Phân lập và giải trình tự đoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS gây bệnh tai xanh trên lợn tại địa bàn tỉnh khánh hòa

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định đặc tính di truyền của các chủng PRRSV trên địa bàn Khánh Hòa với mục đích cụ thể: xác định sự có mặt của PRRSV lưu hành trên lợn nuôi tại Khánh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: tôi là người trực tiếp tham gia thực hiện các nôi dung của đề

tài: “Phân lập và giải trình tự đoạn gen ORF5 của các chủng PRRSV gây bệnh tai

xanh trên lợn tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa” Các kết quả, số liệu, hình ảnh trình bày

trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan

Tôi xin cam đoan: mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án đều đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án đều chính xác

và được chỉ rõ nguồn gốc

Khánh Hòa, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Lê Thị Nhường

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Khoa sau đại học, Viện công nghệ sinh học – Đại học Nha trang, Ban lãnh đạo Phân viện thú y miền Trung đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo Thạc sĩ tại viện

Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn công nghệ sinh học và Bộ môn nghiên cứu vi trùng và phòng chẩn đoán - Phân viện thú y miền Trung đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học là

TS Vũ Khắc Hùng - Phân viện thú y miền Trung đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi

trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án Đồng thời tôi cũng gửi lời cảm

ơn chân thành tới tập thể cô chú, anh chị trong Bộ môn công nghệ sinh học và Bộ môn nghiên cứu Vi trùng đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện luận án tại Viện

Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè đã đóng góp công sức, động viên hoàn thành

đề tài nghiên cứu và luận án

Tôi chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Lê Thị Nhường

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC ĐỒ THỊ vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 4

1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh 4

1.1.2 Dịch tễ học PRRS 5

1.1.2.1 Trên thế giới 5

1.1.2.2 PRRS tại Việt Nam 5

1.1.2.3 PRRS tại Khánh Hòa 8

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích 8

1.1.3.1 Triệu chứng 8

1.1.3.2 Bệnh tích 9

1.1.4 Cơ chế sinh bệnh 9

1.1.5 Chẩn đoán bệnh tai xanh 10

1.1.5.1 Chẩn đoán lâm sàng 10

1.1.5.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 11

1.1.6 Điều trị và phòng bệnh 12

1.2 Tổng quan về PRRSV 13

1.2.1 Phân loại 13

1.2.2 Đặc điểm về hình thái và cấu trúc 13

1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy của PRRSV 19

1.2.4 Khả năng gây bệnh và tồn tại của PRRSV 22

1.2.4.1 Khả năng gây bệnh 22

1.2.4.2 Khả năng tồn tại 22

1.2.5 Đáp ứng miễn dịch chống lại PRRSV 23

1.2.5.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể 23

1.2.5.2 Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 24

1.2.6 Vật chủ và phương thức truyền lây 25

1.3 Vai trò của ORF5 trong quá trình gây bệnh của PRRSV 25

Chương 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

30

2.1 Nội dung nghiên cứu 30

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 30

2.3 Đối tượng nghiên cứu 30

2.4 Vật liệu nghiên cứu 30

2.4.1 Mẫu bệnh phẩm 30

2.4.2 Động vật thí nghiệm 30

2.4.3 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 31

2.4.3.1 Dụng cụ, trang thiết bị 31

2.4.3.2 Hóa chất 31

2.4.4 Chủng PRRSV đối chứng dương 32

2.5 Phương pháp nghiên cứu 32

2.5.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu 32

2.5.2 Phản ứng RT-PCR 33

2.5.2.1 Tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm 33

2.5.2.2 Phản ứng RT-PCR 33

2.5.2.3 Kỹ thuật điện di kiểm tra sản phẩm RT – PCR 35

2.5.3 Phương pháp phân lập PRRSV trên môi trường tế bào MARC – 145 35

2.5.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC – 145 35

2.5.3.2 Phương pháp cấy chuyển tế bào MARC – 145 36

2.5.3.3 Phân lập PRRSV trên môi trường tế bào MARC – 145 36

2.5.4 Giải trình tự và phân tích dữ liệu trình tự gen ORF5 39

2.5.4.1 Giải trình tự DNA 39

2.5.4.2 Phân tích dữ liệu trình tự gen ORF5 39

2.5.5 Phương pháp xác định TCID50 của PRRSV 39

2.5.6 Phương pháp xác định độc lực của PRRSV 40

2.5.7 Phương pháp realtime RT – PCR 42

2.5.8 Phương pháp xử lý số liệu 44

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Kết quả quá trình thu mẫu bệnh phẩm 45

3.2 Kết quả thực hiện hiện phản ứng RT-PCR 45

3.3 Kết quả phân lập PRRSV trên môi trường tế bào MARC – 145 46

3.4 Kết quả giải trình tự và phân tích dữ liệu trình tự gen ORF5 51

3.5 Kết quả xác định TCID50 và độc lực của PRRSV 55

3.5.1 Kết quả xác định giá trị TCID50 55

3.5.2 Kết quả xác định độc lực của PRRSV 58

3.5.3 Kết quả thực hiện phản ứng realtime RT – PCR 61

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

4.1 Kết luận 66

4.2 Kiến nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

aa : Amino axid (Axit amin)

bp : Base pair (Cặp bazơ)

CPE : Cytopathic effects (Bệnh lý tế bào)

Ct : Cycle threshold (Chu kỳ ngưỡng)

Da : Dalton

DNA : Deoxyribonucleic axid (Axit deoxyribonucleic)

EAV : Equine arteritis virus (Virus gây viêm động mạch ngựa)

EDTA : Ethylene diamine tetraacetic axid (Axit Ethylene diamine tetraacetic)

ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Phản ứng hấp phụ miễn dịch liên

quan tới enzyme)

EMEM: Eagle's Minimum Essensial Medium (môi trường nuôi cấy tế bào)

FBS : Fetal Bovine Serum (Huyết thanh bào thai bê)

GP : Glycoprotein

HP-PRRSV:Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome ( virus

tai xanh độc lực cao)

IFN : Interferon

M : Membrane protein

N : Nucleocapsid protein (Protein vỏ nhân)

OIE : Organisation of International Epidemiology (Tổ chức Dịch tễ học Thế giới) ORF : Open reading frame (Khung đọc mở)

PBS : Phosphate buffer saline (dung dịch muối đệm phosphat)

PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng trùng hợp chuỗi gen)

PRRS : Porcine reproductive and respiratory syndrome (Hội chứng rối loạn sinh

sản và hô hấp ở lợn)

RNA : Ribonucleic axid (Axit ribonucleic)

RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction (Phản ứng PCR ngược) TCID50: Tissue culture infectious dose 50 (Liều gây nhiễm 50% tế bào)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide của các mồi trong phản ứng RT – PCR 34

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng RT – PCR/1 ống eppendorf cho PCR 34

Bảng 2.3 Ba chủng PRRSV dùng để gây nhiễm trên lợn 40

Bảng 2.4 Trình tự nucleotide của các mồi và probe trong phản ứng realtime RT – PCR 42

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng RT – PCR/1 ống eppendorf cho PCR 43

Bảng 3.3 Kết quả phân lập PRRSV trên môi trường tế bào MARC – 145 lần 1 48

Bảng 3.4 Kết quả phân lập PRRSV trên môi trường tế bào MARC – 145 lần 2 49

Bảng 3.5 Kết quả ghi nhận tổng số giếng xuất hiện CPE của chủng virus NH02 55

Bảng 3.6 Kết quả ghi nhận tổng số giếng xuất hiện CPE của chủng virus NT02 56

Bảng 3.7 Kết quả ghi nhận tổng số giếng xuất hiện CPE của chủng virus VN01 57

Bảng 3.8 Kết quả xác định giá trị TCID50 của PRRSV trên môi trường tế bào MARC – 145 57

Bảng 3.9 Kết quả theo dõi nhiệt độ của 2 lô lợn thí nghiệm trong 21 ngày…………59

Bảng 3.10 Kết quả xác định giá trị Ct 61

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Sơ đồ biểu diễn hạt PRRSV 14

Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn tổ chức hệ gen của PRRSV 15

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc của protein GP2a, GP3, GP4, GP5 16

Hình 1.4 Sơ đồ biểu diễn quá trình sao chép hệ gen của PRRSV 17

Hình 1.5 Đại thực bào trước và sau khi bị nhiễm PRRSV 20

Hình 1.6 Cấu trúc và chức năng GP5 của PRRSV 26

Hình 1.7 Protein chức năng của PRRSV 27

Hình 1.8 Vai trò GP5 trong quá trình bám dính tế bào 27

Hình 1.9 RNA PRRSV đột biến tại vùng gen ORF5 28

Hình 1.10 Đột biến sảy ra ngoài vùng gen ORF5 của hệ gen PRRSV 28

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập PRRSV trên môi trường tế bào MARC – 145 37

Hình 2.2 Sơ đồ phân nhóm PRRSV theo công ty MJ - Biologics 39

Hình 3.1 Kết quả RT - PCR phát hiện PRRSV các mẫu bệnh phẩm 46

Hình 3.2 Kết quả so sánh tế bào MARC – 145 sau 4 ngày gây nhiễm của mẫu đối chứng âm (a)và NT02 (b) 47

Hình 3.3 Kết quả so sánh tế bào MARC - 145 sau 4 ngày gây nhiễm của đối chứng dương (a) và mẫu NT02 (b) 48

Hình 3.4 Kết quả RT - PCR kiểm tra PRRSV sau phân lập trên môi trường tế bào MARC – 145 50

Hình 3.5 Kết quả phân tích mối quan hệ của các chủng PRRSV dựa trên trình tự amino axit GP5 của công ty MJ - Biologics 53

Hình 3.6 Xác định hiệu giá virus trên đĩa 96 giếng 58

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn kết quả theo dõi sự biến đổi của lợn sau 21 ngày gây nhiễm 60

Hình 3.8 Phổi của lợn gây nhiễm PRRSV 63

Hình 3.9 Hạch lâm ba bị sưng, màu nâu vàng có nổi u cục to 64

Hình 3.10 Phổi bị viêm, gan có đốm trắng hoại tử 64

Hình 3.11 Tim sưng, màng bao tim và phổi xuất huyết 64

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Ngành chăn nuôi lợn là một trong những ngành chăn nuôi chính và quan trọng tại Việt Nam Tuy nhiên, người chăn nuôi đã và đang gặp khó khăn khi một số bệnh xuất hiện và có những diễn biến phức tạp, trong đó có bệnh tai xanh (PRRS - Porcine reproductive and respiratory syndrome) Bệnh tai xanh là bệnh truyền nhiễm cấp tính

nguy hiểm, do virus Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV) gây ra

và là một bệnh rất nguy hiểm và đặc biệt nghiêm trọng trên lợn và gây thiệt hại không nhỏ cho người chăn nuôi

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định đặc tính di truyền của các chủng PRRSV trên địa bàn Khánh Hòa với mục đích cụ thể: xác định sự có mặt của PRRSV lưu hành trên lợn nuôi tại Khánh Hòa; phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của các chủng PRRSV phân lập được; kiểm tra sự biến đổi và phân nhóm các chủng PRRSV; xác định hiệu giá virus (TCID50 - Tissue culture infectious dose 50) và kiểm tra được độc lực của các chủng PRRSV phân lập Kết quả nghiên trong đề tài này làm

cơ sở khoa học cho việc lựa chọn loại vaccine phòng bệnh PRRS phù hợp riêng cho lợn nuôi tại Khánh Hòa

Trong bài luận này đã nêu rõ các nội dung thực hiện chính để đạt được mục tiêu của đề tài bao gồm: phân lập và giải trình tự đoạn gen ORF5 (open reading framer 5) của PRRSV từ các mẫu bệnh phẩm thu được trên đàn lợn nuôi tại tỉnh Khánh Hòa Các phương pháp thực hiện bao gồm: thu mẫu; tách chiết và khuếch đại đoạn gen ORF5 bằng kỹ thuật RT – PCR, phân lập các chủng trên môi trường tế bào MACR -

145 Dựa trên những phương pháp trên, chúng tôi đã phát hiện và phân lập được 75 chủng PRRSV từ 100 mẫu bệnh phẩm đuợc thu ở Khánh Hòa Dữ liệu trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 từ 75 chủng virus đã được phân tích bằng kỹ thuật phân nhóm của công ty MJ - Biologics, Hoa Kỳ (MJ - PRRSV Grouping Technology), kết quả cho thấy các chủng này đều thuộc nhóm D1 - Trung Quốc Sau đó, chúng tôi chọn 25 chủng đã giải trình tự để xác định giá trị TCID50 Kết quả xác định giá trị TCID50của 25 chủng PRRSV dao động từ 4,5lg đến 6,3lg TCID50/ml Chúng tôi chọn 3 chủng NT02, NH02 và VN01 gây nhiễm với liều 2ml/con với nồng độ 106TCID50/ml trên 12 lợn (mỗi chủng gây nhiễm cho 4 lợn); kết quả cho thấy sau gây nhiễm lợn biểu hiện các

triệu chứng lâm sàng nhƣ sốt cao ≥ 400, có nốt đỏ tía, tai có nốt màu đỏ xanh từ ngày thứ

5 - 7 sau gây nhiễm

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có thể sử dụng làm cơ sở để tiếp tục thí nghiệm, phát triển và sản xuất vaccine tai xanh cho đàn lợn nuôi tại Khánh Hòa Kết quả của nghiên cứu này cũng có thể sử dụng kết hợp với việc nghiên cứu quá trình đồng nhiễm khuẩn và nhiễm khuẩn thứ cấp để có các biện pháp hỗ trợ trong việc điều trị và phòng chống lây lan của dịch cho chính đàn lợn nuôi tại địa bàn tỉnh

Từ khóa: bệnh tai xanh, MJ - PRRSV Grouping Technology, ORF5, PRRSV,

MARC-145, TCID50.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngành chăn nuôi lợn là một trong những ngành chăn nuôi chính và quan trọng tại Việt Nam Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ Theo CIRIRAD - Trung tâm hợp tác quốc tế về nghiên cứu nông nghiệp và phát triển, thịt lợn chiếm 70% tổng lượng các loại thịt tiêu thụ hằng ngày trên thị trường Việt Nam

Theo chiến lược phát triển chăn nuôi lợn đến 2020: đàn lợn từ 29,9 triệu con năm

2010 lên 32,9 triệu con năm 2015 và 34,7 triệu con năm 2020 Sản lượng thịt hơi từ 3,1 triệu tấn năm 2010 lên 3,9 triệu tấn năm 2015 và 4,8 triệu tấn năm 2020 Trong đó đàn lợn nuôi công nghiệp 5,8 triệu con (chiếm 19,3%) năm 2010 lên 8,9 triệu con (chiếm 27%) năm 2015 và 12,9 triệu con (chiếm 37%) năm 2020 Sản lượng thịt hơi nuôi công nghiệp

từ 1.135,1 ngàn tấn (chiếm 36,5%) năm 2010 lên 1.851,5 ngàn tấn (chiếm 47,2%) năm

2015 và 2.866 ngàn tấn (chiếm 59%) năm 2020

Để đạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, việc đầu tư cho công tác giống, quan tâm đến vấn đề thức ăn, các chương trình quản lý được đặt lên hang đầu Đặc biệt nhiệm vụ của công tác chăn nuôi - thú y càng nặng nề hơn, tăng cường áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật cho công tác phòng, chống dịch bệnh ở vật nuôi có hiệu quả là điều hết sức quan trọng Một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn đó

là dịch bệnh vẫn thường xuyên sảy ra Đặc biệt đối với chăn nuôi trên quy mô công nghiệp như hiện nay

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine reproductive and respiratory syndrome), còn gọi là bệnh “tai xanh” (Blue Ear), là bệnh truyền nhiễm cấp

tính nguy hiểm, do virus Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV) gây ra

PRRSV được chia ra 2 nhóm theo 2 kiểu gen: một có nguồn gốc từ Châu Âu (type I) và một có nguồn gốc từ Bắc Mỹ (type II) (Metwally và cộng sự, 2010)

PRRSV du nhập vào Việt Nam năm 1997 thông qua việc nhập lợn giống từ Mỹ Virus này nhanh chóng lây lan trong đàn lợn cả nước Ở nước ta, chủng PRRSV thuộc nhóm Bắc Mỹ VR - 2332 xuất hiện từ năm 2007 Tới năm 2012, nước ta đã có mặt đầy đủ

cả 2 chủng PRRSV Năm 2007, virus từ mầm bệnh thu được tại các ổ dịch qua xét nghiệm

là PRRSV type II, có tính tương đồng cao với các chủng gây bệnh tại Trung Quốc và là

một chủng mới đột biến gần đây Sự xuất hiện của chủng PRRSV mới làm cho virus có độc lực mạnh hơn đồng thời làm mất tính phòng bệnh của các vaccine đang được sử dụng Theo số liệu của chi cục thú y tỉnh Khánh Hòa từ tháng 9/2007 tại Khánh Hòa đã sảy ra

04 đợt dịch vào năm 2007, năm 2010, năm 2011 và năm 2012 với tổng số con mắc bệnh là 20.822 con, số con chết là 975 con, buộc tiêu hủy 61013 con Ước tính thiệt hại do bệnh tai xanh gây ra là 42.996 triệu đồng (Chi cục Thú y tỉnh Khánh Hòa)

Để ngăn chặn đại dịch có thể sảy ra thì việc sử dụng loại vaccine phòng bệnh tai xanh phù hợp đối với chủng PRRSV lưu hành tại địa bàn là lựa chọn tốt nhất đối với các nhà chăn nuôi Việc lựa chọn loại vaccine phù hợp dựa trên việc phân tích cấu trúc phân tử của các chủng PRRSV lưu hành Bộ gen của PRRSV gồm có 7 ORF (ORF - open reading frame), mã hoá cho các thành phần khác nhau của virus Tuy nhiên, chỉ có 3 ORF có ý nghĩa quan trọng trong định danh virus, đó là ORF5, ORF6 và ORF7 quy định tổng hợp các protein tương ứng: glycoproteins envelope (protein GP5) 25kDa, nucleocapsid (N) 15kDa và membrane protein (M) 19kDa Đây là những protein cấu trúc quan trọng nhất, chúng chiếm 90 - 95% lượng protein cấu trúc của virus Qua phân tích gen và theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các dòng PRRSV, người ta đã xác định rằng ORF7 và ORF6 có tính ổn định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá Trong khi đó, ORF5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng một dòng Bắc Mỹ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Những biến đổi đó thường là do hiện tượng đột biến điểm của một số chủng khi phân tích trình tự gen đích (Ansari và cộng sự, 2006; Andrea và cộng sự, 2014) Chính vì vậy nghiên cứu giải mã gen kháng nguyên ORF5 của PRRSV lưu hành hiện nay là thực sự cần thiết Ngoài ra, dữ liệu gen và hiểu biết di truyền học về gen ORF5

sẽ giúp cho việc nghiên cứu sản xuất và lựa chọn vaccine phù hợp với chủng PRRSV đang

lưu hành Xuất phát từ yêu cầu trên, dưới sự hướng dẫn của T.S Vũ Khắc Hùng tôi đã

chọn đề tài: “Phân lập và giải trình tự đoạn gen ORF5 của các chủng PRRSV gây bệnh

tai xanh trên lợn tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa” nhằm chẩn đoán bệnh, áp dụng các biện

pháp khống chế và khoanh vùng dịch tễ

 Mục tiêu của đề tài

- Xác định sự có mặt của PRRSV lưu hành trên lợn nuôi tại Khánh Hòa

- Phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 từ các chủng PRRSV phân lập được Kiểm tra sự biến đổi, phân nhóm các chủng PRRSV này

- Xác định hiệu giá virus (TCID50 - Tissue culture infectious dose 50) và kiểm tra độc lực của các chủng PRRSV phân lập được trên lợn tỉnh Khánh Hòa

 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Việc giải trình tự đoạn gen ORF5 sẽ là cơ sở để có thể kết luận mối quan hệ và sự sai khác của chủng virus lưu hành trên tỉnh Khánh Hòa với một số chủng trước đó tại Việt Nam và một số chủng trên thế giới Hơn nữa, kết quả đề tài sẽ khảo sát và phân nhóm chính xác PRRSV lưu hành tại các ổ dịch trên địa bàn tỉnh dựa vào giải trình tự gen ORF5

Từ đó, khuyến cáo nhà quản lý lựa chọn loại vaccine phù hợp sử dụng để tiêm phòng cho đàn lợn nuôi đạt hiệu quả phòng bệnh cao

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndome, viết tắt là PRRS), là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của loài lợn (kể cả lợn rừng) Bệnh được gọi bằng nhiều tên khác nhau như: “Bệnh bí hiểm ở lợn” (Mystery Disease Syndrome), Hội chứng vô sinh và hô hấp ở lợn (Swine Infertility and Respiratory Syndrome, được viết tắt là SIRS), Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn (Porcine Endemic and Respiratory Syndrome, được viết tắt là PEARS), Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome)

Căn cứ vào triệu chứng và bệnh tích, bệnh này còn được gọi là “Bệnh lợn tai xanh” (Blue-ear disease), ở Việt Nam tên bệnh tai xanh trở nên phổ biến hiện nay Năm 1992, Hội nghị Quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St Paul, Minnesota (Mỹ) đã nhất trí dùng tên Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn và được Tổ chức Thú y thế giới công nhận

1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh

PRRSV lần đầu tiên được phân lập từ một ổ dịch ở Hà Lan, được xác định là nguyên nhân chính gây ra hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn Virus thuộc giống

Arterivirus, thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, có cấu trúc hệ gen là RNA sợi đơn

dương, gồm 7 khung đọc mở khác nhau mã hoá cho các protein của virus Bộ Nidovirales gồm có 4 họ, bao gồm: Coronaviridae, Arteriviridae, Toroviridae, Roniviridae

Tên gọi của giống Arterivirus được bắt nguồn từ một loại virus trong chi đó, đó

là virus gây viêm động mạch ở ngựa (Equine arteritis virus) Các thành viên trong họ

Arteriviridae có cấu trúc và sự nhân lên giống với các virus trong họ Coronaviridae Hệ

gen của Arteriviridae chỉ bằng một nửa hệ gen của Coronaviridae và nét đặc trưng của chúng là bản sao mã giống nhau chung cho các loại virus của bộ Nidovirales Họ

Arteriviridae chỉ có một giống duy nhất là Arterivirus chứa tất cả bốn thành viên là virus

gây viêm động mạch ở ngựa (EAV), virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRSV), virus gây tăng hoạt enzyme lactase dehydrogenase (LDV) và virus sốt xuất huyết ở khỉ (SHFV) (Cavanagh và cộng sự, 1997)

1.1.2 Dịch tễ học PRRS

1.1.2.1 Trên thế giới

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được phát hiện lần đầu tiên năm

1987 ở vùng Bắc Mỹ gồm các bang California, bang Iowa và Minnesota Dịch lây lan nhanh chóng tới nhiều nước trên thế giới bao gồm Canada (1988); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991) và Pháp (1992) (Rossow và cộng sự,1998)

Năm 1998, bệnh được phát hiện ở một số nước Châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới đều có dịch bệnh PRRS lưu hành (trừ châu Úc và Newzeland)

Chủng HP – PRRSV được phát hiện đầu tiên trên đàn lợn tại Trung Quốc vào tháng 6 năm 2006 Theo trung tâm kiểm soát dịch bệnh động vật Trung Quốc, những năm gần đây ở Trung Quốc, dịch bệnh PRRS đã liên tục sảy ra và hiện vẫn đang còn tồn tại Trong vòng hơn 3 tháng của năm 2006, chủng PRRSV thể độc lực cao đã gây ra đại dịch lây lan ở hơn 10 tỉnh phía Nam và làm hơn hai triệu con lợn ốm, trong số đó, có khoảng hơn 400.000 con đã chết do bị bệnh Đến tháng 7 năm 2007, dịch bệnh đã sảy ra trên 25 tỉnh với hơn 180.000 lợn mắc bệnh và 45.000 con đã bị chết (Han và cộng sự, 2006) Chủng virus này nhanh chóng lây lan sang các nước trong khu vực như Việt Nam (tháng 3 năm 2007), Lào (tháng 6 năm 2010), Thái Lan (đầu năm 2010), Myanmar (tháng 2 năm 2011), Campuchia (tháng 8 năm 2010)… tất cả đều có triệu chứng giống như đàn lợn bị nhiễm HP – PRRSV tại Trung Quốc năm 2006 Có thể khẳng định rằng PRRS là nguyên nhân gây tổn thất kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới (OIE, 2013)

1.1.2.2 PRRS tại Việt Nam

Tại Việt Nam, PRRS được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam năm 1997, kết quả kiểm tra huyết thanh học cho thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu đó

có huyết thanh dương tính với PRRS Từ những công bố đó, có thể thấy rằng virus PRRS

đã xuất hiện tại nước ta từ năm 1997

Theo báo cáo của Cục Thú y năm 2007 trong nhiều năm qua có một tỷ lệ nhất định lợn giống có huyết thanh dương tính với PRRS Tuy nhiên, sự bùng phát thành dịch

và gây tổn thất lớn đáng báo động cho ngành chăn nuôi lợn Việt Nam thực sự mới bắt đầu

từ tháng 3/2007

+ Ngày 12/3/2007, dịch bệnh trên đàn lợn đầu tiên xuất hiện tại tỉnh Hải Dương Sau đó, do không quản lý được việc buôn bán, vận chuyển lợn ốm, dịch PRRS đã lây lan nhanh và phát triển mạnh tại 7 tỉnh thuộc vùng đồng bằng sông Hồng bao gồm: Hưng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hải Phòng với 31.750 lợn mắc bệnh và

số lợn chết lên tới 7.296 con Sau hơn 1 tháng tích cực khống chế, dịch PRRS ở vùng này

+ Ngày 28/03/2008 dịch xuất hiện tại Thanh Hoá và Hà Tĩnh Tỉnh Thanh Hoá

có 193.003 lợn bị ốm, tiêu huỷ 192.946 con, Hà Tĩnh với 30.020 con bị ốm, tiêu huỷ 30.015 con Riêng tỉnh Thanh Hoá chiếm 73% tổng số lợn ốm và tiêu huỷ trong cả đợt dịch trên toàn quốc

+ Ngày 01/04/2008, tại Nghệ An đã xuất hiện dịch PRRS với 8.455 con mắc bệnh và tiêu huỷ 8.455 con

+ Ngày 11/04/2008 dịch tái xuất hiện tại Thừa Thiên - Huế làm 16.389 lợn ốm, tiêu huỷ 16.389 con

+ Ngày 14/04/2008 tại Thái Bình đã xác định có dịch và có 9.447 lợn mắc bệnh, tiêu huỷ 9.447 con

+ Ngày 18/04/2008 dịch xuất hiện tại Nam Định với số lợn mắc bệnh là 4.784 con và có 4.768 con bị tiêu huỷ

+ Trong tháng 4/2008 dịch sảy ở Thái Nguyên (17/04), Ninh Bình (19/04), Vĩnh Long (21/04)

+ Tháng 5 đến tháng 7/2008 dịch sảy ra ở các tỉnh: Bình Phước, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Lào Cai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Quảng Ninh Sau đợt dịch này, tổng số lợn ốm là 271.215 con, số tiêu huỷ là 261.854 con (Đậu Ngọc Hào và cộng sự., 2008) Năm 2009, từ đầu năm đến ngày 24/06 đã có 6 tỉnh phát dịch là: Quảng Ninh, Quảng Nam, Hưng Yên, Gia Lai, Bạc Liêu, Bắc Giang

+ Ngày 19/02/2009 dịch sảy ra tại Quảng Nam làm cho 3.140 lợn ốm và tiêu huỷ 3.026 con

+ Ngày 25/02/2009 tại Bạc Liêu dịch PRRS xuất hiện với 13 lợn ốm và tiêu huỷ

Tháng 3 năm 2007, chủng virus HP - PRRSV đã được phát hiện ở tỉnh Hải Dương

và được xác định có chung nguồn gốc với chủng HP - PRRSV đã phát hiện trước đó tại Trung Quốc vào năm 2006 Tổng số con bị nhiễm lên tới 44.000 con, và làm chết 4000 con lợn HP - PRRS đã trở thành đại dịch tại Việt Nam, theo báo cáo của Cục thú y Việt Nam từ năm 2007 đến năm 2009, HP - PRRS đã ảnh hưởng tới 57 tỉnh thành trong cả nước Năm 2010, dịch HP – PRRS tiếp tục bùng phát với tổng đợt dịch sảy ra là 541 đợt trong cả nước Sau đó, dịch HP – PRRS vẫn tiếp tục sảy ra, tuy nhiên chủ yếu sảy ra vào mùa đông và mùa xuân ở các tỉnh phía nam (OIE, 2013)

1.1.2.3 PRRS tại Khánh Hòa

Ngày 25/6/2007 chủng HP - PRRSV lần đầu tiên được phát hiện trên đàn lợn nuôi tại ở tỉnh Khánh Hòa Theo báo cáo của Chi cục Thú y Khánh Hòa, từ giữa tháng 7 năm 2010, trên địa bàn các huyện Khánh Vĩnh, Ninh Hòa và thành phố Nha Trang đã xuất hiện dịch tai xanh Đến nay, dịch đã sảy ra tại 1.158 hộ gia đình thuộc 76 xã, thị trấn của 7 huyện Tổng số lợn trong đàn là 12.522 con, trong đó buộc phải tiêu hủy 10.983 con

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

1.1.3.1 Triệu chứng

Lợn mắc hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp thường có những triệu chứng lâm sang tùy thuộc giai đoạn phát triển và lứa tuổi bao gồm những đặc trưng như: lợn nái có chửa thường bị sảy thai hoặc thai chết lưu; lợn ốm thường sốt cao đến 40 - 420

C, các phần da mỏng thường bị đỏ lên, lợn bị nhiễm bệnh có lúc bị táo bón có lúc bị tiêu chảy, lợn ốm viêm phổi nặng đặc biệt là lợn con cai sữa, do đó những biểu hiện ở đường hô hấp thường rất rõ nét (OIE, 2013)

- Lợn nái giai đoạn cai sữa: Trong tháng đầu tiên khi bị nhiễm virus, lợn biếng ăn 7 -

14 ngày (10 - 15% đàn), sốt 39 - 400C, sảy thai thường giai đoạn cuối (1 - 6%), tai chuyển màu xanh trong khoảng thời gian ngắn (2%), đẻ non (10 - 15%), động đực giả (3 - 5 tuần sau khi thụ tinh), đình dục hoặc chậm động dục trở lại sau khi đẻ, ho và có dấu hiệu viêm phổi

- Lợn nái giai đoạn đẻ và nuôi con: Biếng ăn uống, mất sữa và viêm vú, đẻ non 2 – 3 ngày, da biến màu, lờ đờ hoặc hôn mê, thai chết lưu (10 - 15% thai chết trong 3 - 4 tuần cuối của thai kỳ), lợn con yếu, chết ngay sau khi sinh (30%), tai có màu xanh và tồn tại trong vài giờ

- Lợn đực giống: Bỏ ăn, sốt, đờ đẫn hoặc hôn mê, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh kém và cho lợn con sinh ra nhỏ

- Lợn con theo mẹ: Thể trạng gầy yếu, nhanh chóng rơi vào trạng thái tụt đường huyết

do không bú được, mắt có dử màu nâu, trên da có vết phồng rộp, tiêu chảy nhiều, giảm số lợn con sống sót, tăng nguy cơ mắc các bệnh về hô hấp, chân choãi ra, đi run rẩy…

- Lợn con cai sữa và lợn choai: Biếng ăn, ho nhẹ, lông xơ xác, Ngoài ra, trong trường hợp ghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi lan toả cấp tính, thể trạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, ho nhẹ, hắt hơi, chảy nước mắt, thở nhanh, tỷ lệ chết có thể tới 15%

1.1.3.2 Bệnh tích

Bệnh tích đặc trưng nhất là ở phổi Viêm phổi hoại tử và thâm nhiễm đặc trưng bởi những đám chắc, đặc (hiện tượng nhục hoá) trên các thuỳ phổi Thuỳ phổi bị bệnh có màu xám đỏ, có mủ và đặc chắc Trên mặt cắt ngang của thuỳ bệnh lồi ra, khô Nhiều trường hợp viêm phế quản phổi hoá mủ ở mặt dưới thuỳ đỉnh

Về mô bệnh học, thường thấy dịch thẩm xuất và hiện tượng thâm nhiễm, trong phế nang chứa đầy dịch viêm và đại thực bào, một số trường hợp hình thành tế bào khổng

lồ nhiều nhân Một bệnh tích đặc trưng nữa là sự thâm nhiễm của tế bào phế nang loại II (pneumocyte) làm cho phế nang nhăn lại, thường bắt gặp đại thực bào bị phân huỷ trong phế nang

* Một số bệnh tích khác:

+ Thận: xuất huyết lấm tấm như đầu đinh ghim

+ Não: xung huyết

+ Hạch hầu họng, hạch amidan: sưng, xung huyết

+ Lách: sưng, nhồi huyết

+ Hạch màng treo ruột: xuất huyết

+ Van hồi manh tràng: loét nặng

1.1.4 Cơ chế sinh bệnh

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, đích tấn công của virus là đại thực bào, đặc biệt đại thực bào ở phế nang và phế quản Đại thực bào là loại tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ nó Có một tỷ lệ lớn tế bào đại thực bào trong nang phổi bị virus xâm nhiễm rất sớm (Rossow, 1998)

Khi bắt đầu xâm nhập, PRRSV có thể kích thích các tế bào này cung cấp nguyên liệu cho quá trình sao chép của virus, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày virus sẽ giết chết chúng, các virion được giải phóng và ồ ạt xâm nhiễm sang các tế bào khác Ở giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm của PRRSV, dường như hiệu giá kháng thể chống lại các loại virus

và vi khuẩn không liên quan khác trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của đại thực bào trong hệ thống miễn dịch Điều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc đánh giá mức độ miễn dịch đối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn (Rossow, 1998)

Trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, đại thực bào là tế bào có thẩm quyền miễn dịch, đóng vai trò vô cùng quan trọng trong đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu, mở đầu cho quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Khi tế bào đại thực bào bị virus phá huỷ, các phản ứng miễn dịch không sảy ra được, lợn nhiễm bệnh rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát (Drew, 2000) Hậu quả suy giảm miễn dịch còn thể hiện ở góc độ không hoặc giảm hiệu lực của các vaccine khác ở lợn như vaccine dịch tả, tụ huyết trùng, Điều này có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi thứ phát do những vi khuẩn vốn sẵn có trong đường hô hấp (Rossew, 1998)

Viêm phổi làm thiếu oxy nên gây rối loạn chuyển hóa của thai, thai bị suy dinh dưỡng và gây chết thai, sảy thai Lợn chửa kỳ cuối thì nhu cầu oxy tăng cao vì phải nuôi thai, ở thời kỳ cuối thai tăng trưởng rất nhanh nên nhu cầu về oxy tăng gấp bội, vì vậy lượng thiếu hụt oxy càng nghiêm trọng, nên thai hay sảy vào kỳ cuối Sau sảy thai tế bào nội mạc tử cung bị thoái hóa, hoại tử nên làm chậm các quá trình sinh lý khác

Tuỳ theo đối tượng lợn nhiễm bệnh mà hậu quả gây ra có sự khác nhau Hầu hết lợn con và lợn nái đang trong thời kỳ mang thai đều bị chết do nhiễm khuẩn kế phát nặng sau nhiễm PRRSV Tuy nhiên, để ngăn chặn nguồn bệnh và cắt đường lây truyền của dịch, người ta thường tiêu huỷ 100% lợn bệnh, nếu dịch bệnh sảy ra trên diện rộng sẽ gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho người chăn nuôi, môi trường và xã hội

1.1.5 Chẩn đoán bệnh tai xanh

1.1.5.1 Chẩn đoán lâm sàng

Chẩn đoán dựa vào dấu hiệu bệnh tích và được phân làm 2 nhóm triệu chứng:

Triệu chứng đường sinh sản: chủ yếu đối với lợn nái Vào giai đoạn đầu của dịch PRRS, có thể thấy hiện tượng sảy thai ở giai đoạn cuối thời kỳ mang thai và đẻ non, có các thai yếu, thai chết lưu, đồng thời có thai gỗ, lợn con yếu, chết trước khi cai sữa

Triệu chứng đường hô hấp: Chủ yếu dựa vào biểu hiện viêm phổi ở lợn con và lợn

vỗ béo Ta có thể dùng phương pháp chẩn đoán lâm sàng nghi vấn để chẩn đoán xác định bệnh trong trường hợp: sảy thai muộn > 20%, chết khi sinh > 5%, chết trước lúc cai sữa > 25% (Tô Long Thành, 2007)

Tuy nhiên, do tính đa dạng bệnh của các loại bệnh trên lợn nên việc chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng thường rất khó và dễ nhầm lẫn Hiện nay, các nhà khoa học thường kết hợp cả 2 phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng và các phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

1.1.5.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Chẩn đoán dựa vào các triệu chứng lâm sàng có thể là bước đầu cho quá trình chẩn đoán trong phòng thí nghiệm Mẫu bệnh phẩm bao gồm: máu của lợn còn sống hoặc mẫu

mô của lợn chết (mẫu phổi, hạch bạch huyết, amiđan, tổ chức lympho, dịch báng của thai chết) được sử dụng cho phương pháp chẩn trong này

Kỹ thuật chẩn đoán trong phòng thí nghiệm đối với PRRSV thường dựa vào 3 tiêu chí: virus, kháng nguyên của virus và kháng thể đặc hiệu để thực hiện các phản ứng nhằm phát hiện virus hoặc chẩn đoán huyết thanh học

 Phát hiện virus

Quá trình phát hiện PRRSV được thực hiện trên mẫu bệnh phẩm là huyết thanh, phổi, hạch Amidan, tổ chức lympho, dịch báng của thai chết lưu hoặc lợn chết ngay sau khi sinh để phát hiện virus Có có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện PRRSV

- Phân lập virus trên tế bào

- Phương pháp bệnh lý miễn dịch

- Phương pháp huỳnh quang gián tiếp phát hiện kháng nguyên

- Phương pháp sinh học phân tử

+ Phương pháp nhân gen (RT - PCR, Reverse transcription polymerase chain reaction)

+ Phương pháp lai phân tử tại chỗ (in situ hybridization) (Tô Long Thành, 2007) Phản ứng RT - PCR có độ chính xác cao đáp ứng được yêu cầu phát hiện sớm và chính xác PRRSV trên đàn lợn Trong quá trình chẩn đoán, việc ứng dụng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật RT - PCR góp phần xây dựng chiến lược kiểm soát bệnh trong ngành chăn nuôi lợn Việt Nam (OIE, 2013)

Phương pháp sinh học phân tử có độ nhạy và độ chính xác cao đang được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán xác định bệnh dịch, và cung cấp các dữ liệu di truyền học của PRRSV giúp cho việc nghiên cứu và điều chế vaccine phòng bệnh thế hệ mới

 Chẩn đoán huyết thanh học

Có thể phát hiện kháng thể kháng PRRSV trong huyết thanh, dịch của cơ thể hoặc từ thai chết lưu bằng một số phương pháp huyết thanh học bao gồm phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp, phương pháp miễn dịch enzyme, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) và phản ứng trung hòa huyết thanh

Trong đó, ELISA là phương pháp tiện lợi hơn cả Thuận lợi của phương pháp này

là có thể chẩn đoán một số lượng lớn các mẫu huyết thanh và các kết quả thu được của các phòng thí nghiệm (khi chẩn đoán huyết thanh cùng lúc) là tương đối đồng nhất Các phương pháp chẩn đoán này có độ chính xác tương đối cao (92 - 95%) (Tô Long Thành 2007)

1.1.6 Điều trị và phòng bệnh

Hiện nay, không có thuốc điều trị đặc hiệu bệnh tai xanh, chủ yếu chỉ điều trị các triệu chứng Hầu hết các phương pháp điều trị chủ yếu nhằm ngăn chặn và điều trị các nhiễm khuẩn thứ phát

Thông thường đối với bệnh nhiễm virus biện pháp ngăn chặn quyết liệt và hữu hiệu nhất là tiêu hủy đàn gia súc bị bệnh, vệ sinh và khử trùng chuồng trại…nhằm tiêu hủy mầm bệnh và ngăn chặn nguyên nhân phát tán bệnh ra diện rộng

Tiêm phòng vaccine luôn được coi là phương pháp phòng bệnh, kiểm soát bệnh hữu hiệu nhất hiện nay Tuy nhiên, do PRRSV đa dòng đa chủng, có độ đồng nhất kháng nguyên không cao, nên để chọn được loại vaccine nào phù hợp với chủng đang là vấn đề lớn của ngành chăn nuôi trên thế giới nói chung và ngành chăn nuôi Việt Nam nói riêng

Loài Porcine reproductive and respiratory syndrome

PRRSV được chia ra 2 kiểu gen chính là:

- Kiểu gen 1 (genotype I): các nhóm virus thuộc dòng Châu Âu chủng đại diện

và cộng sự, 2010) Theo công ty MJ - Biologics, dựa trên phân tích trình tự gen kháng nguyên, PRRSV được chia thành 16 nhóm từ D1 đến D8, từ S1 đến S8 thuộc dòng Bắc

Mỹ và 8 nhóm từ E1 đến E8 thuộc dòng Châu Âu

1.2.2 Đặc điểm về hình thái và cấu trúc

 Cấu trúc hạt

Hạt virus hình khối đa diện có cấu trúc đối xứng 20 mặt, đường kính khoảng 45 70nm, chứa nhân nucleocapsid (gồm lõi RNA và capsid do nhiều capsome tạo thành) có đường kính khoảng 30 - 35nm và được bao bọc ngoài cùng bởi một lớp vỏ bọc dính chặt với các cấu trúc bề mặt của virus giống như tổ ong, vỏ có chứa lipid Lúc tế bào nhiễm virus dưới kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy một đám lớn các hạt virus tập hợp lại với nhau tạo các thể bao hàm (quần thể, hay là cụm virus)

-Hình 1.1 Sơ đồ biểu diễn của hạt PRRSV

(Nedzad and Carl, 2010)

 Axit nucleic

PRRSV có cấu trúc RNA mạch đơn dương, có đường kính 40 - 70nm, có vỏ bọc, kích thước genome dài khoảng 15kb (Kim và cộng sự, 2005), được bắt đầu bằng vùng không mã hóa (đầu 5’) và kết thúc bằng vùng không mã hoá (đầu 3’) trong đó có chuỗi poly A, mã hoá cho 7 khung đọc mở (ORF) lồng vào nhau, cấu trúc tương tự các

ORF của Coronavirus Khi phân tích hệ gen PRRS người ta thấy rằng các khung đọc

mở (ORF) lồng vào nhau từ 1 - 253 bp (Cavanagh, 1997)

Độ dài các gen hoàn toàn khác nhau giữa PRRS dòng châu Âu và Bắc Mỹ phản ánh chênh lệch di truyền và mức độ tương đồng kháng nguyên giữa các chủng thuộc 2 dòng này Trong cùng một dòng Bắc Mỹ, các gen mã hoá cho các protein chức năng (ORF2 - 7) có độ dài gần như nhau, nhưng có độ khác nhau về kích thước và thành phần gen mã hoá cho RNA - polymerase (ORF1a và ORF1b) Đặc điểm gen và hệ gen này là yếu tố ảnh hưởng đến độc lực của virus PRRS mới xuất hiện gần đây ở Trung Quốc từ cuối năm 2006 (Zhou và cộng sự, 2008) và có lẽ xâm nhập vào Việt Nam đầu năm 2007 (OIE, 2013) Sự xuất hiện và lan toả của PRRS độc lực cao (Highly Pathogenic – HP – PRRSV, là chủng biến thể của VR - 2332) ở Trung Quốc, Việt

Nam và và một số nước Nam Á, và đa nhiễm trộn lẫn các dòng PRRS trên thế giới sẽ làm phức tạp hoá dịch tễ học và vaccine phòng chống (Zhou và cộng sự, 2008)

Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn tổ chức hệ gen của PRRSV

(Phani, 2010)

Bộ gen của PRRSV gồm có 7 ORF (ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7) Trong đó, ORF1 được chia làm 2 phần ORF1a và ORF1b, chiếm tới khoảng 80% tổng số độ dài hệ gen của virus, chịu trách nhiệm mã hóa RNA thông tin tổng hợp các enzyme RNA polymerase của virus Đầu 3’ của ORF1a được lồng vào đầu 5’ của ORF1b bởi 16 nucleotide Tại đầu cuối ORF1a có chuỗi gen gồm 7 nucleotide (UUUAAAC) tạo thành một vòm (loop), và cấu trúc này được coi là rất cần thiết cho quá trình sao chép và biểu hiện gen của ORF1b theo cơ chế chuyển đổi khung ribosome (Hình1.2) (Meulenberg và cộng sự, 1997) Như vậy, chuỗi gen của ORF1a ngoài nhiệm vụ tổng hợp nên protein còn chịu trách nhiệm là chuỗi gen điều hoà quá trình tổng hợp của ORF1b ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7 là các phần gen tạo nên khung đọc mở mã hoá các protein tương ứng, đó là GP2 (glycoprotein 2), GP3, GP4, GP5 (hay còn gọi là glycoprotein vỏ (E, envelope)), protein màng M (Membrane protein), và protein cấu trúc capsid N (nucleocapsid protein) (Meulenberg và cộng sự, 1997) Các protein được glycosyl hóa là: GP2, GP3, GP4, GP5, và các protein không được glycosyl hóa là M và N Glycosyl hoá (glycosylation) là hiện tượng gắn thêm hydratcarbon vào một vị trí amino axit xác định là Asparagine (N) theo quy luật N - (X) - S/T, trong đó N: Asparagine, X: bất kỳ (trừ Proline), S/T: hoặc Serine hoặc

Threonine Tuy nhiên chỉ có 3 ORF có ý nghĩa quan trọng trong định danh virus, đó là ORF 5, 6 và 7 quy định tổng hợp các protein tương ứng: glycoproteins envelope (protein GP5) 25kDa, matrix (M) 19kDa và nucleocapsid (N) 15kDa Đây là những protein cấu trúc quan trọng nhất, chúng chiếm 90 - 95% lượng protein cấu trúc của virus

Hình 1.3 Sơ đồ một số protein GP2a, GP3, GP4, GP5 của PRRSV

(Phani, 2010)

H

ì

Hình 1.4 Sơ đồ biểu diễn quá trình sao chép hệ gen của PRRSV

(Nedzad and Carl, 2010)

Protein N là một protein nhỏ (15kDa) và có tính kiềm cao, điều này có thể giúp

nó tương tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA Protein N hiện diện ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm PRRSV và chiếm từ 85% lượng protein của phân tử virus Hiện nay protein N được dùng như là một kháng nguyên để phát hiện kháng thể trong huyết thanh của lợn Protein M có trọng lượng phân tử khoảng 18kDa Mặc dù chức năng của

nó được biết rất ít nhưng nó được xem như có vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M - GP5 để kết hợp với thụ thể trên tế bào đích (Delputte và cộng sự, 2001) Protein GP5 có trọng lượng phân tử khoảng 25kDa, chiếm 15% tổng lượng protein của virus, là nguyên nhân gây ra hiện tượng apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện thụ thể trên tế bào đích (Nathalie và cộng sự, 2003) Qua phân tích gen và theo dõi sự thay đổi trình tự Nu của các dòng PRRS, người ta đã xác định rằng ở dòng Châu Mỹ, các ORF7 và 6 có tính ổn định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của dòng virus

này Tuy nhiên, sự khác biệt giữa dòng virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2 ORF này là rất

rõ, chẳng hạn sự tương đồng về trình tự axit amin của ORF7 giữa 2 dòng virus này chỉ vào khoảng 57 - 59% và của ORF6 là 70 - 81% Trong khi đó, khung đọc mở ORF5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng 1 dòng Bắc Mỹ và chỉ tương đồng với dòng Châu Âu khoảng 51-60% Sự tương đồng về trình tự axit amin quy định do các khung đọc mở ORF2, 3 và 4 giữa các dòng Bắc Mỹ và Châu Âu tương ứng chỉ ở từ 63,58% và 68% (Nguyễn Ngọc Hải., 2007)

Trong các tế bào bị nhiễm virus PRRS, có tất cả 6 RNA thông tin (mRNA) được tổng hợp, tất cả 6 mRNA đều chứa trình tự sắp xếp chung nhận được từ đầu 5' của hệ gen RNA trong gen và tất cả chúng đều có gắn thêm đuôi 3' polyA (Nedzad and Carl, 2010)

 Chức năng của các ORF

- ORF1a và 1b mã hoá protein enzyme RNA polymerase có chức năng xúc tác sao chép và tổng hợp như các RNA polymerase của các virus RNA khác

- ORF2 đến ORF6 mã hoá cho các protein kết hợp với màng của virus, trong đó

đã xác định:

+ Envelope glycoprotein (E, ORF5) có trọng lượng phân tử từ 24 - 25kDa là protein liên kết vỏ bọc kết hợp glycogen Các kháng thể trung hoà chủ yếu liên kết trực tiếp với các epitope có trên bề mặt của protein GP5, do vậy virus có thể bị trung hoà (Nelson và cộng sự, 1994) Những epitope trung hoà này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá Người ta cũng thấy rằng phân tử GP4 và protein M cũng chứa các epitope trung hoà (Meulenberg và cộng sự, 1997) và phân tử GP3 cũng chứa một epitope trung hoà Mặc dù vậy, những protein này có tác dụng kích thích miễn dịch và sinh học nhỏ hơn đáng kể so với protein GP5 (Cancel và cộng sự, 2004)

+ Membrane protein: (M, ORF6) có khối lượng phân tử khoảng 18 - 19kDa, không được glycosyl hoá, là protein liên kết vỏ bọc, mang tính kháng nguyên và có tính bảo tồn cao nhất Protein M có cấu trúc tương tự như cấu trúc protein M của các virus

thuộc nhóm Coronavirus Protein M hình thành cầu nối disunfit với glycoprotein 5

(GP5) cấu thành một phần virus và được tìm thấy trong tế bào nhiễm nhưng cầu nối sunfit này không cấu thành nên hạt virus (Meulenberg và cộng sự, 1997)

+ Nucleocapsid protein (N, ORF7) có khối lượng phân tử khoảng 14 - 15kDa, đây là protein vỏ bọc nhân, có tính kháng nguyên cao Protein N chiếm khoảng 20 - 40% protein của hạt virus

Phân tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hoá do đột biến ngẫu nhiên và tái

tổ hợp trong gen (Cho and Dee, 2006) Sự khác biệt về kiểu gen đương nhiên sẽ liên quan đến sự khác biệt về kiểu hình và như vậy có thể dựa vào đặc điểm gen để chẩn đoán dòng virus và ngược lại Như vậy, trên cơ sở về kiểu gen, dịch tễ học phân tử cho phép xác định chính xác bản đồ dịch tễ của một căn bệnh, quá trình xuất hiện, phát triển của PRRSV (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Nghiên cứu virus ở mức độ phân tử còn cho phép xác định được khả năng sản xuất và sử dụng virus nhược độc để làm vaccine Người ta đã ghi nhận nhiều trường hợp bệnh tai xanh trở nên trầm trọng hơn sau khi đàn lợn được tiêm vaccine PRRSV nhược độc vì cấu trúc gen của virus nhược độc thay thế glycine bằng arginine ở vị trí 151 của ORF5 sẽ hoàn nguyên rất nhanh bộ gen của chúng

so với bộ gen của virus nguyên thuỷ ngay sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, và như thế độc lực của chúng cũng được phục hồi (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Chính sự khác biệt và sự đa dạng về tính kháng nguyên, khả năng biến đổi cấu trúc kháng nguyên của virus đã làm tăng thêm những khó khăn trong việc sản xuất vaccine phòng chống bệnh này Điều cần lưu ý nữa là sự đa nhiễm PRRSV ở một số quốc gia, đó là sự trộn lẫn nhiều genotype, tức là căn bệnh do PRRSV lưu hành trên đàn lợn gồm cả 2 dòng virus: Bắc Mỹ và châu Âu (Cavanagh, 1997)

1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy của PRRSV

Đã có rất nhiều nghiên cứu về quá trình xâm nhập của PRRSV vào tế bào vật chủ, kết quả đều chỉ ra rằng một trong những trung gian đầu tiên được xác định để gắn vào các đại thực bào phế nang phổi đó là sulfate heparan và vimentin là thụ thể của tế bào MARC - 145 (Delputte và cộng sự, 2002) Sulfate heparan có mặt trên hầu hết các

tế bào và là một phần của proteoglycans hình thành lên glycosaminoglycans và có vai trò rất quan trọng đối với quá trình bám dính và điều chỉnh ligand ngoài tế bào Đầu tiên PRRSV sẽ bám dính vào tế bào đại thực bào qua sulfate heparan sau đó virus xâm nhập nội bào qua sialoadhesin (glycoprotein xuyên màng) cũng có thể liên kết với virus PRRS (Vanderheijden và cộng sự, 2003) Tuy nhiên sialoadhesin không có mặt trên bề mặt tế bào MARC - 145 (Jay và cộng sự, 2007) Vimentin được xác định là trung gian

gắn kết giữa tế bào MARC - 145 và nucleocapsid của PRRSV Bình thường đại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, virus xâm nhập vào tế bào bằng con đường nhập nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor, riêng đối với PRRSV, virus có thể nhân lên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) (phòng Dịch tễ - Cục Thú y)

Bằng kính hiển vi điện tử, người ta phát hiện những tiểu phần của virus hiện diện trong những khoang nhỏ Kháng nguyên virus có thể phát hiện ngay 6 giờ sau gây nhiễm (Dea, 2000; Pol, 1997) Trong giai đoạn nhiễm logarit (2 - 3 ngày sau gây nhiễm)

là quá trình hình thành và lây lan các cụm tế bào Các cụm tế bào xuất hiện trước sau đó mới sảy ra hiệu ứng CPE (Nedzad and Carl, 2010) PRRSV được lắp ráp khi nucleocapsid xuất hiện trong khoang của lưới nội chất không hạt hay vùng Golgi hoặc

cả hai Trong tế bào gây nhiễm MARC - 145, protein M định vị tại bộ Golgi và protein

N định vị quanh nhân và hạch nhân Lớp vỏ bọc ngoài (envelope) chủ yếu được hình thành trong khoang của lưới nội chất và cũng là nguyên nhân làm cho bào quan này phình to ra (Dea và cộng sự, 1995;Mardassi và cộng sự, 1994; Pol, 1997) Sau khi hình thành, virion được tập hợp lại và di chuyển ra màng bào tương để giải phóng virus (Meulenberg, 2000) Sau khi nuôi cấy 9 - 12 giờ, các tế bào bị xâm nhiễm sẽ vỡ ra và giải phóng các hạt virus trưởng thành (Pol and Wagenaar, 1997)

Hình 1.5 Đại thực bào trước và sau khi bào bị nhiễm PRRSV

(http://vietbao.vn/vi/Suc-khoe/Da-tim-ra-thu-pham/30173412/248/)

PRRSV mã hoá các sản phẩm gen mà chúng có thể gây ra apoptosis, một kiểu chết phổ biến, đóng vai trò quan trọng trong sự cân bằng nội tại và loại bỏ những tế bào tổn thương và già cỗi Người ta xác định được protein GP5 của virus là tác nhân gây ra

hiện tượng apoptosis (Meulenberg, 2000) Những thay đổi có tính thoái hoá do apoptosis gây ra trong tế bào bao gồm nhân tế bào cô đặc lại, vỡ ra, không bào bị thoái hoá, tế bào chất cô đặc, nhiễm sắc thể bị đứt ra từng mảnh Bệnh tích tế bào do PRRSV gây ra là: tế bào co tròn, tập trung lại, sau đó dày lên, nhân co lại và cuối cùng là tách khỏi tế bào một lớp sau 48 - 96 giờ nuôi cấy (Suarez, 2000; Benfield và cộng sự,1992) Virus đạt đỉnh cao lúc 24 - 48 ngày và có thể duy trì tới 60 - 70 giờ sau nuôi cấy, toàn

bộ lớp tế bào bong ra sau 6 ngày (Meng và cộng sự, 1996) Trong quá trình nhân lên của PRRSV trên môi trường tế bào MA - 104 (hoặc MARC - 145), hiệu giá virus có thể đạt tối đa 108,5 TCID50/0,1ml sau 48 - 72 giờ nuôi cấy (Kim và cộng sự,1993)

Khi gây nhiễm tế bào, hầu hết các chủng PRRSV đều gây bệnh tích tế bào nhưng vẫn có một số chủng PRRSV thì không (Christianson and Joo, 1994; Yoon và cộng sự, 1992) Kết quả cũng tương tự trên dòng tế bào PAM khi gây nhiễm PRRSV (Wensvoort., 1992) PRRSV thuộc dòng Bắc Mỹ phát triển khá tốt trên MARC-145 trong khi các dòng PRRSV của Châu Âu phát triển nhanh hơn trên PAM Nhiều phòng thí nghiệm ở Hàn Quốc và Bắc Mỹ chỉ sử dụng MARC - 145 vì khó khăn khi phải nuôi cấy PAM (Chung và cộng sự, 2002) Một nghiên cứu khác cho thấy sau 40 giờ nuôi cấy, gần 40% tế bào PAM có bệnh tích tế bào Tuy nhiên, kết quả này có thể thay đổi giữa các phòng thí nghiệm (Bloemraad, 1994; Yoon, 2003)

Vấn đề quan trọng bậc nhất trong nuôi cấy tế bào động vật là môi trường nuôi cấy phải đủ chất dinh dưỡng, nhân tố sinh trưởng, độ pH và nồng độ muối ổn định, đồng thời phải có hệ thống thải bỏ các sản phẩm trao đổi độc hại để tế bào có thể sống

và phát triển được Môi trường đặc trưng dù ng trong nuôi cấy tế bào đô ̣ng vâ ̣t bao g ồm các amino axit, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ 2 - 20% (theo thể tích) huyết thanh của động vật có vú Môi trường nuôi cấy phải đẳng trương để duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu Người ta thường dùng bicacbonate để tạo hệ đệm kết hợp với hệ làm giàu

CO2 môi trường (5 - 10% CO2/95% không khí) trong đó tế bào được nuôi Độ pH thích hợp là 7,4 và sử dụng phenol red để kiểm tra độ pH của môi trường Tế bào MARC -

145 phát triển tốt ở 370C trong môi trường nuôi cấy DMEM (Dulbecco’s minimum essential medium) hoặc E’MEM (Eagle's Minimum Essensial Medium), 10% FBS và có

bố sung kháng sinh penicillin (Lei và cộng sự, 2013)

1.2.4 Khả năng gây bệnh và tồn tại của PRRSV

như quá trình phiên mã và dịch mã của Coronavirus Sau khi xâm nhập vào cơ thể,

PRRSV thường tấn công, phá hủy và giết chết đại thực bào, đặc biệt đại thực bào vùng phổi Kết quả làm suy giảm hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ và làm tăng khả năng đồng nhiễm và tạo điều kiện thuận lợn cho các mầm bệnh kế phát (Nedzad and Carl, 2010)

1.2.4.2 Khả năng tồn tại của PRRSV

PRRSV có thể tồn tại ngoài cơ thể vật chủ trong thời gian nhất định và thời gian tồn tại phụ thuộc vào yếu tố nhiệt độ, pH và chất tẩy rửa PRRSV có thể tồn tại 1 năm trong nhiệt độ lạnh từ -200C đến -700C; trong điều kiện 40

C, virus có thể tồn tại 1 tháng Cũng như các virus khác, PRRSV đề kháng kém với nhiệt độ cao: chịu được 6 ngày ở

210C, 24 giờ ở 370C, 20 phút ở 560C (Benfield và cộng sự, 1992) Các virus PRRS vẫn

ổn định ở pH 6,5 đến 7,5, nhưng quá trình lây nhiễm được giảm khi pH < 6,0 hoặc pH > 7,65 (Bloemraad và cộng sự, 1994) Với các hoá chất tẩy rửa thông thường và môi trường có pH axit, virus dễ dàng bị tiêu diệt Chất tẩy rửa làm giảm lây truyền của virus,

có thể sử dụng ether để phá vỡ vỏ và loại bỏ hạt virus (Benfield và cộng sự, 1992) Virus bị vô hoạt nhanh chóng bởi ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại

1.2.5 Đáp ứng miễn dịch chống lại PRRSV

1.2.5.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Thông thường khi nhiễm virus, cơ thể động vật chống lại bằng cách tiết interferon (INF), các cytokine gây nhiễm để cản trở sự nhân lên và hạn chế sự lan tràn của virus Khi lợn nhiễm PRRSV, hệ thống miễn dịch không chống virus tại chỗ nhiễm, không tiết ra INF - α và các cytokine gây nhiễm Đáp ứng miễn dịch tự nhiên yếu đối với virus PRRS dẫn đến kích thích không hoàn chỉnh đáp ứng miễn dịch qua trung gian

tế bào Bên cạnh đó giảm hoặc triệt tiêu đáp ứng miễn dịch tự nhiên chống virus có thể tăng nguy cơ nhiễm trùng kế phát PRRSV không kích thích cơ thể sản sinh các cytokine gây nhiễm, các cytokine này có vai trò rất quan trọng trong đáp ứng miễn dịch khởi phát đối với các virus gây bệnh đường hô hấp

Kháng thể dịch thể, đặc biệt là kháng thể trung hoà có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống lại PRRS Các kháng thể lưu hành chống lại PRRSV được phát hiện vào các ngày 5 - 7 ở lợn sau nhiễm và có sự biến đổi trong huyết thanh vào ngày 14 sau nhiễm, sau đó giảm xuống tới mức không phát hiện được vào ngày 42 sau nhiễm Nồng độ IgG đạt giá trị tối đa vào khoảng các ngày 21 - 49 sau nhiễm với các kháng thể trung hoà

Những kháng thể xuất hiện sớm nhất là kháng thể trực tiếp kháng lại protein nhân (N), tiếp theo là protein M, sau đến glycoprotein 5 (GP5) (Nelson và cộng sự, 1994) Một protein phi cấu trúc 2 (NSp2) chứa một cụm epitope B không trung hoà và chúng là những protein miễn dịch quan trọng nhất của PRRSV (Oleksiewicz và cộng sự, 2001) Hầu hết các test chẩn đoán chủ yếu phát hiện kháng thể kháng protein N Những kháng thể này xuất hiện trong tuần đầu tiên sau nhiễm trùng và tồn tại trong vài tháng, nhưng không có khả năng bảo vệ cơ thể bị nhiễm virus

Kháng thể trung hoà được phát hiện ổn định vào ngày thứ 28 sau nhiễm hoặc muộn hơn, đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch với PRRSV, và có sự khác nhau trong nhiễm trùng tự nhiên so với tiêm phòng vaccine (Diaz, 2006)

Sự xuất hiện sớm của các kháng thể không trung hoà có thể tác động đáng kể đến

sự tiến triển bệnh của PRRSV Ngoài ra kháng thể không trung hoà làm tăng sự lây nhiễm của virus trong các túi thực bào của các đại thực bào, do tăng quá trình đáp ứng

phụ thuộc kháng thể Đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng thể không trung hoà có

thể tác động mạnh mẽ tới PRRSV thông qua việc thoát vỏ (“cởi áo”) của virus và làm

tăng sự bắt giữ các tiểu phần virus trong các tế bào đại thực bào

1.2.5.2 Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (CMI, cell mediated immunity) cũng vô

cùng quan trọng trong miễn dịch chống lại PRRSV Virus PRRS ngăn cản sự trình

diện kháng nguyên và hoạt hoá tế bào lympho T PRRSV làm giảm đáp ứng miễn

dịch tự nhiên bằng cách thay đổi hình dạng của tế bào thực bào và giảm sự xuất

hiện phân tử trình diện kháng nguyên đi kèm trên bề mặt tế bào đại thực bào trong

việc trình diện kháng nguyên

Những cá thể lợn đang bình phục có sự đáp ứng tăng sinh mạnh mẽ các tế

bào lympho, hiện tượng này không được phát hiện trong 4 tuần sau nhiễm trùng và

cùng với đáp ứng với kháng thể trung hoà (Bautista and Molitor, 1997) Các đáp

ứng có vai trò cytokine, chủ yếu là interferon (IFN - c) và IL - 2 nhưng vai trò

interferon kéo dài ít hơn so với interleukin (Mateu và cộng sự, 2006)

 Sự điều biến và lẩn tránh đáp ứng miễn dịch của PRRSV

Những đặc điểm bất thường của phản ứng thích ứng miễn dịch đối với

PRRSV cho thấy virus có khả năng điều biến mạnh mẽ chống lại đáp ứng miễn

dịch của vật chủ

+ Vai trò interferon: PRRSV tăng nhạy cảm với tác động của IFN type I,

chúng có thể đã kháng lại với những phản ứng của IFN - α Các chủng PRRSV

khác nhau có khả năng tác động khác nhau không chỉ với IFN - α mà còn cả với

INF - α; IL - 10 và IL - 2, trong túi thực bào của các đại thực bào và tế bào tua

(dendritic cells) Sự giảm tiết IFN - α được gây ra do tác động tăng trưởng của một

hiệu ứng đáp ứng miễn dịch của tế bào T hỗ trợ type 1

+ Vai trò Interleukin: IL - 10 có vai trò quan trọng trong điều hoà đáp ứng

miễn dịch với PRRSV Sau nhiễm trùng với PRRSV, hiệu giá của mRNA của IL -

10 đã tăng lên ở các tế bào phế nang phổi của lợn và trong dịch phế quản (Diaz,

2006)

+ Vai trò “tự chết” (apoptosis): Trong sự nhiễm trùng của lợn với PRRSV, các tế bào chết do cơ chế apoptosis đã được tìm thấy rải rác khắp nơi trong các mô

bị nhiễm trùng (bao gồm: phổi, tinh hoàn và các hạch lympho) Phần lớn các tế bào apoptosis đã không bị nhiễm với PRRSV, như vậy rất có thể tế bào chết do apoptosis thông qua tín hiệu chuyển tải PRRSV có khả năng trực tiếp gây ra apoptosis các tế bào

đã tự chết một cách chủ động ở các con lợn bị nhiễm trùng, hoặc gián tiếp thông qua INF - α được giải phóng từ các đại thực bào sau nhiễm PRRSV, tác động gây ra apoptosis trong các tế bào không bị nhiễm trùng bên cạnh Các tế bào tự chết có thể gián tiếp thông qua con đường phụ thuộc AIF (apoptosis inducing factor), sảy ra thứ phát bởi các yếu tố kích ứng apoptosis do nhiễm trùng hoặc bởi các tế bào bên cạnh, chứ không phải là kết quả “đặc trưng” trực tiếp của apoptosis ở tế bào bị nhiễm (Miller

và cộng sự, 2004)

1.2.6 Vật chủ và phương thức truyền lây

Vật chủ: PRRSV chỉ gây bệnh cho lợn, lợn ở tất cả các lứa tuổi đều cảm nhiễm, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả Ngoài ra, lợn rừng cũng mắc bệnh và đây có thể được coi là nguồn dịch thiên nhiên và phát tán bệnh Theo Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO), PRRS được xác định không lây truyền và gây bệnh sang gia súc khác và con người (Rossow,1998)

Đường truyền lây: PRRSV có trong dịch mũi, nước bọt, phân và nước tiểu của lợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trường; tinh dịch của lợn đực giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh Ở lợn nái mang thai, virus có thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh Lợn con nhiễm bệnh và lợn mang trùng có thể đào thải virus ra môi trường trong vòng 6 tháng

Bệnh truyền chủ yếu theo đường không khí, có thể lây trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn ốm, lợn mang trùng với lợn khoẻ và cũng có thể lây gián tiếp qua các nhân

tố trung gian (không khí, đất, nước, thức ăn,…) bị nhiễm virus, virus có khả năng phát tán rộng và dễ gây nhiễm qua đường hô hấp (Cho and Dee, 2006)

1.3 Vai trò của GP5 trong quá trình gây bệnh của PRRSV

Trong số các protein chức năng của PRRSV, protein vỏ GP5 được mã hóa bởi ORF5 của PRRSV GP5 có trọng lượng phân tử khoảng 24 - 25kDa, là một protein

được glycosyl hóa có vai trò bám dính vào thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ GP5 có tính kháng nguyên và có vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh của virus Do vậy, GP5 được coi là protein đích trong nghiên cứu miễn dịch học, chẩn đoán, cũng như các nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống PRRS (Andrea và cộng sự, 2014; Han và cộng sự, 2006; Kumar và cộng sự,2008; Nedzad and Carl, 2010)

Cấu trúc của protein GP5 gồm có khoảng 30 aa đầu N là trình tự tín hiệu của GP5 điều kiển quá trình sản xuất protein vào trong màng lưới nội chất (Thaa và cộng sự, 2013) Tiếp theo là vùng ectodomain (aa 32 ÷ aa 63), trong đó có chứa vùng biến thể cao giữa các chủng PRRSV (aa 32 ÷ aa 40) Sau vùng ectodomain là vùng Transmembrane (aa 64 ÷ aa 134), và kết thúc là vùng endodomain (aa 135 ÷ aa 200) (Hình 1.6) (Nedzad and Carl, 2010) Trong GP 5 có một số vị trí aa được glycosyl hóa

và liên quan tới quá trình hình thành cấu trúc và duy trì hoạt tính của protein GP5 (aa

33, aa 44 và aa 51) (Thaa và cộng sự, 2013)

Hình 1.6 Cấu trúc và chức năng của protein GP5

(Nedzad and Carl, 2010)

Hình 1.7 Protein chức năng của PRRSV

phòng bệnh (Hình 1.9, Hình 1.10) Sự khác nhau của gen ORF5 có thể được phân tích bằng phương pháp sinh học phân tử (Ansari và cộng sự, 2006)

Hình 1.9 RNA PRRSV đột biến tại vùng gen ORF5