Chương II. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.7. Xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan của các dòng thu được
Thông qua việc (1) định lượng đạm sinh ra khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Burk không đạm, (2) định lượng lân hòa tan khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường NBRIP chứa lân khó tan, có thể chọn ra các dòng tốt nhất.
Thao tác chuẩn bị dịch vi khuẩn cho cả 2 thí nghiệm định lượng sau đây là tương tự nhau. Tuy nhiên, thời điểm trích lấy dịch nuôi cấy để đo nồng độ các chất sinh ra là khác nhau đối với mỗi thí nghiệm.
2.2.7.1. Chuẩn bị dịch vi khuẩn cho các thí nghiệm định lượng
- Để đảm bảo lượng vi khuẩn được chủng vào các ống chứa môi trường nuôi cấy lỏng là như nhau, dùng que cấy lấy đầy 1 vòng ans sinh khối của mỗi dòng hòa vào ống nghiệm chứa sẵn 5 ml môi trường nuôi cấy lỏng tương ứng với môi trường đặc đang dùng để lưu trữ mẫu vi khuẩn.
- Ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút, trong 2 ngày.
- Sau 2 ngày để vi khuẩn làm quen với chế độ nuụi cṍy lỏng lắc, lṍy 500àl dịch vi khuẩn chủng vào các ống nghiệm chứa 20 ml môi trường nuôi cấy lỏng dùng cho thí nghiệm định lượng (Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần). Cụ thể là:
+ Môi trường Burk không đạm, đối với thí nghiệm định lượng NH4+ sinh ra.
+ Môi trường NBRIP chứa lân khó tan, đối với thí nghiệm định lượng PO4-
sinh ra.
- Ủ trên máy lắc tốc độ 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.
- Tại mỗi thời điểm thích hợp, thu lấy 2 ml dịch nuôi cấy đem đi xử lý và phân tích định lượng (thời điểm này, xem chi tiết trong 2 thí nghiệm tiếp sau).
2.2.7.2. Xác định khả năng cố định đạm và đo lượng ammonium hình thành Hóa chất
+ Phenol C5H5OH – Nitroprusside Na2Fe(CN)5NO(2H2O)
Hòa tan 5 gram phenol và 0,025 gram nitroprusside trong nước cất cho đủ thể tích 500 ml.
+ Sodium hypochloride
Hòa tan 100/Cml dung dịch sodium hypochloride và 15 gram NaOH trong nước cất cho đủ thể tích 1 lít (C: nồng độ chlorine trong dung dịch sodium hypochloride).
+ Dung dịch chuẩn NH4+ (1 mg/l).
Thao tác
+ Xây dựng đường chuẩn NH4+:
- Lấy 6 ống nghiệm 20 ml được đánh số theo thứ tự 0 đến 5.
- Cho vào các ống nghiệm theo thứ tự trên lần lượt 2,5 - 2,0 - 1,5 - 1,0 - 0,5 - 0,0 ml nước khử khoáng, thêm lần lượt 0,0 - 0,5 - 1,0 - 1,5 - 2,0 - 2,5 ml dung dịch đạm chuẩn có nồng độ 1 mg/l NH4+ .
- Thêm 2,5 ml dung dịch phenol-sodium nitroprusside và 2,5 ml dung dịch sodium hypochloride vào mỗi ống, trộn đều bằng máy khuấy.
- Ống số 0 là đối chứng âm và đường chuẩn với nồng độ các ống theo thứ tự là 0,0 - 1,0 - 2,0 - 3,0 - 4,0 - 5,0 mg/l NH4+.
+ Xử lý mẫu dịch nuôi cấy và tiến hành định lượng:
- Thời điểm tiến hành thu dịch nuôi cấy để định lượng đạm sinh ra là ngày 2, 4, 6 và 8.
- Rút 2 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf, ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút, trong 5 phút.
- Hút 0,5 ml dịch trong cho vào ống nghiệm chứa 2 ml nước khử khoáng, thêm 2,5 ml dung dịch phenol-sodium nitroprusside và 2,5 ml dung dịch sodium hypochloride vào mỗi ống, trộn đều bằng máy khuấy.
- Để ổn định 15 - 20 phút tại nhiệt độ phòng rồi tiến hành đo lượng đạm tổng hợp được bằng phương pháp so màu ở bước sóng 640 nm (OD 640 nm).
2.2.7.3. Xác định khả năng hòa tan lân và đo lượng phosphate hòa tan Hóa chất
+ Dung dịch A
(1) 12 gram (NH4)6MoO24.4H2O (amonium molybdate) + 250 ml H2O (2) 02908 gram KsbOC4H2O6 (potassium antimonyl tartrate) + 100 ml H2O (3) Đong 140 ml H2SO4 đậm đặc và thêm H2O vào từ từ cho đủ 1 lít
(4) Cho (1) và (2) vào (3) sau đó thêm H2O vào cho đủ 2 lít + Dung dịch B
1,05 gram acid ascorbic + 200 ml dung dịch A Thao tác
Xây dựng đường chuẩn P2O5: (Cao Ngọc Điệp, 2011) - Lấy 6 ống nghiệm 20 ml được đánh số theo thứ tự 0 đến 5.
- Cho vào mỗi ống nghiệm 5 ml nước khử khoáng, thêm lần lượt theo thứ tự trên 0,0 - 0,5 - 1,0 - 1,5 - 2,0 - 2,5 ml dung dịch lân chuẩn có nồng độ 1 mg/l P2O5. - Thêm vào mỗi ống 4 ml dung dịch B và 3,5 - 3,0 - 2,5 - 2,0 - 1,5 - 1,0 ml nước lần lượt vào các ống theo thứ tự trên, trộn đều bằng máy khuấy.
- Ống số 0 là đối chứng âm và đường chuẩn với nồng độ các ống theo thứ tự là 0,0 - 0,5 - 1,0 - 1,5 - 2,0 - 2,5 mg/l P2O5.