Luận án : phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm pseudomonas spp bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông cửu long

Luận án : Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas spp. bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu LongMục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu- Mục tiêu chính: Chọn lọc được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. mang gen nif có khả năng cố định đạm hữu hiệu, cung cấp 25-50% nhu cầu đạm cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa cao sản.- Mục tiêu cụ thể: (1) Phân lập và tách ròng các dòng Pseudomonas bản địa có trong đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông Cửu Long làm nguồn vi khuẩn cố định đạm với cây lúa cao sản; (2) Khảo sát đặc điểm, khả năng cố định đạm sinh học và nhận diện vi khuẩn Pseudomonas trên các mức độ hình thái, hóa sinh và sinh học phân tử (DNA); (3) Đánh giá hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản ở mức độ in-vitro cho đến nhà lưới và ngoài đồng ruộng.MỤC LỤCTrangCHƯƠNG I: MỞ ĐẦU – TỔNG QUAN ĐỀ TÀI.1. Tính cấp thiết của đề tài . 1.2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu . 3.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu . 4.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 4.5. Những đóng góp của luận án 5.6. Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học 6CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1. Cố định đạm sinh học . 72.1.1. Khái quát về cố định đạm sinh học 72.1.2. Chu trình nitơ 82.1.3. Vi khuẩn cố định đạm sống tự do . 102.2. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas 112.2.1. Đặc điểm của Pseudomonas . 112.2.2. Phân loại Pseudomonas 132.2.3. Những loài Pseudomonas có khả năng cố định đạm 152.2.4. Phân lập và xác định Pseudomonas . 162.3. Cơ chế cố định đạm của Pseudomonas 17viii2.3.1. Enzyme nitrogenase . 172.3.2. Bộ gen của Pseudomonas và sự điều khiển tổng hợp nitrogenase . 202.3.3. Cơ chế cố định đạm 242.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm 252.4. Ứng dụng cố định đạm của Pseudomonas 282.4.1. Một số ứng dụng 282.4.2. Triển vọng ứng dụng Pseudomonas trong tương lai 302.5. Vai trò của đạm đối với cây lúa 31CHƯƠNG III: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU3.1. Nội dung nghiên cứu . 333.2. Phương tiện nghiên cứu . 333.2.1. Vật liệu . 333.2.2. Dụng cụ 343.2.3. Thiết bị . 343.2.4. Các loại hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn . 353.3. Phương pháp nghiên cứu3.3.1. Thu mẫu đất vùng rễ lúa 383.3.2. Phân lập vi khuẩn cố định đạm từ đất vùng rễ lúa 383.3.3. Xác định khả năng cố định đạm (in-vitro) của vi khuẩn . 403.3.3.1. Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Burk không đạm . 403.3.3.2. Đo hàm lượng NH4+ bằng phương pháp Phenol – Nitroprusside 413.3.3.3. Thử hoạt tính nitrogenase bằng phương pháp khử acetylen (ARA) . 423.3.4. Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử . 433.3.4.1. Tách chiết DNA (Neumann et al., 1992) 433.3.4.2. Khuếch đại DNA 453.3.4.3. Điện di các sản phẩm PCR . 463.3.4.4. Chụp hình gel điện di chứa sản phẩm phản ứng PCR 463.3.4.5. Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI . 47ix3.3.5. Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học của các dòng vi khuẩnvới cây lúa cao sản . 473.3.5.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn lên cây lúa trồng trong ống nghiệm 473.3.5.2. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa trồng trong chậu 493.3.5.3. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa ngoài đồng 503.3.6. Khảo sát mật số vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường lỏng 513.3.7. Thống kê, xử lý và phân tích số liệu 52CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1. Kết quả thu mẫu đất vùng rễ lúa 534.2. Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm . 534.2.1. Các dòng vi khuẩn đã được phân lập 534.2.2. Đặc điểm của khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn . 544.3. Kết quả đánh giá khả năng cố định đạm của vi khuẩn . 564.3.1. Khả năng tổng hợp NH4+ . 564.3.2. Hoạt tính nitrogenase 604.4. Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử . 634.4.1. Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR . 634.4.2. Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI 654.5. Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản 724.5.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn với cây lúa trồng trong ống nghiệm . 724.5.2. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa trong chậu . 734.5.3. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa ngoài đồng 77CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ5.1. Kết luận . 875.2. Đề nghị 88DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ . 89TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG IMỞ ĐẦU - TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI.1. Tính cấp thiết của đề tàiĐồng bằng sông Cửu Long có diện tích gần 4 triệu ha, trong đó có 1,7 triệu ha đất nông nghiệp được sử dụng để trồng lúa với diện tích canh tác lúa hàng năm lên đến 3,9 triệu ha (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2008). Phân bón nói chung và phân đạm hoá học nói riêng đã góp phần quan trọng trong việc gia tăng năng suất cây trồng. Để đảm bảo năng suất, nông dân đã sử dụng rất nhiều phân bón nhưng hiện nay giá cảphân bón hóa học ngày càng tăng cao làm tăng giá thành sản xuất và giảm hiệu quả kinh tế trong nông nghiệp. Sự lạm dụng phân đạm hóa học sẽ dẫn đến chi phí cao, đồng thời cũng sẽ dẫn đến những hậu quả như thay đổi lý, hóa tính của đất, giảm độ phì, mất cân bằng sinh thái . gây ảnh hưởng tiêu cực lên hệ sinh thái nên không đảm bảo thân thiện với môi trường canh tác trong nông nghiệp (Kannaiyan, 1999). Theo Võ Minh Kha (2003), cây lúa hấp thu chỉ khoảng 50-60% lượng đạm được bón vào trong đất. Số còn lại sẽ được lưu tồn trong đất hoặc bị rửa trôi gây hưởng đến môi trường nước. Bón quá nhiều phân đạm hóa học cho cây trồng đã góp phần dẫn đến chi phí sản xuất cao, hiệu quả kinh tế thấp, đồng thời không đảm bảo cho một hệ sinh thái phát triển bền vững.Để khắc phục những tác hại do sử dụng quá nhiều phân đạm hóa học thì việc sử dụng phân đạm sinh học có chứa các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm (BNF: biological nitrogen fixation) là một trong những biện pháp có hiệu quả mà không gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí sản xuất nhưng vẫn đảm bảo chất lượng đồng thời vẫn tăng năng suất nông sản. Việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn cố định đạm sinh học đã và đang là những đề tài được nghiên cứu rộng rãi khắp thế giới. Những vi khuẩn cố định đạm đã được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng như vi khuẩn Rhizobium (Keyser và ctv., 1982; Scholla và Elkan, 1984); Bradyrhizobium cố định đạm với cây họ đậu (Elkan, 1992; Dowdlé và Bohlool, 1987; Buendia-Clavaria và ctv., 1994); vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và các chất dinh dưỡng khác (Bilal và ctv., 1990; Seshadri và ctv., 2000; Somers và ctv., 2005; Lăng Ngọc Dậu và ctv., 2007), loài Azospirillum lipoferum cũng đã được phân lập từ cây lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2007); vi khuẩnAzotobacter có khả năng cố định đạm (Döbereiner, 1974), như loài Azotobacter paspali là loài vi khuẩn nội sinh đặc hiệu cho cây cỏ Paspalum notatum và khoai lang (Döbereiner, 1976); vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có một số đặc tính như cố định đạm, tổng hợp kích thích tố tăng trưởng ở thực vật (phytohormone) như auxin và gibberellin, làm giảm độ pH môi trường để hòa tan lân khó tan (Bastian vàctv., 1998; Muthukumarasamy và ctv., 2002a; Tejera và ctv., 2003; Madhaiyan và ctv., 2004), chúng thường hiện diện ở đất quanh rễ cây cà phê, khóm, lúa, khoai lang (Jimenaz-Salgalo và ctv., 1997; Hernandez và ctv., 2000; Muthukumarasamy và ctv., 2002b) đồng thời cũng xác định được nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định đạm mạnh mẽ làm tăng sản lượng mía đường, khóm, khoai lang (Prabudoss và Stella,2009); vi khuẩn Burkholderia có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần với những cây họ đậu vùng nhiệt đới (Mounlin và ctv., 2001), cộng sinh với nhiều loại cây trồng giúp cố định đạm và kích thích sự tăng trưởng khi chúng hiện diện ở đất quanh vùng rễ và trong rễ của một số loại cây trồng như bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpella và ctv., 2003; Chen và ctv., 2006), khóm, chuối (Weber và ctv., 1999) và loài Burkholderiavietnamiensis đã được tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Việt Nam (Gillis và ctv., 1995); Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển thực vật như tổng hợp kích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae (Glickmann et al, 1998; Patten và Glick, 1987; Suzuki và ctv., 2003; Xie và ctv., 1996), hòa tan lân ở dạng khó tan thành dạng dễ tan giúp cây trồng hấp thụ như: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas chlororaphis (Cattenlla và ctv., 1999), cố định đạm như Pseudomonas stutzeri (Krotzky và Werner, 1987).Các loài thuộc giống Pseudomonas có khả năng cố định đạm đã được khẳng định từ lâu (Chan và ctv., 1994), trong đó có Pseudomonas stutzeri (Krotzky và Werner, 1987; Vermeiren, 1999). Ngoài ra, các nhà khoa học cũng đã xác định một số loài vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm và giúp tăng năng suất lúa (Gillis và ctv., 1995; Tran Van và ctv., 2000; Nguyễn Ngọc Dũng và ctv., 2000).Hiện nay, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu và sử dụng các chủng vi khuẩn cố định đạm sinh học. Việc nghiên cứu ứng dụng các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu bón cho cây lúa ở đồng bằng sông Cửu Long mang tính cấp thiết nhằm góp phần giảm sử dụng phân đạm hóa học cho cây lúa nhưng vẫn giữ vững năng suất, bảo vệ môi trường và góp phần đảm bảo cho sự phát triển nông nghiệp bền vững trong khu vực. Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas spp. bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện nhằm nhận diện và xác định được những dòng Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm hữu hiệu trên cây lúa cao sản.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGÔ THANH PHONG

Mã số 62 42 40 01

Người hướng dẫn khoa học PGS TS CAO NGỌC ĐIỆP

Cần Thơ - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGÔ THANH PHONG

Mã số 62 42 40 01

Cần Thơ - 2012

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

-

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố

định đạm Pseudomonas spp bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu

Long” là của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa

từng được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận án

Ngô Thanh Phong

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn Thầy - PGS.TS Cao Ngọc Điệp, người đã tận tâm

hướng dẫn khoa học, tư vấn và giúp tôi tiếp cận các khía cạnh khoa học cho sự thành công của đề tài nghiên cứu sinh

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Phòng Đào Tạo, Phòng Quản Lý Khoa Học, Khoa Sau Đại Học và các Phòng Ban chức năng khác của Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi

Chân thành cảm ơn quí Thầy Cô và anh chị đồng nghiệp ở Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên và Viện Nghiên Cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trợ và tư vấn cho tôi trong thời gian học tập cũng như thực hiện luận án này

Cảm ơn ThS Trần Thị Xuân Mai đã tư vấn thiết kế cặp mồi chuyên biệt cho

Pseudomonas stutzeri A1501; cảm ơn ông Đào Văn Sơn (nông dân ở nông trường

Sông Hậu) đã hỗ trợ đất ruộng để triển khai thí nghiệm chủng vi khuẩn cho cây lúa cao sản trồng ngoài đồng; cảm ơn các học viên cao học và các sinh viên đã có sự cộng tác trong thời gian qua

Chân thành cảm ơn Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp cơ sở đã có những ý kiến nhận xét và góp ý giúp cho luận án được hoàn chỉnh hơn trước khi trình phản biện kín và bảo vệ luận án cấp Trường; cảm ơn hai nhà khoa học đã tham gia phản biện kín cho luận án tiến sĩ; xin cảm ơn Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường

Cảm ơn gia đình và những người thân đã chia sẻ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi để tôi được an tâm học tập và hoàn thành luận án tiến sĩ

Xin chân thành cảm ơn!

Ngô Thanh Phong

TÓM LƯỢC

Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas spp bón

cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện từ tháng 11 năm

2008 đến tháng 9 năm 2011 Những nội dung của đề tài đã được thực hiện nhằm đạt đến

mục tiêu tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas spp có khả năng cố định

đạm hữu hiệu với cây lúa cao sản Kết quả nghiên cứu của đề tài đã đạt được như sau:

Phân lập được 150 dòng vi khuẩn cố định đạm từ 130 mẫu đất vùng rễ lúa của

13 tỉnh thành ở đồng bằng sông Cửu Long trên môi trường Pseudomonas Isolation Agar (Difco) Tất cả 150 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+ trong đó có 86/150 dòng có khả năng tổng hợp NH4+ cao hơn 5 mg/l

Các dòng tổng hợp NH4+ cao được phân tích PCR-16S rRNA với cặp mồi đặc

hiệu FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 để nhận diện Pseudomonas Kết quả có 55/86

dòng vi khuẩn có băng ở vị trí 1500 bp so với thang chuẩn Tiếp tục phân tích

PCR-nifH rRNA với cặp mồi đặc hiệu PolF-115 và PolR-476 để nhận diện Pseudomonas có

đoạn gen nifH , đã phát hiện 32/55 dòng vi khuẩn có băng tương ứng 361 bp so với

thang chuẩn

Chọn 20 trong số 32 dòng vi khuẩn có đoạn gen nifH để kiểm chứng lại khả

năng cố định nitơ và cả 20 dòng vi khuẩn đều biểu hiện hoạt tính của nitrogenase thông qua phương pháp khử acetylene (ARA) Đánh giá hiệu quả của 20 dòng vi khuẩn này lên chiều cao và trọng lượng khô của cây lúa cao sản trồng trong dung dịch khoáng (không sử dụng đạm) trong 20 ngày, đã chọn được 6 dòng vi khuẩn có độ hữu hiệu cao để tiến hành thí nghiệm trên cây lúa cao sản trồng trong chậu ở nhà lưới Kết quả thí nghiệm đã xác định được 6 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp 25 – 75% nhu cầu đạm sinh học cho sự phát triển của cây lúa trồng trong chậu

Chọn 11 dòng vi khuẩn hữu hiệu nhất (bao gồm 6 dòng hiệu quả với cây lúa trồng trong chậu và 5 dòng khác cũng có triển vọng cố định đạm cao) để tiến hành định danh Sử dụng cặp mồi PST3422-5 và PST3422-580 (được thiết kế nhận diện gen

nifH của Pseudomonas stutzeri A1501), đã phát hiện 4/11 dòng có băng tương ứng

575 bp và tương đồng với băng của dòng vi khuẩn đối chứng là Pseudomonas stutzeri

A1501 trong phổ điện di của các sản phẩm PCR Kết quả giải trình tự DNA và so sánh

so với Pseudomonas stutzeri Trong đó, hai dòng AG9 và BT2 tương đồng 99%, hai dòng TG1 và BT1 tương đồng 98% với dòng CP000304.1 Pseudomonas stutzeri A1501 và dòng CP002881.1 Pseudomonas stutzeri ATCC 17588 DNA của 7/11 dòng

vi khuẩn còn lại được tiếp tục giải trình tự (theo sản phẩm PCR dựa trên cặp mồi

FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 tương ứng với đoạn 16S rRNA của Pseudomonas)

và so sánh với các dòng có trong ngân hàng dữ liệu NCBI Kết quả cho thấy cả 7 dòng

này đều tương đồng di truyền 97-100% so với các loài thuộc giống Burkholderia Trong đó, dòng CT1 tương đồng 100% với dòng AB568313.1 Burkholderia

vietnamiensis 16S-rRNA, dòng VL2 tương đồng 99% với FJ436055.1 Burkholderia vietnamiensis dòng SYe-6586, dòng KG14 tương đồng 99% với DQ979871.1 Burkholderia vietnamiensis dòng AU0829, dòng VL8 tương đồng 98% với

EF158393.1 Burkholderia vietnamiensis dòng TVV75, dòng KG1 tương đồng 98% với DQ979872.1 Burkholderia vietnamiensis dòng AU0913, dòng CM1 và KG8 cùng tương đồng 97% với AY098590.1 Burkholderia kururiensis dòng KP23 (dòng KG8 cũng tương đồng 97% với AY098588.1 Burkholderia brasilensis dòng M113) có trong

ngân hàng dữ liệu NCBI.

Thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện để đánh giá khả năng cố định đạm của 4

dòng vi khuẩn P stutzeri PS1 (TG1), P stutzeri PS4 (BT1), B vietnamiensis BV3 (KG1) và B vietnamiensis BV5 (CT1) (được chọn lọc từ 6 dòng vi khuẩn đã thí

nghiệm trong nhà lưới) trên cây lúa cao sản (OM2517) trồng trên đất phù sa tại nông trường Sông Hậu – Cần Thơ vào vụ Hè Thu 2011 Kết quả cho thấy từng dòng vi

khuẩn P stutzeri PS4 và B vietnamiensis BV3 đều cung cấp đến 50% đạm sinh học trong khi dòng P stutzeri PS1 và B vietnamiensis BV5 chỉ cung cấp được 25% nhu

cầu đạm sinh học cho sự phát triển của cây lúa cao sản

Từ khóa: Burkholderia vietnamiensis, cố định đạm sinh học, đất phù sa, đất vùng rễ,

gen nif, lúa cao sản, Pseudomonas stutzeri

SUMMARY Thesis "Isolation and selection of nitrogen-fixing bacteria Pseudomonas

spp., it’s application on high-yielding rice cultivated on the alluvial soil of the Mekong Delta" was done from November 2008 to September 2011 The aim of this

study was isolation and selection Pseudomonas spp strains with the high biological

nitrogen fixation (BNF) ability to apply to high-yielding rice cultivated on the soil of the Mekong Delta The results achieved as follows:

One hundred and fifty isolates were isolated from 130 soil samples (rice rhizosphere soils of 13 provinces in Mekong Delta) All of them were able to synthesize NH4+, 86/150 isolates synthesized NH4+ higher than 5 mg/l

The effective isolates (high NH4+ biosynthesis) were analysed by PCR-16S rRNA technique with primers FGPS4-281bis and FGPS1509'-153 to identify

Pseudomonas spp The results showed that 55/86 isolates having band at 1500 bp in comparision to standard ladder; 32/55 isolates were determined nifH gene with PCR

technique with specific primer PolF-115 and PolR-476 which had band at 361 bp in electrophoresis gel

Twenty isolates in 32 isolates had high nitrogenase activity through ARA method Screening of 20 isolates by evaluation of 20 isolates’s effectiveness on rice cultivated mineral solution free N in 20 days (in-vitro), the results showed that six isolates having high BNF ability manifested on height and dry weight of high-yielding rice With in-pots experiment, these six isolates provided 25 to 75% nitrogen requirement in the rice growth

Using primer PST3422-5 and PST3422-580 in PCR technique identified 4/11

isolates having band 575 bp together with reference strain (P stutzeri A1501) in

electrophoresis Isolates were sequenced, DNA sequencing were compared with GenBank database of NCBI by BLAST N software; the results showed that four

isolates were similarity of 98-99% with P stutzeri, such as AG9 and BT2 strains were

similarity of 99%, TG1 and BT1 strains were similarity of 98% with both strains

CP000304.1 Pseudomonas stutzeri A1501 and CP002881.1 Pseudomonas stutzeri

ATCC 17588 Besides that, seven isolates were further sequenced with DNA from

with species of the genus Burkholderia, such as CT1 strain was similarity of 100%

with AB568313.1 Burkholderia vietnamiensis 16S-rRNA, VL2 strain was similarity of

99% with FJ436055.1 Burkholderia vietnamiensis strain SYe-6586, KG14 strain was similarity of 99% with DQ979871.1 Burkholderia vietnamiensis strain AU0829, VL8

strain was similarity of 98% with EF158393.1 Burkholderia vietnamiensis strain

TVV75, KG1 strain was similarity of 98% with DQ979872.1 Burkholderia

vietnamiensis strain AU0913, two strains CM1 and KG8 strain were similarity of 97% with AY098590.1 Burkholderia kururiensis strain KP23 (in which one isolates the identity 97% with AY098588.1 Burkholderia brasilensis strain M113) in the GenBank database of NCBI

A field experiment was conducted to evaluate biological nitrogen fixation

ability of four isolates (P stutzeri PS1, P stutzeri PS4, B vietnamiensis BV3 and B vietnamiensis BV5 and they were selected from in-vitro and in-pots experiments) on

high-yielding rice (OM2517) cultivated on alluvial soil of Song Hau farm, Can Tho city in Summer-Autumn cropping-season 2011 The results showed that PS4 strain and/or BV3 strain had biological nitrogen fixation ability equivalent to 50% inorganic fertilizer while two strains (PS1 and/or BV5) only provided 25% nitrogen requirement for rice growth

Keywords: alluvial soil, biological nitrogen fixation, Burkholderia vietnamiensis, high-yielding rice, nif gene, Pseudomonas stutzeri, rhizosphere soil

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

TÓM LƯỢC iii

SUMMARY v

MỤC LỤC vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi

DANH SÁCH BẢNG xii

DANH SÁCH HÌNH xiii

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU – TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1 Tính cấp thiết của đề tài 1

.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 3

.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4

.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 4

.5 Những đóng góp của luận án 5

.6 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học 6

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cố định đạm sinh học ……… 7

2.1.1 Khái quát về cố định đạm sinh học 7

2.1.2 Chu trình nitơ ………… 8

2.1.3 Vi khuẩn cố định đạm sống tự do ……… 10

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas 11

2.2.1 Đặc điểm của Pseudomonas 11

2.2.2 Phân loại Pseudomonas 13

2.2.3 Những loài Pseudomonas có khả năng cố định đạm 15

2.2.4 Phân lập và xác định Pseudomonas 16

2.3 Cơ chế cố định đạm của Pseudomonas 17

2.3.1 Enzyme nitrogenase 17

2.3.2 Bộ gen của Pseudomonas và sự điều khiển tổng hợp nitrogenase 20

2.3.3 Cơ chế cố định đạm 24

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm 25

2.4 Ứng dụng cố định đạm của Pseudomonas 28

2.4.1 Một số ứng dụng 28

2.4.2 Triển vọng ứng dụng Pseudomonas trong tương lai 30

2.5 Vai trò của đạm đối với cây lúa 31

CHƯƠNG III: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu 33

3.2 Phương tiện nghiên cứu 33

3.2.1 Vật liệu 33

3.2.2 Dụng cụ 34

3.2.3 Thiết bị 34

3.2.4 Các loại hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn 35

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Thu mẫu đất vùng rễ lúa 38

3.3.2 Phân lập vi khuẩn cố định đạm từ đất vùng rễ lúa 38

3.3.3 Xác định khả năng cố định đạm (in-vitro) của vi khuẩn 40

3.3.3.1 Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Burk không đạm 40

3.3.3.2 Đo hàm lượng NH4+ bằng phương pháp Phenol – Nitroprusside 41

3.3.3.3 Thử hoạt tính nitrogenase bằng phương pháp khử acetylen (ARA) 42

3.3.4 Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 43

3.3.4.1 Tách chiết DNA (Neumann et al., 1992) 43

3.3.4.2 Khuếch đại DNA 45

3.3.4.3 Điện di các sản phẩm PCR 46

3.3.4.4 Chụp hình gel điện di chứa sản phẩm phản ứng PCR 46

3.3.4.5 Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI 47

3.3.5 Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học của các dòng vi khuẩn

với cây lúa cao sản 47

3.3.5.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn lên cây lúa trồng trong ống nghiệm 47

3.3.5.2 Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa trồng trong chậu 49

3.3.5.3 Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa ngoài đồng 50

3.3.6 Khảo sát mật số vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường lỏng 51

3.3.7 Thống kê, xử lý và phân tích số liệu ……… 52

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thu mẫu đất vùng rễ lúa 53

4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm 53

4.2.1 Các dòng vi khuẩn đã được phân lập ……… 53

4.2.2 Đặc điểm của khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn ……… 54

4.3 Kết quả đánh giá khả năng cố định đạm của vi khuẩn 56

4.3.1 Khả năng tổng hợp NH4+……… 56

4.3.2 Hoạt tính nitrogenase ……… 60

4.4 Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 63

4.4.1 Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR 63

4.4.2 Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI 65

4.5 Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản 72

4.5.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn với cây lúa trồng trong ống nghiệm …… 72

4.5.2 Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa trong chậu … 73

4.5.3 Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa ngoài đồng 77

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 87

5.2 Đề nghị 88

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO 90

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Một số loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn a Phụ lục 2: Môi trường trích DNA và phản ứng PCR b Phụ lục 3: Chuẩn bị gel agarose và điện di d Phụ lục 4: Qui trình giải trình tự DNA e Phụ lục 5: Phân bón cho cây lúa thí nghiệm trong chậu và ngoài đồng h Phụ lục 6: Phân tích đạm tổng số bằng phương pháp micro-Kjeldahl j Phụ lục 7: Đường chuẩn đo NH4+ k Phụ lục 8: Bảng kết quả thu mẫu đất vùng rễ lúa và phân lập vi khuẩn k Phụ lục 9: Bảng đặc điểm khuẩn lạc và hình dạng tế bào của 150 dòng vi khuẩn… m Phụ lục 10: Khả năng phát triển và tổng hợp NH4+ của 150 dòng vi khuẩn p Phụ lục 11: Xử lý số liệu của thí nghiệm trồng lúa in-vitro u Phụ lục 12: Xử lý số liệu của các thí nghiệm trong chậu (in-pots) w Phụ lục 13: Xử lý số liệu của các thí nghiệm ngoài đồng aa Phục lụ 14: Trình tự DNA của các dòng vi khuẩn BV và BK ……… hh Phụ lục 15: Bảng kết quả khử acetylen của 20 dòng vi khuẩn ……… oo

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

16S-rRNA/DNA gene 16S-ribosomal RNA/DNA coding gene

BV, BK Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia kururiensis

DNA, rRNA Deoxyribonucleic acid, ribosomal ribonucleic acid

HG, ST, BL, CM Hậu Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau

KG, AG, ĐT, TV Kiên Giang, An Giang, Đồng Tháp, Trà Vinh

LA, TG, VL, BT, CT Long An, Tiền Giang Vĩnh Long, Bến Tre, Cần Thơ NCBI National centre for biotechnology information

DANH SÁCH BẢNG

3.1 Bảng số liệu xây dựng đường chuẩn NH4+

41

4.1 Các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông

4.5 Hàm lượng NH4+ (mg/l) và hàm lượng nitrogenase (mM) được tổng

hợp ở 10 dòng vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy (đợt 1)

61

4.6 Hàm lượng NH4+ (mg/l) và hàm lượng nitrogenase (mM) được tổng

hợp ở 10 dòng vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy (đợt 2)

62

4.7 Hiệu quả của 20 dòng vi khuẩn lên chiều cao và trọng lượng khô cây

lúa ở giai đoạn 20 ngày tuổi

73

4.8 Hiệu quả của 6 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học trên thành phần

năng suất và năng suất lúa cao sản (thí nghiệm trong chậu)

75

4.9 Khả năng cố định đạm sinh học của 6 dòng vi khuẩn cho nhu cầu sinh

trưởng và phát triển của cây lúa cao sản (OM2517) (thí nghiệm trồng

lúa trong chậu)

77

4.10 Hiệu quả của 4 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học trên thành phần

năng suất lúa cao sản (OM2517) trồng trên đất phù sa nông trường Sông

Hậu, huyện Cờ Đỏ, Cần Thơ (vụ Hè Thu 2011)

78

2.5 Khuẩn lạc của Pseudomonas stuzeri và Pseudomonas fluorescens 15 2.6 Cây di truyền (phylogenetic tree) biểu diễn mức độ tương quan di

truyền giữa các loài Pseudomonas dựa vào kết quả phân tích di truyền

phân tử

16

2.7 Cây di truyền (phylogenetic tree) của các loài Burkholderia 17 2.8 Nitrogenase có khả năng xúc tác chuyển hóa, khử N2 thành NH3 18

2.10 “Vùng cố định đạm” (nitrogen fixation region) của Pseudomonas

stutzeri A1501

22

3.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn từ mẫu đất vùng rễ lúa cho đến khi trữ ròng 40

3.3 Trồng lúa trong dung dịch khoáng có bổ sung 0,8% agar 48

4.1 Hình ảnh một số khuẩn lạc (Theo thứ tự từ trái qua phải là các dòng

4.5 Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi

khuẩn Pseudomonas với cặp mồi tổng (M: thang chuẩn 100bp plus)

63

Hình Tên hình Trang

4.6 Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi

khuẩn với cặp mồi xác định gen nifH (Thang chuẩn 100bp)

64

4.7 Phổ điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của 5 dòng P

stutzeri A1501 (PS5), TG1, AG9, BT2 và BT1

65

4.12 So sánh trình tự DNA của dòng PS5 – Pseudomonas stutzeri A1501

(dòng vi khuẩn đối chứng) với GenBank

4.14 Cây phả hệ (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ về mặt di truyền

giữa 4 dòng vi khuẩn với dòng chuẩn P stutzeri A1501

70

4.15 Hiệu quả của vi khuẩn PS1 và phân đạm hóa học trên sự phát triển

của cây lúa và PS4 lên chiều cao cây lúa cao sản OM2517

77

4.16 Ruộng lúa thí nghiệm tại Nông trường Sông Hậu (trái) và các bụi lúa

ở các nghiệm thức chủng P stutzeri PS4 (phải) được 89 ngày sau khi

gieo sạ (trước khi thu hoạch 1 ngày)

79

4.17 Hiệu quả của 4 chủng vi khuẩn và phân đạm hóa học trên năng suất

lúa cao sản (tấn/ha) trồng trên đất phù sa Nông trường Sông Hậu, Cần

Thơ (vụ Hè Thu 2011)

80

4.18 Tương quan tuyến tính giữa chiều cao cây và số bông/m2 với năng

suất lúa ở mức ý nghĩa 5%

81

4.19 Hiệu quả của 4 chủng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên hàm lượng

protein trong gạo (%)

82

4.20 Tương quan tuyến tính giữa hàm lượng protein trong gạo (%) với

năng suất lúa (tấn/ha) ở mức ý nghĩa 5%

83

4.21 Hiệu quả của 4 chủng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên nitơ tổng số

(%) của đất trồng lúa ở Nông trường Sông Hậu, Cần Thơ

84

CHƯƠNG I

MỞ ĐẦU - TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI

.1 Tính cấp thiết của đề tài

Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích gần 4 triệu ha, trong đó có 1,7 triệu ha đất nông nghiệp được sử dụng để trồng lúa với diện tích canh tác lúa hàng năm lên đến 3,9 triệu ha (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2008) Phân bón nói chung và phân đạm hoá học nói riêng đã góp phần quan trọng trong việc gia tăng năng suất cây trồng Để đảm bảo năng suất, nông dân đã sử dụng rất nhiều phân bón nhưng hiện nay giá cả phân bón hóa học ngày càng tăng cao làm tăng giá thành sản xuất và giảm hiệu quả kinh tế trong nông nghiệp Sự lạm dụng phân đạm hóa học sẽ dẫn đến chi phí cao, đồng thời cũng sẽ dẫn đến những hậu quả như thay đổi lý, hóa tính của đất, giảm độ phì, mất cân bằng sinh thái gây ảnh hưởng tiêu cực lên hệ sinh thái nên không đảm bảo thân thiện với môi trường canh tác trong nông nghiệp (Kannaiyan, 1999) Theo Võ Minh Kha (2003), cây lúa hấp thu chỉ khoảng 50-60% lượng đạm được bón vào trong đất Số còn lại sẽ được lưu tồn trong đất hoặc bị rửa trôi gây hưởng đến môi trường nước Bón quá nhiều phân đạm hóa học cho cây trồng đã góp phần dẫn đến chi phí sản xuất cao, hiệu quả kinh tế thấp, đồng thời không đảm bảo cho một hệ sinh thái phát triển bền vững

Để khắc phục những tác hại do sử dụng quá nhiều phân đạm hóa học thì việc sử dụng phân đạm sinh học có chứa các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm (BNF: biological nitrogen fixation) là một trong những biện pháp có hiệu quả mà không gây

ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí sản xuất nhưng vẫn đảm bảo chất lượng đồng thời vẫn tăng năng suất nông sản Việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn cố định đạm sinh học đã và đang là những đề tài được nghiên cứu rộng rãi khắp thế giới Những vi khuẩn cố định đạm đã được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng như vi khuẩn

Rhizobium (Keyser và ctv., 1982; Scholla và Elkan, 1984); Bradyrhizobium cố định

đạm với cây họ đậu (Elkan, 1992; Dowdlé và Bohlool, 1987; Buendia-Clavaria và ctv., 1994); vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và

các chất dinh dưỡng khác (Bilal và ctv., 1990; Seshadri và ctv., 2000; Somers và ctv., 2005; Lăng Ngọc Dậu và ctv., 2007), loài Azospirillum lipoferum cũng đã được phân lập từ cây lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2007); vi khuẩn

Azotobacter có khả năng cố định đạm (Döbereiner, 1974), như loài Azotobacter paspali là loài vi khuẩn nội sinh đặc hiệu cho cây cỏ Paspalum notatum và khoai lang

(Döbereiner, 1976); vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có một số đặc tính

như cố định đạm, tổng hợp kích thích tố tăng trưởng ở thực vật (phytohormone) như

auxin và gibberellin, làm giảm độ pH môi trường để hòa tan lân khó tan (Bastian và

ctv., 1998; Muthukumarasamy và ctv., 2002a; Tejera và ctv., 2003; Madhaiyan và ctv.,

2004), chúng thường hiện diện ở đất quanh rễ cây cà phê, khóm, lúa, khoai lang

(Jimenaz-Salgalo và ctv., 1997; Hernandez và ctv., 2000; Muthukumarasamy và ctv.,

2002b) đồng thời cũng xác định được nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định đạm mạnh mẽ làm tăng sản lượng mía đường, khóm, khoai lang (Prabudoss và Stella,

2009); vi khuẩn Burkholderia có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần với những cây

họ đậu vùng nhiệt đới (Mounlin và ctv., 2001), cộng sinh với nhiều loại cây trồng giúp

cố định đạm và kích thích sự tăng trưởng khi chúng hiện diện ở đất quanh vùng rễ và

trong rễ của một số loại cây trồng như bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpella và ctv., 2003; Chen và ctv., 2006), khóm, chuối (Weber và ctv., 1999) và loài Burkholderia

vietnamiensis đã được tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Việt Nam (Gillis và ctv., 1995); Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng

và phát triển thực vật như tổng hợp kích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng

trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas syringae (Glickmann et al, 1998; Patten và Glick, 1987; Suzuki và ctv.,

2003; Xie và ctv., 1996), hòa tan lân ở dạng khó tan thành dạng dễ tan giúp cây trồng hấp thụ như: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas

chlororaphis (Cattenlla và ctv., 1999), cố định đạm như Pseudomonas stutzeri

(Krotzky và Werner, 1987)

Các loài thuộc giống Pseudomonas có khả năng cố định đạm đã được khẳng định

từ lâu (Chan và ctv., 1994), trong đó có Pseudomonas stutzeri (Krotzky và Werner,

1987; Vermeiren, 1999) Ngoài ra, các nhà khoa học cũng đã xác định một số loài vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm và giúp tăng năng

suất lúa (Gillis và ctv., 1995; Tran Van và ctv., 2000; Nguyễn Ngọc Dũng và ctv.,

2000)

Hiện nay, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu và sử dụng các chủng vi khuẩn

cố định đạm sinh học Việc nghiên cứu ứng dụng các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu bón cho cây lúa ở đồng bằng sông Cửu Long mang tính cấp thiết nhằm góp phần giảm sử dụng phân đạm hóa học cho cây lúa nhưng vẫn giữ vững năng suất, bảo vệ môi trường và góp phần đảm bảo cho sự phát triển nông nghiệp bền vững

trong khu vực Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm

Pseudomonas spp bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu Long” được

thực hiện nhằm nhận diện và xác định được những dòng Pseudomonas spp có khả năng

cố định đạm hữu hiệu trên cây lúa cao sản

.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Mục tiêu chính: Chọn lọc được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas spp mang gen nif có khả năng cố định đạm hữu hiệu, cung cấp 25-50% nhu cầu

đạm cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa cao sản

- Mục tiêu cụ thể: (1) Phân lập và tách ròng các dòng Pseudomonas bản địa

có trong đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông Cửu Long làm nguồn vi khuẩn cố định đạm với cây lúa cao sản; (2) Khảo sát đặc điểm, khả năng cố định đạm

sinh học và nhận diện vi khuẩn Pseudomonas trên các mức độ hình thái, hóa

sinh và sinh học phân tử (DNA); (3) Đánh giá hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản ở mức độ in-vitro cho đến nhà lưới và ngoài đồng ruộng

1.2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Phân lập vi khuẩn Pseudomonas spp từ đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông

Cửu Long dựa trên môi trường chuyên biệt, đồng thời kiểm tra và nhận diện các dòng vi khuẩn bằng các phương pháp hóa sinh và phương pháp sinh học phân tử

- Xác định sự hiện diện gen nif và đánh giá khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp đã phân lập được

- Chọn lọc các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp dựa trên cơ sở các thí

nghiệm in-vitro và trong nhà lưới để tiến hành xác định hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn trên cây lúa cao sản trồng ở ngoài đồng

.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài: các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp có khả

năng cố định đạm với cây lúa cao sản

Phạm vi nghiên cứu: các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp bản địa được phân

lập từ đất vùng rễ lúa trồng ở 13 tỉnh thành đồng bằng sông Cửu Long, có mang gen

nif và có khả năng cố định đạm hữu hiệu với cây lúa cao sản trồng ở trên đất phù sa

Nông trường Sông Hậu, huyện Cờ Đỏ, Cần Thơ

.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

1.4.1 Thời gian nghiên cứu

- Quyết định công nhận Nghiên cứu sinh số 6919/QĐ-BGDĐT ngày 15/10/2008 của Bộ trưởng Bộ Giáo dục và Đào tạo

- Thời gian đào tạo theo hệ không tập trung là 4 năm (11/2008 – 11/2012), theo Quyết định giao đề tài và người hướng dẫn Nghiên cứu sinh số 468/QĐ-ĐHCT ngày 13/11/2008 và Quyết định cử cán bộ, viên chức đi đào tạo Nghiên cứu

sinh số 1878/QĐ-ĐHCT ngày 25/12/2008 của Hiệu Trưởng trường Đại Học Cần Thơ

- Thời gian nghiên cứu thực tế của nghiên cứu sinh cho đến khi hoàn thành các nội dung nghiên cứu theo đề cương của đề tài: 11/2008 – 9/2011

1.4.2 Địa điểm nghiên cứu

- Các ruộng lúa được thu mẫu đất vùng rễ ở 13 tỉnh thành đồng bằng sông Cửu Long

- Phòng thí nghiệm Sinh học tế bào và Nhà lưới thuộc Khoa Khoa Học Tự Nhiên; Phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất và Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học; Phòng thí nghiệm Chuyên sâu thuộc Phòng Quản Lý Khoa Học, trường Đại Học Cần Thơ

- Ruộng lúa của ông Đào Văn Sơn, nông dân ở ấp 3, xã Thới Hưng (Nông trường Sông Hậu), huyện Cờ Đỏ, TP Cần Thơ

.5 Những đóng góp của luận án

- Phân lập được 150 dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông Cửu Long bằng môi trường Pseudomonas Isolation Agar (Difco) Dùng phương pháp Phenol – Nitroprusside đã xác định được 150 dòng vi khuẩn này đều có khả năng tổng hợp NH4+, trong đó có 18 dòng tổng hợp được lượng NH4+ trên

10 mg/l, góp phần tìm ra nguồn vi sinh vật cố định đạm sinh học cung cấp cho cây lúa cao sản

- Xác định được sự hiện diện của gen nifH ở 32 dòng vi khuẩn, trong đó có 11

dòng vi khuẩn triển vọng được giải trình tự DNA, gồm có 4 dòng vi khuẩn

được xác định tương đồng 98-99% với Pseudomonas stutzeri, 5 dòng vi khuẩn được xác định tương đồng 98-100% với Burkholderia vietnamiensis và 2 dòng được xác định tương đồng 97% với Burkholderia kururiensis, trong đó có 1 dòng còn tương đồng 97% với Burkholderia brasilense [theo Yabuuchi và ctv

(1992), Burkholderia được phân loại từ việc xác định và tách ra từ một số dòng

vi khuẩn Pseudomonas ban đầu]

- Sử dụng 6 dòng vi khuẩn có triển vọng ứng dụng cố định đạm để chủng cho cây lúa trồng trong chậu, đã xác định được 6 dòng này đều có khả năng cung cấp 25-75% nhu cầu đạm sinh học cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa cao sản OM2517 trồng trong chậu Có 4/6 dòng vi khuẩn triển vọng trong chậu được thí nghiệm chủng cho cây lúa cao sản trồng ở Nông trường Sông Hậu –

Cần Thơ Kết quả cho thấy từng dòng vi khuẩn P stutzeri PS4 (TG1) và B

vietnamiensis BV3 (KG1) đều có khả năng cung cấp đến 50%N trong khi dòng

P stutzeri PS1 (BT1) và B vietnamiensis BV5 (CT1) đảm bảo được 25% nhu

cầu đạm cho sự phát triển của cây lúa cao sản

.6 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học

- Đồng bằng sông Cửu Long hiện đang trồng nhiều giống lúa cao sản và những

nghiên cứu gần đây cũng cho thấy có sự hiện diện của Pseudomonas spp ở

vùng rễ của nhiều loại cây trồng trong đó có cây lúa cao sản Tuy nhiên, việc

xác định khả năng cố định đạm hữu hiệu của vi khuẩn Pseudomonas spp trên cây lúa cao sản vẫn còn hạn chế Vì vậy, nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas

spp đang được quan tâm, đặc biệt là tìm hiểu về khả năng cố định đạm với sự

hiện diện của gen nifH ở các dòng vi khuẩn này

- Giá thành phân hóa học trên thị trường hiện đang tăng cao là gánh nặng cho nông dân, đồng thời việc sử dụng nhiều phân hóa học sẽ dẫn đến ô nhiễm môi trường, không đảm bảo sự phát triển bền vững, ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế xã hội Vì vậy, hiện nay có các cơ sở sản xuất đang chú ý đến phương

án sản xuất phân sinh học Do đó, nghiên cứu và tuyển chọn các dòng vi khuẩn

Pseudomonas spp có khả năng cố định đạm hữu hiệu, dễ nhân nuôi với giá

thành rẻ bón cho cây lúa cao sản là hướng nghiên cứu cần thiết

CHƯƠNG II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cố định đạm sinh học

2.1.1 Khái quát về cố định đạm sinh học

Cố định đạm sinh học là quá trình khử N2 thành NH3 dưới sự xúc tác của enzyme nitrogenase Sau đó, NH3 có thể kết hợp với các acid hữu cơ để tạo thành các acid amin và protein Trong thực tế chỉ có một số ít loài vi sinh vật có khả năng cố định N2 không khí, đó là vi khuẩn lam (cyanobacteria) và một số vi khuẩn có khả năng

cố định đạm Vi khuẩn cố định đạm có thể cộng sinh với những cây họ đậu như giống

vi khuẩn Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium

và Allorhizobium, Methylobacterium (Tan và ctv., 2001; Sy và ctv., 2001); vi khuẩn

cố định đạm cũng có thể sống tự do như Azotobacter, Beijerinckia, Klebsiella,

Pseudomonas… hoặc có thể sống tự do nhưng cũng có thể nội sinh như Burkholderia

(Mattos và ctv., 2008)

Quá trình cố định đạm xảy ra trong tế bào của các vi sinh vật đều giống nhau là

nhờ chúng có hệ thống gen nif (ni là chữ viết tắt của nitrogen – nitơ và f là fixing – cố

định) điều khiển quá trình tổng hợp enzyme nitrogenase Nitrogenase là hệ enzyme xúc tác cho phản ứng khử N2 thành NH3 Như vậy, hệ thống gen nif được xem là hệ

thống gen điều khiển cho quá trình cố định đạm sinh học Tuy nhiên, ở vi khuẩn lam, quá trình cố định đạm không phải xảy ra ở bất kỳ tế bào nào mà chỉ có thể xảy ra ở dị bào (heterocyst) (Heldt, 1999)

Trong tự nhiên có những nhóm vi sinh vật có khả năng cố định N2 từ không khí

để cố định thành đạm sinh học cung cấp cho cây Những vi sinh vật này có một hệ thống sinh hóa chuyên biệt Vấn đề này có ý nghĩa to lớn và vô cùng quan trọng trong nông nghiệp, vì vi sinh vật có thể cố định nitơ từ không khí (chiếm 78,16% theo thể tích và 75,5% theo khối lượng bầu khí quyển) mà cây trồng không trực tiếp hấp thu

được (Nester và ctv., 2004) Theo Hardy và ctv., (1973), lượng đạm mà các vi sinh vật

trên trái đất có thể cố định hàng năm lên đến 175x106 tỉ tấn

Phản ứng cố định đạm sinh học xảy ra được ở một số vi sinh vật là nhờ sự xúc tác của một hệ enzyme chuyên biệt là nitrogenase Enzyme này xúc tác phản ứng biến đổi đạm ở thể khí (N2) thành ammonia (NH3) Nitrogenase được tìm thấy trong quá trình cố định đạm của vi khuẩn háo và yếm khí là một phức hệ bao gồm hai protein, trong đó protein nhỏ chứa Fe và protein lớn hơn chứa Fe và Mo (Bothe và Neuer, 1988)

Theo Evans và Barber (1977) thì quá trình cố định đạm xảy ra như sau:

Nitrogenase

N2 +6H+ +6e 2NH3

NH3 sẽ kết hợp acid hữu cơ tạo thành amino acid rồi thành protein:

NH3 + Acid hữu cơ Amino acid Protein

Cố định đạm sinh học có thể được trình bày theo phương trình sau đây, trong đó

2 phân tử ammonium được sản xuất từ 1 phân tử N2 cùng với 16ATP, 8 điện tử và 8 ion H+: N2 + 8H+ + 8e− + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

2.1.2 Chu trình nitơ

Chu trình nitơ là quá trình biến đổi của nitơ trong sinh quyển, trong đó nitơ xuất hiện dưới nhiều dạng tự do hay kết hợp (nitơ phân tử trong khí quyển, các nitrit, nitrat, amoni, protein, acid amin ) Không khí chứa 78% nitơ phân tử (N2) Khí nitơ này có thể được các vi sinh vật cố định như những vi sinh vật cộng sinh với thực vật bậc cao

hoặc sống tự do trong đất, đặc biệt là đất vùng rễ của thực vật (Nester và ctv., 2004)

Nitơ là nguyên tố thiết yếu cho các tiến trình sinh học, nó có trong thành phần của các acid amin (hợp phần bắt buộc của protein trong tế bào chất đặc trưng cho sự sống); hiện diện trong DNA, RNA (vật chất di truyền của tế bào ở cấp độ phân tử); trong các enzyme; trong màng tế bào; mang chức năng cấu trúc hoặc giữ chức năng cử

động; cung cấp năng lượng cho cơ thể, tham gia cấu tạo ADP và ATP Các sinh vật đều rất cần nitơ (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008)

Vòng tuần hoàn nitơ là vòng tuần hoàn được khép kín Sự tuần hoàn nitơ vào và

ra khỏi các hệ sinh thái phụ thuộc chủ yếu vào vi khuẩn (Hình 2.1)

Hình 2.1 Chu trình Nitơ

Trong các môi trường tự nhiên, nitơ tồn tại ở các dạng khác nhau, từ nitơ phân

tử ở dạng khí cho đến các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong cơ thể động, thực vật và con người (Trần Thị Cẩm Vân, 2005) Chu trình nitơ bao gồm các quá trình cơ bản sau:

- Quá trình cố định nitơ: Nitơ phân tử (N2) được chuyển hóa thành nitơ hợp

chất (Trần Đức Viên và ctv., 2004) Việc cố định nitơ bằng sinh học được

giúp đỡ bởi các vi khuẩn sống tự do như vi khuẩn hiếu khí, bán kị khí và yếm khí với những thực vật bậc cao (Đặng Kim Chi, 2001)

- Quá trình nitrate hóa: Khi các cơ thể vi khuẩn cố định nitơ, các thực vật và động vật chết đi, các acid amin được đồng hóa thành ammonia (NH3) hoặc

ammonium (NH4+) Các ammonia này có thể được biến đổi sang dạng nitrite (NO2-) và nitrate (NO3-) nhờ các vi khuẩn nitrite hóa (Nitrosomonas và

Nitrosococcus) và vi khuẩn nitrate hóa (Nitrobacter) là các vi khuẩn tự

dưỡng hiếu khí Ngoài ra còn có nhóm vi sinh vật dị dưỡng gồm nhiều loại

vi khuẩn và xạ khuẩn thuộc các giống (chi) Alcaligenes, Anthrobacter,

Corynebacterium, Achromobacter, Pseudomonas (Nguyễn Thị Kim Thái &

Lê Hiền Thảo, 1999)

- Quá trình phản nitrate hóa: Trong điều kiện không có oxy, các dạng nitơ hợp chất (NO3-, NO2-) bị phân hủy để tạo thành nitơ phân tử bởi các vi khuẩn khử nitrate (denitrifying bacteria), được gọi là quá trình phản nitrate hóa (quá trình khử nitrate) làm giảm lượng nitrate, khép kín và hoàn thiện vòng tuần hoàn nitơ

2.1.3 Vi khuẩn cố định đạm sống tự do

Hình 2.2 Quan hệ tương tác giữa vi sinh vật và thực vật ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của thực vật

Vi khuẩn cố định đạm sống tự do ở vùng rễ lúa và những cây thuộc họ hòa bản

đã giúp cây trồng phát triển tốt cũng như hạn chế đến mức thấp nhất lượng đạm hóa học trong nền sản xuất nông nghiệp (Kannaiyan, 1999) Chính vì vậy mà trong những thập niên gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới được thực hiện nhằm tìm ra các nguồn vi sinh vật có khả năng cố định đạm cho cây lúa và một số cây thuộc

họ hòa bản khác, các dòng vi sinh vật được ứng dụng bón cho cây lúa và đã giúp tăng

năng suất lúa từ 15-54% (Favilli và ctv., 1987; Omar và ctv., 1989) Cố định đạm sinh

học trên lúa làm tăng đạm tổng số lên 20-25% (Döbereiner, 1992) Theo thí nghiệm

của Cao Ngọc Điệp (2005), khi tưới dịch vi khuẩn Pseudomonas spp lên lúa cao sản

trồng trên đất phù sa ở Cần Thơ đã giúp tăng năng suất lúa lên 20-37%

Hình 2.3 Một số nguồn nitơ cung cấp cho cây

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas

2.2.1 Đặc điểm của Pseudomonas

Vi khuẩn Pseudomonas thường là vi khuẩn Gram âm, hình que Có chiên mao ở cực nên có khả năng lội tốt trong nước, không có khả năng tạo bào tử Pseudomonas là

vi khuẩn sống tự do, chúng hiện diện khắp nơi như trong đất, trong nước, thực vật, động vật, một số làm hư thực phẩm Chúng có khả năng hô hấp hiếu khí hay kỵ khí trong môi trường không có ôxi Nhiệt độ thuận lợi để chúng phát triển là 30 – 37oc

Tuy nhiên một số chủng Pseudomonas lại có thể sống tốt ở 40°C Pseudomonas có thể

được nuôi trong môi trường đơn giản và ở pH trung tính Một vài chủng có thể tạo huỳnh quang dưới ánh sáng tia cực tím ở bước sóng 254nm

Hình 2.4 Pseudomonas dưới kính hiển vi điện tử

dinh dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas

fluorescens, Pseudomonas syringae (Patten và Glick., 1987; Glickmann và ctv., 1998;

Suzuki và ctv., 2003; Xie và ctv., 1996) Một số loài Pseudomonas có khả năng hòa tan lân ở dạng khó tan thành dạng dễ tan giúp cây trồng hấp thụ như Pseudomonas

fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas chlororaphis (Cattenlla và ctv., 1999)

hay kháng lại một số vi sinh vật gây hại cho cây trồng như: Pseudomonas fluorescens HP72 chống nấm Rhizoctionia solani (Suzuki và ctv., 2003) Đặc biệt, một số dòng

Pseudomonas có khả năng cố định đạm từ nguồn nitơ không khí như Pseudomonas stutzeri (Krotzky và Werner, 1987; Cao Ngọc Điệp, 2005; Yan và ctv., 2008)

2.2.2 Phân loại Pseudomonas

Giống (chi) vi khuẩn Pseudomonas có hơn 140 loài, hầu hết thuộc nhóm hoại

sinh (Iglewski và Woods, 1983)

Kiểm tra các dòng Pseudomonas spp bằng phương pháp sinh học phân tử phân tích trình tự RNA ribo thể (rrs) (kỹ thuật PCR-16s-rRNA gen) (Mirza và ctv., 2006) và giải trình tự gen nif (cố định đạm – nitrogen fixation) dựa vào cặp mồi PolF và PolR

để xác định loài của Pseudomonas thông qua ngân hàng dữ liệu NCBI với phần mềm

BLAST N Một số nghiên cứu đã chứng minh những loài thuộc giống vi khuẩn

Pseudomonas có khả năng cố định đạm như Pseudomonas rubrisubalbicans

(Döbereiner và Pedrosa, 1987), Pseudomonas diminuta, P fluorescens, P

paucimobilis, P pseudoflava, P putida, P saccharophila, P stutzeri và P vesicularis

(Chan và ctv., 1994), Ngoài ra, còn có một số dòng Pseudomonas sp cũng đã được nghiên cứu như Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas infection, Pseudomonas

folliculitis, Pseudomonas aeruginosa streatment, Pseudomonas streatment, Pseudomonas bacteria, Pseudomonas pneumonia, Pseudomonas syringae (Iglewski và

Woods, 1983)

Loài vi khuẩn Alcagenes faecalis A15 là một loài vi khuẩn cố định đạm cho cây

lúa cao sản được nông dân Trung quốc sử dụng nhưng sau đó nó được các nhà khoa

học Bỉ phân loại chính xác dựa trên bộ genome của nó là Pseudomonas stutzeri

(Vermeiren, 1999)

Yabuuchi và ctv (1992) lần đầu tiên đã tìm ra giống Burkholderia dựa vào việc phân tích di truyền rRNA nhóm II, trên cơ sở phân loại lại 2 loài Pseudomonas

pickettii và Pseudomonas solanacearum được chuyển đổi từ giống Ralstonia Việc

phân loại lại một số loài Pseudomonas và đã đặt lại tên những loài này là Burkholderia (Yabuuchi và ctv., 1995) Khi đó, loài Burkholderia vietnamiensis sống trong rễ lúa trồng ở Việt Nam được phát hiện vào năm 1994 (Gillis và ctv., 1995) Đến năm 1996, các nhà khoa học đã xác định được Burkholderia vietnamiensis là loài vi khuẩn có khả

năng cố định đạm giúp tăng năng suất lúa (Tran Van và ctv., 1996), tăng năng suất mía (Govindanajan và ctv., 2006) Những loài Burkholderia có khả năng cố định đạm như

Burkholderia brasilensis, Burkholderia tropica ở cây mía (Baldani, 1996), Burkholderia kururiensis (Zhang và ctv., 2000), Burkholderia brasilensis, Burkholderia tropicalis ở khóm và chuối (Leonardo và ctv., 2001), Burkholderia unamae nội sinh trong Bắp (Caballero-Mellado và ctv., 2004) Năm 2008, một số nhà

khoa học của Đại học Cần Thơ cũng đã tìm ra môi trường nhân nuôi và tồn trữ hiệu

quả đối với dòng Burkholderia cepacia TG17 được phân lập từ cánh đồng lúa ở huyện Châu Thành thuộc tỉnh Tiền Giang (Dương Thị Nguyễn Quyên và ctv., 2008) Hầu

hết các dòng Burkholderia gây bệnh đều thuộc nhóm Burkholderia cepacia complex

(Bcc) có liên quan đến bệnh lây truyền, ví dụ như bệnh viêm hạch do Burkholderia

pseudomallei complex được phát hiện ở một bệnh nhân thuộc huyện Củ Chi – TP Hồ

Chí Minh vào năm 1999 Cách đây vài năm, người dân ở Đài Loan và Singapore từng

hoảng sợ vì Burkholderia (Pseudomonas cepacia) khi nó gây tử vong cho hàng chục

người, chủ yếu ở bệnh nhân nằm trong bệnh viện (http://www.ykhoanet.com/tapchi yhoc/0012/B3%20%20Duong%204tr305-07.htm, ngày 25-9-2009)

Việc gây bệnh do một số dòng Burkholderia đã làm hạn chế tiềm năng ứng dụng Tuy nhiên, Burkholderia có khả năng cố định đạm rất đa dạng, có 39 loài

Burkholderia đã được phát hiện Nhiều loài Burkholderia có tiềm năng ứng dụng trong

nông nghiệp và môi trường như khả năng cố định đạm từ không khí, khả năng kích thích cây trồng sinh trưởng (PGRS – Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) và phát triển, khả năng hòa tan lân khó tan, khả năng phân hủy sinh học (Elmerich và Newton, 2007)

Trước đây, cơ sở phân loại vi khuẩn được dựa vào hình dạng và những đặc tính sinh hóa là chủ yếu Trong những năm gần đây, khi công nghệ sinh học phát triển, các nhà khoa học đã xác định bộ gen của vi khuẩn Sau đó, ứng dụng phân tích cấu trúc DNA và RNA vào việc phân loại và xác định mức độ tương quan di truyền giữa các

dòng vi khuẩn (Nester và ctv., 2004)

2.2.3 Những loài Pseudomonas có khả năng cố định đạm

Vi khuẩn Pseudomonas sp phân bố rộng rãi và đa dạng nhiều chủng loài (Rangarajan và ctv., 2001; 2002) Một số loài thuộc giống Pseudomonas có khả năng

cố định đạm đã được khẳng định từ lâu (Krotzky và Werner, 1987; Chan và ctv., 1994), trong đó có Pseudomonas stutzeri (Vermeiren, 1999) Ngoài ra, các nhà khoa

học cũng đã xác định một số loài vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa có khả

năng cố định đạm và giúp tăng năng suất lúa (Gillis và ctv., 1995; Tran Van và ctv., 2000; Nguyễn Ngọc Dũng và ctv., 2000)

vietnamiensis có khả năng chuyển N2 thành NH3 (Perin và ctv., 2006)

Hình 2.6 Cây di truyền (phylogenetic tree) biểu diễn mức độ tương quan di truyền giữa các loài

Pseudomonas dựa vào kết quả phân tích di truyền phân tử (Menard và ctv., 2007)

Tương tự, bằng kỹ thuật di truyền phân tích 16S-rRNA và phân tích trình tự di

truyền của gen nif, Menard và ctv (2007) đã xây dựng được mối tương quan di truyền của các loài Burkholderia được biễu diễn qua cây di truyền (phylogenetic tree)

Hình 2.7 Cây di truyền (phylogenetic tree) của các loài Burkholderia (Menard và ctv., 2007)

2.3 Cơ chế cố định đạm của Pseudomonas

2.3.1 Enzyme nitrogenase

Nitrogenase là một đa enzyme (phức hệ enzyme) xúc tác cho phản ứng cố định

N2, khử N2 thành NH3 Enzyme nitrogenase được điều khiển tổng hợp bởi một hệ

thống gen nif có trong bộ genome của tế bào vi khuẩn Ngoài ra, enzyme nitrogenase

không chỉ xúc tác cho quá trình khử N2 thành NH3, mà còn có thể xúc tác khử các chất

CH3CN, HCN, NH3, N2O, C2H2… thành các sản phẩm tương ứng như sau:

Liên đoàn Quốc tế Sinh hóa đã thống nhất phân loại enzyme thành 6 nhóm

Enzyme nitrogenase thuộc nhóm EC1 là Oxidoreductases, xúc tác cho phản ứng oxy

hóa khử, nhận điện tử (e–) và nhả H2 (hoặc nhận điện tử và nhả O2)

Hình 2.8 Nitrogenase có khả năng xúc tác chuyển hóa, khử N2 thành NH 3 (Dixon and Kahn, 2004)

Nitơ tự do ở trạng thái rất bền nhờ liên kết ba (N≡N) của nó tương ứng với năng lượng tự do là 942 kJ/mol Trong điều kiện tự nhiên, những liên kết ba này chỉ có thể

bị bẻ gãy nhờ nguồn năng lượng nhiệt rất cao, có thể đến 4000°C nhờ những tia lửa

Trao đổi chất Chuyển điện tử Cung cấp H

điện khi có sấm sét Trong công nghiệp sản xuất phân đạm, NH4+ được tạo từ khí N2trong phản ứng Haber xảy ra ở 400-500°C với áp suất vài trăm atmostphere Tuy nhiên, quá trình cố định đạm sinh học, sự khử N2 lại xảy ra trong điều kiện sinh lý bình thường nhờ năng lượng ATP và sự xúc tác bởi enzyme nitrogenase (Dixon and Kahn, 2004)

Nitrogenase là một phức hệ enzyme, chúng được cấu tạo bởi 2 protein Cả 2 protein đều là phân tử nhỏ và đều có hoạt tính xúc tác:

- Một protein sắt (protein Fe – dinitrogenase reductase): là protein nhỏ hơn, có trọng lượng phân tử khoảng 60.000 Da, gồm 2 tiểu đơn vị giống nhau, chứa tâm oxy hóa - khử Fe4-S4, có 2 vị trí gắn ATP

- Một protein sắt – molibden (protein Mo-Fe – dinitrogenase): là protein lớn hơn, có trọng lượng phân tử khoảng 240.000 Da, có cấu tạo từ 2 tiểu đơn vị khác nhau chứa nhân Fe, Mo và tâm oxy hóa – khử

Hình 2.9 Các thành phần protein cấu thành nitrogenase (Dixon and Kahn, 2004)

Tổng cộng, nitrogenase chứa 2 nguyên tử Mo, 32 Fe và 30 nguyên tử S Nguyên tố Mo là nguyên tố vi lượng Những nguyên tử S rất linh động

Protein Mo-Fe Protein Fe Phức hệ enzyme nitrogenase

2.3.2 Bộ gen (genome) của Pseudomonas và sự điều khiển tổng hợp

nitrogenase

Genome và hệ thống gen nif của Pseudomonas

Bộ genome của Pseudomonas stutzeri A1501 được bao gồm trong 1 nhiễm sắc

thể vòng đơn có 4.567.418 bp, có thể mã hóa 4.146 protein, 59 gen tRNA và 4 operon rRNA Thông tin di truyền chuyên biệt về sự cố định đạm đã được xác định trong bộ

genome của Pseudomonas stutzeri A1501 Đó là “vùng cố định đạm” (nitrogen

fixation region) có kích thước 49kb, gồm 59 gen có liên quan Tỉ lệ (C+G) của vùng này cao hơn tỉ lệ (C+G) trung bình của bộ genome (66,8% so với 63,8%) Hệ thống

gen nif của Pseudomonas stutzeri A1501 cấu thành nên “vùng cố định đạm” trong

genome của nó được xác định tương đương với “vùng cố định đạm” của một số loài vi

khuẩn khác như Wolinella succinogenes, Rhizobium leguminosarum, Azotobacter,

Azospirillum…, nhưng chỉ khác về tỉ lệ (C+G)

Ở hai đầu của vùng gen nif (“vùng cố định đạm”) ở Pseudomonas stutzeri

A1501 là những gen mã hóa tổng hợp Co (cobalamin 5’-photphate synthase, PST1301) ở một đầu và đầu còn lại (PTS1360) là những gen mã hóa cho các nhân tố giúp bảo vệ tế bào tránh bị tổn thương trong quá trình oxy hóa Những gen bảo toàn

quan trọng nói trên không tồn tại ở vùng này đối với những loài Pseudomonas không

có khả năng cố định đạm Điều này cũng có thể suy luận rằng sự xuất hiện vùng mã hóa cobalamin 5’-photphate synthase (PST1301) ở đầu của “vùng cố định đạm” ở

Pseudomonas stutzeri A1501 được tiếp nhận từ sự chuyển đổi gen lân cận (Yan và ctv., 2008)

Thứ tự của các gen nif trong cấu trúc của “vùng cố định đạm” ở Pseudomonas

stutzeri A1501 được khởi đầu là vùng PST1301, vùng giữa lần lượt bao gồm các gen nifQ – nifB – nifA – nifL - nifY2 – nifHDKTY – nifENX – nifUSV – nifWZM – nifF

và vùng PST1360 ở đầu còn lại (Klipp và ctv., 2004)

Sự điều khiển tổng hợp enzyme nitrogenase

Điều hòa hoạt động gen ở sinh vật nhân sơ chủ yếu diễn ra ở giai đoạn phiên

mã, do sự tương tác giữa protein điều hòa với trình tự đặc biệt trong vùng điều hòa của gen

Những loài thuộc giống (chi) vi khuẩn Pseudomonas có khả năng cố định đạm đều có hệ thống gen nif để điều khiển quá trình cố định đạm từ nitơ vô cơ tự do trong không khí Do đó, Pseudomonas thuộc nhóm vi sinh vật hóa tự dưỡng

(chemolithotrophs), đó là nhóm vi sinh vật sử dụng hợp chất vô cơ tạo năng lượng (chất cho điện tử)

Theo nghiên cứu của Yan và ctv (2008), hệ thống của gen nif ở Pseudomonas

stutzeri A1501 là một hệ thống hoàn chỉnh gồm các loại gen nif quy định tổng hợp các

thành phần cấu tạo nên phức nitrogenase

Phức hệ enzyme nitrogenase gồm 2 protein: protein Mo-Fe được quy định mã

hóa bởi nifDK và protein Fe được quy định mã hóa bởi nifH Cấu trúc đầy đủ các

thành phần nhỏ trong phức nitrogenase được cấu thành từ những sản phẩm của nhiều

gen nif khác (a dozen other nif genes) được lưu giữ khi sống tự do hay đang cộng sinh

Những kim loại và những tiểu phần xúc tác cấu thành nitrogenase được đảm bảo ổn

định nhờ hoạt động tổng hợp của các gen nifMZ, nifW và nifUS Các gen nifB, nifQ,

nifENX và nifV và nifH chịu trách nhiệm tổng hợp trung tâm Molybden (FeMo-co)

cho đến sự quy định các tiểu phần trong protein Mo-Fe Mặc dù những gen này là giống nhau ở hầu hết hệ thống cố định đạm cũng như cấu tạo và nội dung, nhưng sự điều khiển thì có khác nhau giữa các giống

Như vậy, vi khuẩn có khả năng cố định đạm sinh học từ N2 không khí là nhờ hệ

thống gen nif quy định tổng hợp hệ enzyme nitrogenase Chính nitrogenase là hệ

enzyme sẽ xúc tác cho quá trình chuyển hóa N2 thành đạm sinh học Chức năng của

các gen nif tham gia quy định tổng hợp hệ enzyme nitrogenase đã được Curatti và ctv

(2007) khái quát theo hình sau đây:

Hình 2.10 “Vùng cố định đạm” (nitrogen fixation region) của Pseudomonas stutzeri A1501 (Yan và

ctv., 2008)

Trong “vùng cố định đạm” của Pseudomonas stutzeri A1501 tồn tại 2 nhóm

gen:

- Một nhóm gen đầu tiên (từ vị trí PST1302 đến PST1323) bao gồm nifB và

nifQ đều liên quan đến sự điều khiển tổng hợp MoFe-co và điều khiển nifLA Hai gen nifL và nifA có vai trò mã hóa protein điều hòa (kích thích

hoặc ức chế) điều khiển sự hoạt động của operon nif (Martinez-Argudo và

ctv., 2004; Xie, 2006) Operon rnfABCDGEF mã hóa cho phức hệ protein

màng chuyển điện tử đến nitrogenase, gần vị trí của nifLA

- Nhóm gen thứ hai gồm một nhóm các operon như nifHDKTY, nifNEX,

nifUSV và nifWZMF, mang những trình tự mã hóa bổ sung, được tìm thấy

ở những khỏang nằm giữa của các operon nif hoặc nằm ngay bên trong của những operon nif Có rất ít nucleotid xuất hiện ở các vùng không mã hóa

giữa các gen và sự chuyển đổi trùng lặp giữa những codon mở đầu và kết

thúc đã được phát hiện Tuy nhiên, không tìm thấy gen draT và draG là

những gen có chức năng điều khiển tổng hợp ADP-nitrogenase giữ chức năng đóng và mở đối với nitrogenase như trong báo cáo về vấn đề này ở

Azoarcus và Azospirillum brasilense Vì vậy, có một cơ chế bất hoạt hoặc

kích hoạt khác ở Pseudomonas stutzeri A1501 đã được đề xuất và nó do 16

gen giữa vùng nif ảnh hưởng đế sự cố định nitơ (Yan và ctv., 2008;

Elmerich và Newton, 2007; Kraus, 2006)

Những loài vi sinh vật có khả năng cố định đạm sống cộng sinh và tự do đều có

chứa những gen nif trong hệ gen Chính nhờ hệ thống gen nif mà những vi sinh vật này

có khả năng tổng hợp enzyme nitrogenase xúc tác cho quá trình khử N2 thành NH3

Nếu vùng vận hành không bị protein điều hòa ức chế thì gen cấu trúc sẽ hoạt động nhờ ARN-polymerase khởi động tổng hợp ARN thông tin và ARN thông tin sẽ quy định tổng hợp emzyme Bộ ba mở đầu 5’-AUG-3’ mã hoá cho methionine Ở vi khuẩn có hai loại tRNA đối với methionine: một là tRNA nhận gốc methionine để đưa vào thành phần của chuỗi polypeptide Met-tRNA, hai là tRNA nhận gốc formyl-methionine (fMet-tRNA) có vai trò quan trọng trong việc khởi đầu tổng hợp chuỗi polypeptide Ở sinh vật nhân sơ, nhóm amine của methionine có thể được formyl hoá bởi N10-formyl-tetrahydrofolic acid, nhờ enzyme transformylase đặc hiệu Do nhóm amine đã bị gốc formyl bao vây nên không cho phép nó tham gia vào quá trình kéo dài chuỗi, mà chỉ tham gia vào quá trình khởi đầu tổng hợp protein

Ở sinh vật nhân sơ, anticodon được định vị ở giữa của 16S-rRNA Base bổ sung kết hợp với base của codon mRNA ở khoảng cách từ 0,3 đến 0,4 nm, như vậy sẽ xuất hiện lực hấp dẫn Van der Waal Bằng cách này trước hết tRNA-aminoacyl kết hợp với tiểu phần nhỏ của ribosome và thực chất là với mRNA Phức hệ này phản ứng với

“nhân tố kéo dài” Nhân tố này có trên tiểu phần lớn của ribosome Ngoài các yếu tố tham gia khởi đầu tổng hợp protein như fMet-tRNA, mRNA, các tiểu đơn vị ribosome 30S và 50S, ATP, còn có 3 protein nữa là các yếu tố khởi đầu: IF1 (M 9000), IF2 (M 65000-80000) và IF3 (M 29000) Kết quả của giai đoạn này là tạo thành phức hợp

khởi đầu: fMet-tRNA-mRNA-ribosome 70S (Nester và ctv., 2004)

Quá trình được bắt đầu bằng sự kết hợp giữa yếu tố IF3 với tiểu đơn vị 30S Nhờ yếu tố này mà tiểu đơn vị 30S kết hợp với mRNA ở vị trí khởi đầu Trong giai đoạn hai fMet-tRNA gắn với phức IF2-GTP để tạo thành IF2-GTP-fMet-tRNA (tổ hợp