gian nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây ngô tình hình sản xuất ngô tỉnh Tây Ninh 1.1.1 Cây ngô 1.1.2 Tình hình sản xuất ngô tỉnh Tây Ninh 1.2 Vi khuẩn vùng rễ vai trò tăng trưởng thực vật 1.2.1 Vùng rễ vi khuẩn vùng rễ 1.2.2 Vai trò vi khuẩn vùng rễ tăng trưởng thực vật 1.2.3 Các chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật vi khuẩn vùng rễ 10 1.2.3.1 Cố định đạm 10 1.2.3.2 Hòa tan lân khoáng dinh dưỡng 12 1.2.3.3 Các chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật khác 14 1.3 Định danh vi khuẩn vùng rễ vi khuẩn nội sinh thực vật thông qua phương pháp Sinh học phân tử 15 Chương II PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Phương tiện nghiên cứu 17 2.1.1 Vật liệu, hóa chất 17 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 18 2.2 Phương pháp nghiên 18 2.2.1 Thu thập xử lý mẫu đất vùng rễ ngô 18 2.2.1.1 Thu thập 18 2.2.1.2 Xử lý mẫu 19 2.2.2 Phân tích số tiêu dinh dưỡng đất vùng rễ ngô 19 2.2.2.1 Xác định pHH2O 19 2.2.2.2 Xác định N tổng số theo phương pháp Kjendahl 20 2.2.2.3 Xác định P dễ tiêu theo phương pháp Oniani 22 2.2.2.4 Xác định hàm lượng chất hữu tổng theo phương pháp Walkley-Black 24 2.2.3 Đếm mật số vi khuẩn cố định đạm vi khuẩn hòa tan lân đất vùng rễ ngô 26 2.2.4 Phân lập làm vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân khó tan từ đất vùng rễ ngô 28 2.2.5 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc số đặc điểm tế bào dòng vi khuẩn thu 31 2.2.5.1 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc 31 2.2.5.2 Mô tả số đặc điểm tế bào 31 2.2.6 Bảo quản dòng vi khuẩn thu 32 2.2.7 Xác định khả cố định đạm, hòa tan lân khó tan dòng thu 33 2.2.7.1 Chuẩn bị dịch vi khuẩn cho thí nghiệm định lượng 33 2.2.7.2 Xác định khả cố định đạm đo lượng ammonium hình thành 34 2.2.7.3 Xác định khả hòa tan lân đo lượng phosphate hòa tan 35 2.2.7.4 Xử lý số liệu thí nghiệm định lượng thông qua đo OD 36 2.2.8 Định danh số dòng vi khuẩn có đặc tính tốt phương pháp Sinh học phân tử 36 2.2.8.1 Tách chiết DNA 36 2.2.8.2 Khuếch đại gene 16S rRNA phương pháp PCR 37 2.2.8.3 Chuẩn bị gel agarose điện di sản phẩm PCR 38 2.2.8.4 Giải trình tự lập phả hệ dòng vi khuẩn tuyển chọn 39 Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Một số tiêu lý hóa đất vùng rễ ngô 40 3.2 Mật số vi khuẩn cố định đạm/ hòa tan lân đất vùng rễ ngô 41 3.3 Mối quan hệ đặc tính dinh dưỡng đất với mật số vi khuẩn đất vùng rễ ngô 43 3.4 Hình thái khuẩn lạc tế bào dòng vi khuẩn đất vùng rễ ngô 47 3.5 Khả cố định đạm, hòa tan lân dòng vi khuẩn đất vùng rễ ngô 55 3.5.1 Khả cố định đạm dòng vi khuẩn đất vùng rễ ngô 57 3.5.2 Khả hòa tan lân dòng vi khuẩn đất vùng rễ ngô 61 3.6 Mối quan hệ phát sinh chủng loại dòng vi khuẩn đất vùng rễ ngô tuyển chọn dựa trình tự gene 16S rRNA 65 Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 72 i TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 ii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Bảng 1.1 Diện tích gieo trồng, suất sản lượng ngô tỉnh thành vùng Đông Nam Bộ, năm 2010 Trang Bảng 2.1: Thành phần loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn 28 Bảng 2.2: Thành phần hóa chất nhuộm Gram 31 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR 37 Bảng 2.4: Thành phần dung dịch TAE 50X 38 Bảng 2.5: Thành phần dung dịch loading buffer 38 Bảng 3.1: Nguồn gốc 10 mẫu đất vùng rễ ngô trồng đất xám Tây Ninh Bảng 3.2: Đặc tính dinh dưỡng đất vùng rễ ngô trồng đất xám tỉnh Tây Ninh Bảng 3.3: Mật số vi khuẩn cố định đạm vi khuẩn hòa tan lân có đất vùng rễ ngô trồng đất xám tỉnh Tây Ninh 40 40 42 Bảng 3.4: Mối quan hệ mật số vi khuẩn cố định đạm hòa tan 10 phosphate đất vùng rễ ngô trồng đất xám tỉnh Tây Ninh 44 với pH, N tổng số, P dễ tiêu hàm lượng chất hữu đất 11 Bảng 3.5: Số dòng vi khuẩn phân lập từ mẫu đất vùng rễ ngô trồng đất xám tỉnh Tây Ninh 47 12 Bảng 3.6: Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập 48 13 Bảng 3.7: Đặc điểm tế bào dòng vi khuẩn phân lập 51 14 Bảng 3.8: Nguồn gốc khả phát triển môi trường Burk môi trường NBRIP 79 dòng vi khuẩn phân lập 55 15 Bảng 3.9: Lượng ammonia sinh dòng vi khuẩn thu 57 16 Bảng 3.10: Lượng lân hòa tan dòng vi khuẩn thu 61 Bảng 3.11: Nồng độ ammonium (NH4+), lân hữu dụng (P2O5) 15 17 dòng vi khuẩn vùng rễ ngô trồng đất đất xám tỉnh Tây 65 Ninh 18 Bảng 3.12: Tóm tắt nguồn gốc mức độ đồng hình 13 dòng tuyển chọn với chủng tương đồng có NCBI 68 iii DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1: Bản đồ hành tỉnh Tây Ninh Hình 1.2: Vỏ rễ hình thành quanh rễ Lyginia barbata Hình 1.3: Các chế kích thích tăng trưởng thực vật PGPR Hình 2.1 Cách thu mẫu ngẫu nhiên 18 Hình 2.2 Sơ đồ pha loãng dịch đất tạo hộp “đếm sống nhỏ giọt” 27 Hình 3.1: Xác định mật số tế bào vi khuẩn hòa tan lân theo phương pháp “Đếm sống nhỏ giọt” môi NBRIP (TN6) 43 Hình 3.2: Đồ thị rải điểm phương trình hồi quy đơn mật số vi khuẩn cố định đạm hàm lượng lân dễ tiêu vùng rễ 45 ngô trồng đất xám tỉnh Tây Ninh Hình 3.3: Đồ thị rải điểm phương trình hồi quy đơn mật số vi khuẩn cố định đạm hàm lượng đạm tổng số vùng rễ 46 ngô trồng đất xám tỉnh Tây Ninh 10 11 12 13 14 15 16 17 Hình 3.4: Hình thái số khuẩn lạc thu Hình 3.5: Đặc điểm thường gặp hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn Hình 3.6: Kết nhuộm Gram số dòng thu Hình 3.7: Lượng đạm cố định qua đợt đo mẫu dòng hòa tan lân tốt Hình 3.8: Lượng đạm cố định qua đợt đo mẫu dòng TĐB30 Hình 3.9: Lượng đạm trung bình qua đợt đo mẫu 55 dòng vi khuẩn Hình 3.10: Lượng lân hòa tan qua đợt đo mẫu dòng hòa tan lân tốt Hình 3.11: Lượng lân hòa tan trung bình qua đợt đo mẫu 55 dòng vi khuẩn Hình 3.12: Điện di sản phẩm PCR 16S rDNA số dòng vi khuẩn vùng rễ ngô trồng đất xám tỉnh Tây Ninh 50 51 54 60 60 61 63 64 66 Hình 3.13: Cây phả hệ cho thấy vị trí tương đối PGPR 18 xây dựng dựa trình tự gene 16S rRNA phương pháp 67 neighbor-joining Hình 3.14: Cây phả hệ 13 dòng vi khuẩn đất vùng rễ ngô 19 xây dựng dựa trình tự gene 16S rRNA phương pháp neighbor-joining 69 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ANOVA: Analysis of Varience BLAST: Basic Local Alignment Search Tool BR-VT: Bà Rịa – Vũng Tàu CEC:Cation Exchange Capacity CFU: Colony-Forming Unit DAI:Day After Inoculation DNA: Deoxyribonucleic Acid DN: Đồng Nai FLPs: Flourescent Pseudomonads IAA: Indole-3-Acetic Acid ISR: Induction of Systemic Resistance NBRIP: National Botanical Research Institute's phosphate NCBI: National Center for Biotechnology Information nsd: not significantly different CR: Polymerase Chain Reaction PGPB: Plant Growth Promoting Bacteria PGPR:Plant Growth Promoting Rhizobacteria ppm: parts per million PPQ: Pyrroquinoline Quinine PSB: Phosphate Solubilising Bacteria PSM: Phosphate Solubilising Microorganisms rRNA: ribosomal Ribonucleic Acid rrs gene: ribosomal RNA gene SAR: Systemic Acquired Resistance SEM: Scanning Electron Microscope TN: Tây Ninh VK: Vi khuẩn VOCs: Volatile Organic Compounds v TÓM TẮT BẰ/NG TIẾNG ANH Rhizobacterial diversity and population dynamics in the Acrisol rhizosphere of maize grown in Tay Ninh province were studied Rhizosphere soil samples were taken from seven districts of this province Physical and chemical characteristics of soil samples were analysed Total nitrogen-fixing and phosphate-solubilizing bacteria counts were determined by drop plate counts method together with 16S rRNA gene fragments amplified from their DNA using eubacterial universal primers (8F and 1492R) A total of 79 isolates were isolated from two media (Burk’s N-free and NBRIP) and 55 of them have the ability of nitrogen fixation and phosphate solubilization The population of nitrogen-fixing and phosphate-solubilizing bacteria correlated with soil pH and organic matter content in soil closely (P[...]... cây ngô có khả năng cố định đạm và hòa tan lân - Tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân tốt nhất 4 Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây ngô và tình hình sản xuất ngô ở tỉnh Tây Ninh 1.1.1 Cây ngô Cây ngô (còn gọi là bắp) có tên khoa học là Zea mays L., do Linnaeus đặt vào năm 1737 Ngô là loài duy nhất của chi Zea Các giống ngô trồng hiện nay là các phân. .. lượng đủ lớn trong mỗi giọt, tính số khuẩn lạc trung bình Số khuẩn lạc trung bình/10 µl = tổng số khuẩn lạc trong một ô/5 Tính số vi khuẩn có trong 1 ml mẫu dịch vi khuẩn gốc: Số vi khuẩn/ 1 ml mẫu (CFU/ml) = số khuẩn lạc trung bình x 102 x độ pha loãng 2.2.4 Phân lập và làm thuần vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân khó tan từ đất vùng rễ ngô Công thức các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn Pha... chất hữu cơ là 1,724 2.2.3 Đếm mật số vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân trong đất vùng rễ ngô Đếm mật số tế bào có trong dịch đất thông qua phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Drop plate counts) (Hoben and Somasegaran, 1982) Pha loãng dịch đất và tạo hộp đếm - Đất vùng rễ ngô sau khi để khô ở nhiệt độ phòng, dùng cối sứ nghiền mịn - Cân 1 g mẫu đất cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất... 1986) Ngoài các vi khuẩn kể trên, một số loài thuộc các chi Herbaspirillum, Burkholderia, Enterobacter, Klebsiella, Bacillus và Pseudomonas được tìm thấy trong đất vùng rễ hoặc nội sinh thực vật cũng có khả năng cố định đạm, hòa tan lân tốt 1.2.3.2 Hòa tan lân và các khoáng dinh dưỡng Bên cạnh sự cố định đạm sinh học, hòa tan phosphate cũng không kém phần quan trọng trong vi c cải thiện độ... của vi khuẩn vùng rễ 1.2.3.1 Cố định đạm Sự cố định đạm sinh học đóng góp 180.106 tấn N/năm trên toàn cầu, trong đó có các hiệp hội cộng sinh giữa vi sinh vật và thực vật chịu trách nhiệm sản xuất khoảng 80% và phần còn lại đến từ các hệ thống vi sinh vật sống tự do hoặc kết hợp (Graham, 1988 trích dẫn của Saharan and Nehra, 2011) Có thể chia vi khuẩn cố định đạm thành 2 nhóm chính: các vi. .. 21,4 Tây Ninh 5,8 50,7 29,4 Bình Dương 0,6 20,0 1,2 Đồng Nai 47,7 59,2 282,4 Bà Rịa – Vũng tàu 19,6 43,5 85,2 TP Hồ Chí Minh 0,9 34,4 3,1 Đông Nam Bộ 81,3 52,0 422,7 7 1.2 Vi khuẩn vùng rễ và vai trò đối với sự tăng trưởng của thực vật 1.2.1 Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ Vùng rễ hay hệ rễ (rhizosphere) được biết đến như là một lớp đất mỏng bao quanh rễ cây Đó là một khu vực cực kỳ quan trọng và. .. mẫu ngô tại các vùng chuyên canh ngô trên đất xám của tỉnh Tây Ninh, gồm các huyện Trảng Bàng, Gò Dầu, Dương Minh Châu, Thị xã Tây Ninh, Tân Biên, Châu Thành, Tân Châu - Khả năng cố định đạm được đánh giá thông qua môi trường chọn lọc là môi trường Burk vô đạm Khả năng hòa tan lân được đánh giá thông qua môi trường chọn lọc là môi trường NBRIP chứa calcium orthophosphate - Định danh vi khuẩn. .. Acetobacter, Azospirillum, v.v (Tang and Yang, 1997) PGPR được Kloepper và Schroth (1978) định nghĩa như là những vi khuẩn có khả năng sống quanh vùng rễ và bám vào hạt giống, sau đó giúp cho sự tăng trưởng của thực vật Tiến trình phát triển của chúng qua các giai đoạn: phát tán từ hạt giống và nhân nhanh mật số trong vùng rễ, bám vào bề mặt rễ và phát triển trong hệ thống rễ cây (Kloepper, 1993) Sự... nghiên cứu 2.2.1 Thu thập và xử lý mẫu đất vùng rễ cây ngô 2.2.1.1 Thu thập mẫu Vi c thu mẫu được tiến hành tại các ruộng ngô thuộc các huyện Trảng Bàng, Gò Dầu, Dương Minh Châu, Thị xã Tây Ninh, Tân Biên, Châu Thành, Tân Châu Quy trình thu mẫu thực hiện theo Vi n Thổ nhưỡng Nông Hóa (1998) (Hình 2.1) Mỗi ruộng thu ngẫu nhiên ít nhất 5 cây ngô để lấy đất vùng rễ Chọn cây ngô đang ở giai đoạn... là một vi khuẩn nội sinh, vi hiếu khí và có khả năng cố định đạm cực kỳ hiệu quả Vi khuẩn này được phân lập từ cỏ Kallar (Leptochloa fusca L Kunth) và có thể gây nhiễm vào rễ lúa Ở Pakistan- nơi mà hàm lượng dinh dưỡng thấp do ảnh hưởng của muối, cỏ Kallar được ứng dụng cho nhiễm Azoarcus như là một thực vật tiên phong vi nó là một loại cỏ chịu mặn và đạt được những hiệu quả nhất định ... đất vùng rễ ngô trồng đất xám Tây Ninh Bảng 3.2: Đặc tính dinh dưỡng đất vùng rễ ngô trồng đất xám tỉnh Tây Ninh Bảng 3.3: Mật số vi khuẩn cố định đạm vi khuẩn hòa tan lân có đất vùng rễ ngô. .. 24 2.2.3 Đếm mật số vi khuẩn cố định đạm vi khuẩn hòa tan lân đất vùng rễ ngô 26 2.2.4 Phân lập làm vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân khó tan từ đất vùng rễ ngô ... 47 3.5 Khả cố định đạm, hòa tan lân dòng vi khuẩn đất vùng rễ ngô 55 3.5.1 Khả cố định đạm dòng vi khuẩn đất vùng rễ ngô 57 3.5.2 Khả hòa tan lân dòng vi khuẩn đất vùng rễ ngô 61 3.6 Mối