Phân lập và giải trình tự đoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS gây bệnh tai xanh trên lợn tại địa bàn tỉnh khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ THỊ NHƢỜNG PHÂN LẬP VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ORF5 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS PRRS GÂY BỆNH TAI XANH TRÊN LỢN TẠI ĐỊA BÀN TỈNH KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ THỊ NHƢỜNG PHÂN LẬP VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ORF5 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS PRRS GÂY BỆNH TAI XANH TRÊN LỢN TẠI ĐỊA BÀN TỈNH KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành đào tạo: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 1149/QĐ – ĐHNT ngày 30/10/2014 Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS VŨ KHẮC HÙNG KHÁNH HÒA- 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: ngƣời trực tiếp tham gia thực nôi dung đề tài: “Phân lập giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng PRRSV gây bệnh tai xanh lợn địa bàn tỉnh Khánh Hòa” Các kết quả, số liệu, hình ảnh trình bày luận văn hoàn toàn trung thực, khách quan Tôi xin cam đoan: giúp đỡ cho việc thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận án đƣợc cảm ơn, thông tin trích dẫn luận án xác đƣợc rõ nguồn gốc Khánh Hòa, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận văn Lê Thị Nhƣờng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài hoàn thành luận án, nhận đƣợc giúp đỡ nhiều tổ chức cá nhân Nhân dịp này, xin cảm ơn Ban lãnh đạo Khoa sau đại học, Viện công nghệ sinh học – Đại học Nha trang, Ban lãnh đạo Phân viện thú y miền Trung tạo điều kiện cho đƣợc theo học chƣơng trình đào tạo Thạc sĩ viện Tôi xin cảm ơn tập thể cán Bộ môn công nghệ sinh học Bộ môn nghiên cứu vi trùng phòng chẩn đoán - Phân viện thú y miền Trung nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành đề tài nghiên cứu Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS Vũ Khắc Hùng - Phân viện thú y miền Trung trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ trình thực đề tài hoàn thành luận án Đồng thời gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cô chú, anh chị Bộ môn công nghệ sinh học Bộ môn nghiên cứu Vi trùng tận tình giúp đỡ, bảo thời gian thực luận án Viện Tôi biết ơn gia đình, bạn bè đóng góp công sức, động viên hoàn thành đề tài nghiên cứu luận án Tôi chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận văn Lê Thị Nhƣờng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC ĐỒ THỊ vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh 1.1.2 Dịch tễ học PRRS 1.1.2.1 Trên giới 1.1.2.2 PRRS Việt Nam .5 1.1.2.3 PRRS Khánh Hòa 1.1.3 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích 1.1.3.1 Triệu chứng .8 1.1.3.2 Bệnh tích .9 1.1.4 Cơ chế sinh bệnh 1.1.5 Chẩn đoán bệnh tai xanh 10 1.1.5.1 Chẩn đoán lâm sàng 10 1.1.5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 11 1.1.6 Điều trị phòng bệnh 12 1.2 Tổng quan PRRSV 13 1.2.1 Phân loại 13 1.2.2 Đặc điểm hình thái cấu trúc 13 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy PRRSV 19 1.2.4 Khả gây bệnh tồn PRRSV 22 1.2.4.1 Khả gây bệnh 22 1.2.4.2 Khả tồn 22 1.2.5 Đáp ứng miễn dịch chống lại PRRSV 23 1.2.5.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể 23 1.2.5.2 Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 24 1.2.6 Vật chủ phƣơng thức truyền lây 25 1.3 Vai trò ORF5 trình gây bệnh PRRSV 25 iii Chƣơng 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Nội dung nghiên cứu 30 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 30 2.3 Đối tƣợng nghiên cứu 30 2.4 Vật liệu nghiên cứu 30 2.4.1 Mẫu bệnh phẩm 30 2.4.2 Động vật thí nghiệm 30 2.4.3 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 31 2.4.3.1 Dụng cụ, trang thiết bị 31 2.4.3.2 Hóa chất 31 2.4.4 Chủng PRRSV đối chứng dƣơng 32 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 2.5.1 Phƣơng pháp thu mẫu xử lý mẫu 32 2.5.2 Phản ứng RT-PCR 33 2.5.2.1 Tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm 33 2.5.2.2 Phản ứng RT-PCR 33 2.5.2.3 Kỹ thuật điện di kiểm tra sản phẩm RT – PCR 35 2.5.3 Phƣơng pháp phân lập PRRSV môi trƣờng tế bào MARC – 145 35 2.5.3.1 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC – 145 35 2.5.3.2 Phƣơng pháp cấy chuyển tế bào MARC – 145 36 2.5.3.3 Phân lập PRRSV môi trƣờng tế bào MARC – 145 36 2.5.4 Giải trình tự phân tích liệu trình tự gen ORF5 39 2.5.4.1 Giải trình tự DNA 39 2.5.4.2 Phân tích liệu trình tự gen ORF5 39 2.5.5 Phƣơng pháp xác định TCID50 PRRSV 39 2.5.6 Phƣơng pháp xác định độc lực PRRSV 40 2.5.7 Phƣơng pháp realtime RT – PCR 42 2.5.8 Phƣơng pháp xử lý số liệu 44 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Kết trình thu mẫu bệnh phẩm 45 3.2 Kết thực hiện phản ứng RT-PCR 45 3.3 Kết phân lập PRRSV môi trƣờng tế bào MARC – 145 46 3.4 Kết giải trình tự phân tích liệu trình tự gen ORF5 51 3.5 Kết xác định TCID50 độc lực PRRSV 55 3.5.1 Kết xác định giá trị TCID50 55 iv 3.5.2 Kết xác định độc lực PRRSV 58 3.5.3 Kết thực phản ứng realtime RT – PCR 61 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 4.1 Kết luận 66 4.2 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT aa : Amino axid (Axit amin) bp : Base pair (Cặp bazơ) CPE : Cytopathic effects (Bệnh lý tế bào) Ct : Cycle threshold (Chu kỳ ngƣỡng) Da : Dalton DNA : Deoxyribonucleic axid (Axit deoxyribonucleic) EAV : Equine arteritis virus (Virus gây viêm động mạch ngựa) EDTA : Ethylene diamine tetraacetic axid (Axit Ethylene diamine tetraacetic) ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Phản ứng hấp phụ miễn dịch liên quan tới enzyme) EMEM: Eagle's Minimum Essensial Medium (môi trƣờng nuôi cấy tế bào) FBS : Fetal Bovine Serum (Huyết bào thai bê) GP : Glycoprotein HP-PRRSV:Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome ( virus tai xanh độc lực cao) IFN : Interferon M : Membrane protein N : Nucleocapsid protein (Protein vỏ nhân) OIE : Organisation of International Epidemiology (Tổ chức Dịch tễ học Thế giới) ORF : Open reading frame (Khung đọc mở) PBS : Phosphate buffer saline (dung dịch muối đệm phosphat) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng trùng hợp chuỗi gen) PRRS : Porcine reproductive and respiratory syndrome (Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn) RNA : Ribonucleic axid (Axit ribonucleic) RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction (Phản ứng PCR ngƣợc) TCID50: Tissue culture infectious dose 50 (Liều gây nhiễm 50% tế bào) vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự nucleotide mồi phản ứng RT – PCR 34 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng RT – PCR/1 ống eppendorf cho PCR 34 Bảng 2.3 Ba chủng PRRSV dùng để gây nhiễm lợn 40 Bảng 2.4 Trình tự nucleotide mồi probe phản ứng realtime RT – PCR 42 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng RT – PCR/1 ống eppendorf cho PCR 43 Bảng 3.3 Kết phân lập PRRSV môi trƣờng tế bào MARC – 145 lần 48 Bảng 3.4 Kết phân lập PRRSV môi trƣờng tế bào MARC – 145 lần 49 Bảng 3.5 Kết ghi nhận tổng số giếng xuất CPE chủng virus NH02 55 Bảng 3.6 Kết ghi nhận tổng số giếng xuất CPE chủng virus NT02 56 Bảng 3.7 Kết ghi nhận tổng số giếng xuất CPE chủng virus VN01 57 Bảng 3.8 Kết xác định giá trị TCID50 PRRSV môi trƣờng tế bào MARC – 145 57 Bảng 3.9 Kết theo dõi nhiệt độ lô lợn thí nghiệm 21 ngày…………59 Bảng 3.10 Kết xác định giá trị Ct 61 vii DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sơ đồ biểu diễn hạt PRRSV 14 Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn tổ chức hệ gen PRRSV 15 Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc protein GP2a, GP3, GP4, GP5 16 Hình 1.4 Sơ đồ biểu diễn trình chép hệ gen PRRSV 17 Hình 1.5 Đại thực bào trƣớc sau bị nhiễm PRRSV 20 Hình 1.6 Cấu trúc chức GP5 PRRSV 26 Hình 1.7 Protein chức PRRSV 27 Hình 1.8 Vai trò GP5 trình bám dính tế bào 27 Hình 1.9 RNA PRRSV đột biến vùng gen ORF5 28 Hình 1.10 Đột biến sảy vùng gen ORF5 hệ gen PRRSV 28 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập PRRSV môi trƣờng tế bào MARC – 145 37 Hình 2.2 Sơ đồ phân nhóm PRRSV theo công ty MJ - Biologics 39 Hình 3.1 Kết RT - PCR phát PRRSV mẫu bệnh phẩm 46 Hình 3.2 Kết so sánh tế bào MARC – 145 sau ngày gây nhiễm mẫu đối chứng âm (a)và NT02 (b) 47 Hình 3.3 Kết so sánh tế bào MARC - 145 sau ngày gây nhiễm đối chứng dƣơng (a) mẫu NT02 (b) 48 Hình 3.4 Kết RT - PCR kiểm tra PRRSV sau phân lập môi trƣờng tế bào MARC – 145 50 Hình 3.5 Kết phân tích mối quan hệ chủng PRRSV dựa trình tự amino axit GP5 công ty MJ - Biologics 53 Hình 3.6 Xác định hiệu giá virus đĩa 96 giếng 58 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn kết theo dõi biến đổi lợn sau 21 ngày gây nhiễm 60 Hình 3.8 Phổi lợn gây nhiễm PRRSV 63 Hình 3.9 Hạch lâm ba bị sƣng, màu nâu vàng có u cục to 64 Hình 3.10 Phổi bị viêm, gan có đốm trắng hoại tử 64 Hình 3.11 Tim sƣng, màng bao tim phổi xuất huyết 64 viii Hình 3.10 Phổi bị viêm, gan có đốm trắng hoại tử Hình 3.11 Tim sƣng, màng bao tim xuất huyết, phổi bị xuất huyết Khi tiến hành mổ khám lợn sau 10 ngày gây nhiễm kết kiểm tra tƣơng tự với kết mô tả Kyoungjin cộng (2003), Yoonvà cộng (2003) Hanchun cộng (2014) Từ kết theo dõi triệu chứng tiến hành kiểm tra mổ khám biểu bệnh tích quan đích khẳng định việc gây nhiễm với liều 2ml/con nồng độ 106 TCID50/ml làm lợn lô thí nghiệm bị nhiễm bệnh tai xanh Ngoài ra, yếu tố môi trƣờng nhƣ nhiệt độ độ ẩm mùa hè nhiễm khuẩn thứ phát đóng góp cho bùng phát dịch tai xanh gây HP – PRRSV (Tian cộng sự, 2007) 64 Chủng D1 (cùng nguồn gốc với JXA1) chủng biến thể thuộc kiểu gen type II PRRSV đƣợc phát Trung Quốc vào tháng năm 2006 nhanh chóng lan sang nƣớc Đông Nam Á sau Dịch bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản xuất lợn trở thành gánh nặng cho ngƣời chăn nuôi lợn khu vực có Việt Nam Đây chủng có độc lực cao, lợn bị nhiễm bệnh có tƣợng sốt cao (40 - 420C) lứa tuổi, gây sảy thai, thai chết lƣu có tƣợng suy hô hấp nhiều cấp độ (OIE, 2010) Đã có nhiều nhóm nghiên cứu khả gây bệnh HP - PRRSV, nhƣng với nhiều kết khác mức độ gây bệnh Trong nghiên cứu này, tiến hành phân lập, giải trình tự phân nhóm chủng PRRSV địa bàn tỉnh Khánh Hòa xác định tất chủng thuộc chủng D1 - có độc lực cao dựa vào trình tự protein GP5 GP5 có đoạn tín hiệu peptide định hƣớng đầu cuối N protein bị glycosyl hóa sau dịch mã từ đến vị trí aa 30, aa 33, aa 44 aa 51 Vị trí đƣợc glycosyl hóa quan trọng cho trình hình thành cấu trúc trì hoạt tính protein GP5 (Thaa cộng sự, 2013; Nedzad and Carl, 2010) GP5 đƣợc biết nhƣ yếu tố kích thích việc sản sinh kháng thể trung hòa lợn vấn đề then chốt miễn dịch dịch thể Những chủng PRRSV mang đột biến loại vùng glycosyl hóa GP5 cho thấy khả kích thích sinh kháng thể trung hòa cao chủng dại Để xác định khả gây bệnh PRRSV, tiến hành tiêm nhóm lợn với chủng PRRSV - D1 mẫu bệnh phẩm có giá trị TCID50 cao với nồng độ 106 TCID50/ml Kết tƣơng tự với kết thí nghiệm Trung tâm nghiên cứu Bệnh Động vật Quốc Gia (Hoa Kỳ) – Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ Nhƣ vậy, kết luận PRRS hội chứng đa yếu tố gây PRRSV yếu tố quan trọng góp phần gây nên tƣợng nhiễm trùng thứ phát khác (Metwally cộng sự, 2010) 65 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận  Khi sử dụng phản ứng RT - PCR để khuếch đại gen ORF5 chủng virus 100 mẫu bệnh nghi ngờ nhiễm PRRSV phát 75/100 mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với PRRSV  Sau kiểm tra kết phân lập phản ứng RT - PCR thấy 100% mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với PRRSV phân lập thành công môi trƣờng tế bào MARC - 145  PRRSV đàn lợn nuôi Khánh Hòa thuộc phân nhóm D1 có nguồn gốc với chủng JXA1  TCID50/ml PRRSV 25 mẫu đại diện dao động từ 4,5lg đến 6,3lg Ở liều gây nhiễm 2ml/ nồng độ 106TCID50/ml, tất nhóm lợn có triệu chứng lâm sàng bệnh tai xanh Sau 21 ngày gây nhiễm tiến hành mổ khám kiểm tra có xuất bệnh tích: lợn sốt cao, phổi bị viêm, sƣng xuất huyết, gan có đốm trắng hoại tử, lách bị xuất huyết, hạch lâm ba bị sƣng có u cục to  Khả gây bệnh dấu hiệu bệnh tích chủng D1 tƣơng tự với chủng JXA1 tiến hành cảm nhiễm động vật chủ 4.2 Kiến nghị  Tiếp tục thí nghiệm dựa kết nghiên cứu để phát triển, sản xuất vaccine tai xanh cho đàn lợn địa bàn tỉnh Khánh Hòa  Tiếp tục kết hợp nghiên cứu trình đồng nhiễm khuẩn nhiễm khuẩn thứ cấp để có biện hỗ trợ việc điều trị phòng chống lây lan dịch 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Trần Thị Thanh Hà, Ken Inui, Phạm Thị Nga, Đặng Xuân Sinh, Trịnh Quang Đại, Trƣơng Anh Đức, Nguyễn Viết Không 2013, “Phản ứng trung hòa virus PRRS nuôi cấy tế bào ứng dụng”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, số 1, tr 27 - 33 Đậu Ngọc Hào, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long, Tiêu Quang An 2008, “Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) lợn từ cuối tháng đến đầu tháng 7/2008 số tỉnh nƣớc”, Khoa học kỹ thuật Thú y 2008, tập XV, số 5, tr 14 – 20 Nguyễn Ngọc Hải 2007, Công nghệ sinh học thú y, NXB Nông Nghiệp, TP.HCM Nguyễn Ngọc Hải, Võ Khánh Hƣng 2010, “Phân tích di truyền số chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn số tỉnh miền Nam Việt Nam dựa ORF7”, Khoa học kỹ thuật thú y, tập XIV, số 1, tr 25 – 33 Huỳnh Thị Mỹ Lệ Nguyễn Văn Giáp 2013, “Phân lập xác định đặc tính sinh học virus Porcine circo type (PCV2) (PCV2) đàn lợn nuôi số tỉnh miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Phát triển 2013, tập 11, số 3, tr 304 – 309 Nguyễn Đức Tân, Vũ Khắc Hùng, Byoung Kwan Kim, Đỗ Văn Khiên, Đỗ Văn Tấn 2015, “Phân lập tuyển chọn số chủng virus tai xanh (PRRSV) độc lực cao để sản xuất vacxin phòng bệnh cho lợn”, Khoa học kỹ thuật Thú y 2015, số 2, tr 24 - 32 Tô Long Thành, Nguyễn Văn Long 2008, “Kết chẩn đoán nghiên cứu virus gây hội chứng sinh sản hô hấp (PRRS) lợn Việt Nam từ tháng 3/2007 đến 5/2008”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, số 5, tr.5 -16 Tô Long Thành 2007, “Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn”, Khoa học Kỹ thuật Thú y tập XIV 2007, số 3, tr 81 – 88 Tài liệu tiếng anh Andrea, L, Jamie, W, Carolyn, A, Susan, ED, Joan, KL, Graham, P, John, CS 2014, “Harding - Variation in Fetal Outcome Viral Load and ORF5 Sequence Mutations in a 67 Large Scale Study of Phenotypic Responses to Late Gestation Exposure to Type Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome”, PLoS One, vol 9, no 4, pp - Ansari, IH, Kwon, B, Oorio, FA and Pattnaik, AK 2006, “Influence of N-linker glycosylation of Porcine reproductive and respiratory synddrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibobies”, J Virol, vol 80, no 8, pp 3994 - 4004 Bautista, EM and Molitor, TW 1997, “Cell-mediated immunity to Porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swine”, Viral Immunol, vol 10, no 2, pp.83 – 94 Benfield, DA, Nelson, E, Collins, JE, Harris, L, Goyal, SM, Robison, D, Christianson, WT, Morrison, RB, Gorcyca, D, Chladek D 1992, “Characterization of Swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR-2332)”, Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, vol 4, no 2, pp 127 – 133 Bloemraad, M, Kluijver, EP, Petersen, A, Burkhardt, GE, Wensvoort, G 1994, “Porcine reproductive and respiratory syndrome: temperature and pH stability of Lelystad virus and its survival in tissue specimens from viraemic pigs”, Veterinary Microbiology, vol 42, no 4, pp, 361 – 371 Cavanagh, D 1997, “Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae”, Arch Virol, vol 142, no.3, pp 629 – 633 Chen, N, Cao, Z, Yu, X 2011, “Emergence of novel European genotype Porcine reproductive and respiratory syndrome virus in mainland China”, Journal of Genral Virology, vol 92, no 4, pp 880 – 892 Cho, JG and Dee, SA 2006, “Porcine reproductive and respiratory syndrome virus”, Theriogenology, Review, pp 655 – 662 Christopher, HJ, Nelson, EA, Nelson, JK, Rebecca, J, Hines, Sines, Sabrinina, L, Swenson, Howa, L, Swenson, Howard, T, Hill, Jeff, J, Zimmerman, Jon, B, Kkatz, Michichael, J, Yael, J, Yaeger, Christopher, CL, Chase, David, A, Benfield 1995, “Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus in boar semen by PCR”, J Clin Microbiol, vol 33, no.7, pp 1730 –1734 68 10 Chung, HK, Choi, C, Kim, J, Chae, C 2002, “Delection and differentiation of North American and European genotypes of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus in formalin-fixed, paraffin - embedded tissues by multiplex reverse transcriptionnested polymerase chain reaction”, J Vet Diagn Invest, vol 14, no 1, pp 56 - 60 11 Diaz, I, Darwich, L, Pappaterra, G, Pujols, J, Mateu, E 2006, “Different Europeantype vaccine against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus have different immunological properties and confer different protection to pigs”, Virilogy, vol 351, no 2, pp 249 - 259 12 Drew, TW 2000, “ A review of evidence for immunosuppression due to Porcine reproductive and respiratory syndrome virus”, Vet Res, vol 31, no 1, pp 27 – 39 13 Faaberg, KS, Hocker, JD, Erdman, MM, Harris, DL, Nelson, EA, Torremorell, M, Plagemann, PG 2006, “Neutralizing antiboddy responses of pigs infected with natural GP5 N-glycan mutants of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus”, Viral Immunology, vol 19, no 2, pp 294 - 304 14 Galliher, BA, Li, X, Bates, JT, Madera, R, Waters, A, Nietfeld, J, Henningson, J, He D, Feng, W, Chen, R, Shi, J 2015, “Pigs immunized with Chinese highly pathogenic PRRS virus modified live vaccine are protected from challenge with North American PRRSV strain NADC-20”, Vaccine, vol 33, no 30, pp 3518–3525 15 Han, J, Wang, Y, Faaberg, KS 2006, “Complete genome analysis of RFLP 184 isolates of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus”, Virus Res J, vol 122, no 1-2, pp 175 - 182 16 Iris, D, Hanne, VG, Jan, VD, Peter, LD, Hans, JN 2010, “Susceptible cell lines for the production of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus by stable transfection of sialoadhesin and CD163”, BMC Biotechnology 2010, vol 10, pp - 12 17 Jay, GC, David, ES, Shelly, LS, Rika, J, Ramasamy, MM, Robert, GA, Siao-Kun, WW 2007, “CD163 Expression Confers Susceptibility to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Viruses”, J Virol, vol 81, no 14, pp 7371 - 7379 18 Karniychuk, UU, Geldhof, M, Vanhee, M, Van Doorsselaere, J, Saveleva, TA, Nauwynck, HJ 2010, “Pathogensis and antigenic characterization of a new East 69 European subtype Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate”, BMC Vet Res, vol 6, 10.1186/1746-6148-6-30 19 Kim, KJ, Fahad, AM, Shanmukhappa, K, Kapil, S 2006, “Defining the Cellular Target(s) of Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus Blocking Monoclonal Antibody 7G10”, J Virol, vol 80, no.2, pp 689 – 696 20 Kim HS, Kwang, GJ, Yoon, IJ, Joo, HS, Frey, ML 1993, “Enhanced replication of Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogenous subpopulation of MA-104 cell line”, Arch Virol vol.133, no - 4, pp 477 - 483 21 Klaas, D, Julio, P, Sherrilyn, W, Christopher, H, Sergei K 2011, “Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virulence jumps and persistent circulation in Southeast Asia”, Focus on, 5-2011, pp - 22 Kumar, S, Dudly J, Nei, M, Tamura, K 2008, “MEGA: A biologist - centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences”, Briefings in Bioinformatics, vol 9, no 4, pp 299 - 306 23 Lopez, OJ, Oliveira, MF, Garcia, EA, Kwon, BJ, Doster, A, Osorio, FA 2007, “Protection against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection through pasive transfer of PRRSV – neutralizing antibodies is dose dependent”, Clin Vaccine Immunol, vol 14, no 3, pp 260 – 275 24 Lee, C, Kim, H, Kang, B, Yeom, M, Han, S, Moon, H, Park, S, Kim, H, Song, D, Park,B 2010, “Prevalence and phylogentic analysis of the isolated type I Porcine reproductive and respiratory syndrome virus from 2007 to 2008 in Korea”, Virus Gens, vol 40, no 2, pp 225 - 23 25 Li, Y, Wang, X, Jiang, P, Chen,W, Wang, X 2008, “Gentic analysis of two Porcine reproductive and respiratory syndrome viruses with different virulence isolated in China”, Archives of Virology, vol 153, no 10, pp 1877 - 1884 26 Lei, Z, Xiaorong, Y, Yuan T, Shuoyan, Y, Gang, G, Xinna, G, Xin, G, Hanchun, Y 2014, “Gentic diversity analysis of genotype Porcine reproductive and respiratory syndrome viruses emerging in recent years in China”, BioMed Research International, vol 2014, no 2014, pp - 10 70 27 Mateu, E, Diaza, I, Drwich, L, Casal, J, Martín, M, Pujols, J 2006, “Evolution of OFR5 of Spanish Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains 1991 to 2005”, Virus Res.J, vol 115, no.2, pp 198 - 206 28 Meng, X, Paul, PS, Halbur, PG, Morozov, I 1995, “Sequence comparison of open reading frames to of low and high virulence United States isolates of porcine Porcine reproductive and respiratory syndrome virus”, Journal of Genral Virology, vol 76, no.12, pp 3181 - 3188 29 Metwally, S, Mohamed, F, Faaberg, K, Burrage, T, Prarat, M, Moran, K, Bracht, A, Mayr, G,Berninger, M, Koster, L, To, TL, Nguyen, VL, Reising, M, Landgraf, J, Cox, L, Lubrothand, J, Carrillo, C (2010), “Pathogenicity and Molecular Characterization of Emerging Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus in Vietnam in 2007”, Transboundary and Emerging Diseases, vol 57, no.3, pp 315 – 329 30 Meulenberg, JJ, Petersen den, BA, Kluyver, E, Nieuwasadt, VA, Wensvoort, G, Moormann, RJ 1997, “Molecular characterization of Lelystad virus”, Vet Microbiol, vol 75, no - 4, pp 197 – 202 31 Meulenberg, JJ 2000, “PRRSV, the virus”, Vet Res, vol 31, no 1, pp 11 - 21 32 Miller, LC and Fox, JM 2004, “Apoptosis and Porcine reproductive and respiratory syndrome virus”, Vet Immunol Immunopothol, vol 102, no 3, pp 131 - 142 33 Nedzad, M and Carl, AG 2010, “The role of Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus structural and non-structural proteins in virus pathogensis”, Animal Health Research Reviews, vol 11, no 2, pp 135 – 163 34 Nelson, EA, Christonpher, HJ, Benfield, DA 1994, “Serum immuni Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus”, J Vet Diagn Invest, vol 6, no.4, pp 410 – 415 35 OIE 2013, PRRS control in the region, pp - 36 OIE Terrestrial Manual 2010, Chapter 2.8.7, VeZrsion adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2010 porcine reproductive and respiratory syndrome, pp 2.6.7 71 37 Oleksiewicz, MB, Botner, A, Toft, P, Normann, P, Storggard, T 2001, “Epitope mapping Porcine reproductive and respiratory syndrome virus by phage display: the nsp fragment of the replicase polyprotein contains a cluster of B-cell epitopes”, J Virol, vol 75, no.7 pp 3277 – 3290 38 Ostrowski, M, Galeota, JA, Jar, AM, Platt, KB, Osorio, FA, Lopez, OJ 2002, “Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the Porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain”, J Virol, vol 76, no 9, pp 4241 4250 39 Priscilla, FG, Kevin, ON, Olajide, O, Chong, W, Karen, H, Jianqiang, Z, Patrick, GH, Lei, Z, Xiang-Jin, M, Tanja, O 2013, “Comparison of Commercial Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays for Reliable, Early, and Rapid Detection of Heterologous Strains of Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus in Experimentally Infected or Noninfected Boars by Use of Different Sample Types”, J Clin Microbiol, vol 51, no 2, pp 547 - 556 40 Rossow, KD 1998, “Porcine Reproductive and Respriratatory Syndrome”, J Vet Pathol, vol 35, no.1, pp 1-20 41 Steven, BK, Susan, KS, Sang-Myeong, L, Sandy, W, Wayne, C 2005, “Dale Polson Simultaneous detection of North American and European Porcine reproductive and respiratory syndrome virus using real-time quantitative reverse transcriptase PCR”, Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, vol 17, no 2, pp 165-170 42 Suarez, P, Diaz, GM, Prieto, C, Esteban, M, Castro, JM, Nieto, A, Ortin, J 1996, “Open reading frame of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus as a cause of virus-induced apaptosis”, J Virol, vol 70, no 5, pp 2876-2882 43 Suarez, P 2000, “Ultrastructural pathogensis of the PRRS virus”, Vet Res, vol 31, no 1, pp 47 - 55 44 Thaa, B, Sinhadri, BC, Tielesch, C, Krause, E, Veit, M 2013, “Signal Peptide Cleavage from GP5 of PRRSV: A Minor Fraction of Molecules Retains the Decoy Epitope, a Presumed Molecular Cause for Viral Persistence”, PLoS ONE, vol 8, no 6, e65548 72 45 Tian, K, Yu, X, Zhao, T 2007, “Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark”, PLoS ONE, vol 2, no 6, Article ID e526 46 Tong, GZ, Zhou, YJ, Hao, XF, Tian, ZJ, An, TQ, Qiu, HJ 2007, “Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, China”, Emerg Infect Dis, vol 13, no.9, pp 1434 –1436 47 Tony LG, Edwin, CH, Ronald, MW, Gail S 2000, “Genetic, geographical and temporal variation of Porcine reproductive and respiratory syndrome me virus in Illinois”, Journal of General Virology, vol 81, no.1, pp 171–179 48 Xiuling, Y, Nanhua, C, Xiaoyu, D, Zhen, C, Wei, H, Dongmei, H, Jiajun, W, Shuo, Z, Baoyue, W, Xiaoxue, G, Kegong, T 2013, “Genomic Sequencing Reveals Mutations Potentially Related to the Overattenuation of a Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus”, Clin Vaccine Immunol, vol 20, no 4, pp 613 - 619 49 Yoon, KJ, Christopher, H J, Nelson, EA 2003, chapter 7: Diagnosis of PRRS Virus, PRRS Compendium Producer Edition, pp 58 – 62 50 Yoon, IJ, Joo, HS, Goyal, SM, Molitor, TW 1994, “A modified serum neutralization test for the detection of antibody to Porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swine sera”, J Vet Diagn Invest, vol 6, no 3, pp 289 – 292 51 Zhou, YJ, Hao, XF, Tian, ZJ 2008, “Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged in China”,Transboundary and Emerging Diseases, vol 55, no 3-4, pp 152–164 Tài liệu webside http://www.mjbio.com/index.php https://www.pig333.com/prrs/highly-pathogenic-prrs-hp-prrs-in- asia_9333/#comments http://www.prrscontrol.com/wps/portal/hipra/prrscontrol/prrs-knowledge/prrs- diagnosis http://field-prrs.blogspot.com/2011_02_01_archive.html 73 http://vietbao.vn/vi/Suc-khoe/Da-tim-ra-thu-pham/30173412/248/ http://www.vjol.info/index.php/kk-ty/article/viewFile/8301/7734 74 PHỤ LỤC Phụ lục Nội dung Số trang Phụ lục Điện di kiểm tra DNA sản RT – PCR Phụ lục Điện di kiểm tra DNA sản RT – PCR để thu sản phẩm DNA gel Phụ lục Kết thu mẫu trình nghiên cứu đề tài Phụ lục Lựa chọn chủng giải trình tự -1- 1 Phụ lục Điện di kiểm tra DNA sản RT – PCR  Thành phần giếng điện di Thành phần giếng điện di (µl) Tên hóa chất Chỉ thị (M) HindIII (0,5 µg/µl) Các giếng mẫu sản phẩm Sản phẩm RT – PCR Loading Dye Tổng thể tích 1 10  Chế độ điện di Môi trƣờng : TBE 1X Cƣờng độ dòng diện (I): 400 mA Hiệu điện : 110 volt Thời gian : 30 phút Phụ lục 2.Điện di kiểm tra DNA sản RT – PCR để thu sản phẩm DNA gel  Thành phần giếng điện di Tên hóa chất Thành phần giếng điện di (µl) Chỉ thị (M) HindIII (0,5 µg/µl) Sản phẩm RT – PCR Loading Dye Tổng thể tích 45 50  Chế độ điện di Môi trƣờng Các giếng mẫu sản phẩm : TBE 1X Cƣờng độ dòng diện (I): 400 mA Hiệu điện : 110 volt Thời gian : 45 phút -2- Phụ lục 3: Kết thu mẫu trình nghiên cứu đề tài Bảng 3.1 Kết thu mẫu thời gian nghiên cứu Địa điểm thu mẫu Số lƣợng mẫu Cam Lâm (CL) 16 Diên Khánh (DK) 17 Ninh Hòa (NH) 20 Nha Trang (NT) 18 Vạn Ninh (VN) 29 Tổng số mẫu -3- 100 Phụ lục 4: Lựa chọn chủng giải trình tự Bảng 3.2 Các chủng PRRSV đƣợc lựa chọn chủng giải trình tự Chủng Stt Chủng Mã hóa Stt Virus Mã hóa Virus NH02 T2 15 NH13 T15 NT02 T3 16 NH19 T16 NT18 T4 17 NH15 T17 NT02-2 T5 18 NT01-2 T18 VN01 T6 19 NT14 T19 CL01 T7 20 NT06 T20 DK01 T8 21 NT08 T21 DK05 T9 22 NH18 T22 NT21 T10 23 NT03 T23 10 DK08 T11 24 NT15A T24 11 NT07 T12 25 NH16 T25 12 NT06 T13 26 NH12 T26 13 NT02 T14 27 TB27 T27 14 TB8 T1 -4- [...]... hiểm và đặc biệt nghiêm trọng trên lợn và gây thiệt hại không nhỏ cho ngƣời chăn nuôi Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định đặc tính di truyền của các chủng PRRSV trên địa bàn Khánh Hòa với mục đích cụ thể: xác định sự có mặt của PRRSV lƣu hành trên lợn nuôi tại Khánh Hòa; phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của các chủng PRRSV phân lập đƣợc; kiểm tra sự biến đổi và phân nhóm các chủng PRRSV;... và kiểm tra độc lực của các chủng PRRSV phân lập đƣợc trên lợn tỉnh Khánh Hòa  Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Việc giải trình tự đoạn gen ORF5 sẽ là cơ sở để có thể kết luận mối quan hệ và sự sai khác của chủng virus lƣu hành trên tỉnh Khánh Hòa với một số chủng trƣớc đó tại Việt Nam và một số chủng trên thế giới Hơn nữa, kết quả đề tài sẽ khảo sát và phân nhóm chính xác PRRSV lƣu hành tại. .. gây bệnh tai xanh trên lợn tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa nhằm chẩn đoán bệnh, áp dụng các biện pháp khống chế và khoanh vùng dịch tễ  Mục tiêu của đề tài - Xác định sự có mặt của PRRSV lƣu hành trên lợn nuôi tại Khánh Hòa - Phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 từ các chủng PRRSV phân lập đƣợc Kiểm tra sự biến đổi, phân nhóm các chủng PRRSV này 2 - Xác định hiệu giá virus (TCID50 - Tissue... 5) của PRRSV từ các mẫu bệnh phẩm thu đƣợc trên đàn lợn nuôi tại tỉnh Khánh Hòa Các phƣơng pháp thực hiện bao gồm: thu mẫu; tách chiết và khuếch đại đoạn gen ORF5 bằng kỹ thuật RT – PCR, phân lập các chủng trên môi trƣờng tế bào MACR 145 Dựa trên những phƣơng pháp trên, chúng tôi đã phát hiện và phân lập đƣợc 75 chủng PRRSV từ 100 mẫu bệnh phẩm đuợc thu ở Khánh Hòa Dữ liệu trình tự nucleotide của đoạn. .. giải mã gen kháng nguyên ORF5 của PRRSV lƣu hành hiện nay là thực sự cần thiết Ngoài ra, dữ liệu gen và hiểu biết di truyền học về gen ORF5 sẽ giúp cho việc nghiên cứu sản xuất và lựa chọn vaccine phù hợp với chủng PRRSV đang lƣu hành Xuất phát từ yêu cầu trên, dƣới sự hƣớng dẫn của T.S Vũ Khắc Hùng tôi đã chọn đề tài: Phân lập và giải trình tự đoạn gen ORF5 của các chủng PRRSV gây bệnh tai xanh trên. .. chủ yếu sảy ra vào mùa đông và mùa xuân ở các tỉnh phía nam (OIE, 2013) 7 1.1.2.3 PRRS tại Khánh Hòa Ngày 25/6/2007 chủng HP - PRRSV lần đầu tiên đƣợc phát hiện trên đàn lợn nuôi tại ở tỉnh Khánh Hòa Theo báo cáo của Chi cục Thú y Khánh Hòa, từ giữa tháng 7 năm 2010, trên địa bàn các huyện Khánh Vĩnh, Ninh Hòa và thành phố Nha Trang đã xuất hiện dịch tai xanh Đến nay, dịch đã sảy ra tại 1.158 hộ gia... định hiệu giá virus (TCID50 - Tissue culture infectious dose 50) và kiểm tra đƣợc độc lực của các chủng PRRSV phân lập Kết quả nghiên trong đề tài này làm cơ sở khoa học cho việc lựa chọn loại vaccine phòng bệnh PRRS phù hợp riêng cho lợn nuôi tại Khánh Hòa Trong bài luận này đã nêu rõ các nội dung thực hiện chính để đạt đƣợc mục tiêu của đề tài bao gồm: phân lập và giải trình tự đoạn gen ORF5 (open reading... y tỉnh Khánh Hòa) Để ngăn chặn đại dịch có thể sảy ra thì việc sử dụng loại vaccine phòng bệnh tai xanh phù hợp đối với chủng PRRSV lƣu hành tại địa bàn là lựa chọn tốt nhất đối với các nhà chăn nuôi Việc lựa chọn loại vaccine phù hợp dựa trên việc phân tích cấu trúc phân tử của các chủng PRRSV lƣu hành Bộ gen của PRRSV gồm có 7 ORF (ORF - open reading frame), mã hoá cho các thành phần khác nhau của. .. cao: gây nhiễm và chết nhiều lợn Ngƣời và các động vật khác không mắc bệnh khi nhiễm PRRS, do PRRS có tính đặc hiệu gây bệnh theo loài rất cao Tuy nhiên, các loài thuỷ cầm chân màng và vịt trời (mallard duck) lại mẫn cảm với virus PRRSV có thể nhân lên ở các loài động vật này, và đây là nguồn lây lan mầm bệnh trên diện rộng và rất khó khống chế Cơ chế chính xác của sự sao chép và dịch mã của PRRSV... nhập lợn giống từ Mỹ Virus này nhanh chóng lây lan trong đàn lợn cả nƣớc Ở nƣớc ta, chủng PRRSV thuộc nhóm Bắc Mỹ VR - 2332 xuất hiện từ năm 2007 Tới năm 2012, nƣớc ta đã có mặt đầy đủ cả 2 chủng PRRSV Năm 2007, virus từ mầm bệnh thu đƣợc tại các ổ dịch qua xét nghiệm là PRRSV type II, có tính tƣơng đồng cao với các chủng gây bệnh tại Trung Quốc và là 1 một chủng mới đột biến gần đây Sự xuất hiện của chủng ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ THỊ NHƢỜNG PHÂN LẬP VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ORF5 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS PRRS GÂY BỆNH TAI XANH TRÊN LỢN TẠI ĐỊA BÀN TỈNH KHÁNH HÒA LUẬN VĂN... phát từ yêu cầu trên, dƣới hƣớng dẫn T.S Vũ Khắc Hùng chọn đề tài: Phân lập giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng PRRSV gây bệnh tai xanh lợn địa bàn tỉnh Khánh Hòa nhằm chẩn đoán bệnh, áp dụng biện... 2.5.3.3 Phân lập PRRSV môi trƣờng tế bào MARC – 145 36 2.5.4 Giải trình tự phân tích liệu trình tự gen ORF5 39 2.5.4.1 Giải trình tự DNA 39 2.5.4.2 Phân tích liệu trình tự gen ORF5