Xác định độc lực của các chủng PRRSV phân lập đƣợc trên mẫu bệnh phẩm theo phƣơng pháp thƣờng qui của Bộ môn nghiên cứu siêu vi trùng (Nguyễn Đức Tân và cộng sự, 2015). Động vật thí nghiệm là lợn 4 - 6 tuần tuổi, khỏe mạnh, đã đƣợc xét nghiệm âm tính PRRSV và kháng thể kháng PRRSV bằng phƣơng pháp ELISA và realtime RT – PCR. Lợn thí nghiệm thuộc giống Landrace Đan Mạch là một giống lợn cao sản có nguồn gốc từ Đan Mạch. Để xác định độc lực của các chủng PRRSV phân lập đƣợc, chúng tôi tiến hành kiểm tra độc lực của virus phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp tiêm truyền động vật chủ. Từ kết quả xác định TCID50 lựa chọn 03 chủng có kết quả TCID50 cao nhất và tiến hành tiêm truyền trên lợn.
Bảng 2.3. Ba chủng PRRSV dùng để gây nhiễm trên lợn. STT Chủng virus TCID50/ml
1 NH02 6,3lg
2 NT02 6,2lg
41
Trong thí nghiệm này, sử dụng 16 lợn (4 - 6 tuần tuổi), tất cả lợn đã đƣợc kiểm tra hàm lƣợng kháng thể trong máu lợn trƣớc khi gây nhiễm bằng phƣơng pháp ELISA. Lợn có hiệu giá kháng thể âm tính với kháng nguyên của PRRSV mới sử dụng làm thì nghiệm. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau:
- Lô thí nghiệm: bao gồm 12 con chia làm 3 nhóm, mỗi nhóm 4 con đƣợc sử dụng cho việc tiêm truyền 3 chủng PRRSV có giá trị TCID50 cao nhất: nhóm 1 tiêm chủng TB – 8; nhóm 2 tiêm chủng NH02, nhóm 3 tiêm chủng VN01, nhóm 4 tiêm chủng NT02 (trình bày trong bảng 2.3).
- Lô đối chứng dƣơng: 4 con, đƣợc sử dụng cho việc tiêm truyền chủng PRRSV đối chứng dƣơng – TB8 (tiến hành chia ngẫu nhiên).
Thời gian tiến hành: ngày 18/5/2015 đến ngày 8/6/2015, tiến hành tiêm truyền cho cả 2 lô lợn thí nghiệm với liều 2ml/con ở nồng độ 106 TCID50/1ml (Xiuling và cộng sự, 2013). Tất cả lợn đƣợc nuôi dƣỡng, chăm sóc trong điều kiện giống nhau và tách nuôi riêng từng nhóm lợn. Sau khi gây nhiễm tiến hành theo dõi các triệu chứng đặc trƣng. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành theo dõi quá trình biến đổi thân nhiệt của lợn sau gây nhiễm làm triệu chứng biểu hiện cụ thể. Sử dụng nhiệt kế điện tử để đo nhiệt độ cơ thể của lợn thông qua đo nhiệt độ trực tràng của lợn, quá trình đƣợc thực hiện và ghi chép hàng ngày (Galliher và cộng sự, 2105; Xiuling và cộng sự, 2013).
Từ kết quả giá trị TCID50, lựa chọn 3 chủng có giá trị TCID50 cao nhất và sử dụng chủng TB - 8 làm mẫu gây nhiễm đối chứng dƣơng. Mỗi chủng virus sử dụng 4 con lợn để tiến hành gây nhiễm, theo dõi, ghi nhận triệu chứng lâm sàng mỗi ngày. Phƣơng pháp kiểm tra độc lực của PRRSV dựa trên phƣơng pháp của Tô Thành Long. (2008) và Xiuling và cộng sự. (2013).
Tiến hành lấy máu động mạch cổ vào ngày thứ 7, 14, 21 (kể từ ngày gây nhiễm). Mẫu máu đƣợc chắt huyết thanh và lƣu giữ ở - 200C cho tới khi thực hiện thí nghiệm tiếp theo. Chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 2 lợn trong mỗi nhóm để lấy máu để thực hiện phản ứng realtime RT – PCR.
42
Sau 21 ngày gây nhiễm tiến hành mổ khám đối với những lợn đƣợc xác định dƣơng tính với PRRSV ở ngày thứ 21 sau khi gây nhiễm. Kết quả của lợn dƣơng tính với PRRSV đƣợc xác định bằng phản ứng realtime RT – PCR.
2.5.7. Phản ứng realtime RT - PCR
Mục đích
Xác định mẫu máu dƣơng tính với PRRSV trong quá trình theo dõi trên lợn với liều tiêm 2ml/con ở nồng độ 106 TCID50/1ml.
Tiến hành
Tiến hành tách chiết RNA tổng số trong tất cả các mẫu máu thu từ nhóm lợn trong lô thí nghiệm bằng bộ kit QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN), quy trình thực hiện nhƣ mô tả ở phần 2.5.2.1. RNA đƣợc bảo quản ở - 200
C cho tới khi thực hiện phản ứng realtime RT - PCR.
Cặp mồi và mẫu dò sử dụng cho phản ứng realtime RT - PCR theo Steven và cộng sự, (2005) và đƣợc trình bày ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Trình tự nucleotide của các mồi và probe trong phản ứng realtime RT – PCR (Steven và cộng sự, 2005).
Tên mồi và probe Trình tự (5’-3’) Nồng độ
Mồi F7 ATG ATG RGC TGG CAT TCT 20µM
Mồi R7 ACA CGG TCG CCC TAA TTG 20µM
Probe FAM - TGT GGT GAA TGG CAC TGA TTG ACA - BHQ1 6µM
Trình tự mồi và vị trí bắt cặp trên vùng ORF7 của PRRSV, vùng gen đƣợc khuếch đại bởi mồi F7 và R7 ở đầu 3’ chƣa đƣợc dịch mã của gen ORF7. Vị trí của cặp mồi và mẫu dò trên hệ gen của PRRSV lần lƣợt là 15.257 ÷ 15.274 và 15.307 ÷ 15.330. Phản ứng realtime RT - PCR thực hiện bằng bộ kit One Step RT - PCR kit trên máy Biorad IQ5. Chu trình nhiệt của phản ứng gồm các giai đoạn sau: 1) 500C trong 30 phút, 950C trong 15 phút; 2) 40 chu kỳ của 950C trong 10 giây, 600C trong 50 giây. Kết quả
43
thực hiện đƣợc hiển thi trên máy tính. Các thành phần phản ứng realtime RT – PCR đƣợc trình bày ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng realtime RT - PCR/1 ống eppendorf cho PCR.
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc tinh khiết (free RNA) 10,5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5X buffer 5,0 MgCl2 1,2 dNTP 0,8 Mồi xuôi F7 0,5 Mồi ngƣợc R7 0,5 Probe 0,5 Enzyme mix 1,0 Khuôn RNA tổng số 5,0 Tổng thể tích 25
Kết quả đƣợc kết luận dƣơng tính dựa trên giá trị ngƣỡng (Ct - cycle threshold) hiển thị trên đồ thị khuếch đại và theo phƣơng pháp chẩn đoán của Priscilla và cộng sự. (2012). Theo Priscilla và cộng sự. (2012), mẫu chẩn đoán có thể sử dụng là mẫu huyết thanh hoặc mẫu mô, kết quả thể hiện qua giá trị Ct: nếu Ct < 29,9 đƣợc cho là mẫu bị nhiễm PRRSV nặng; nếu Ct trong khoảng từ 30 đến 34,9 là dƣơng tính với PRRSV ở mức độ trung bình; từ 35 đến 36,99 là dƣơng tính với mức độ nhiễm nhẹ; nếu giá trị Ct trong khoảng từ 37,00 đến 40 âm tính với PRRSV. Quá trình thực hiện tại phòng chẩn đoán - Phân viện thú y miền Trung.
44
2.5.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập đƣợc, xử lý theo phƣơng pháp thông dụng bằng phần mềm Excell.
45
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả quá trình thu mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm đƣợc thu từ lợn có triệu chứng bệnh lý nhƣ: lợn sảy thai, thai chết lƣu, lợn ho kèm sốt cao lờ đờ, bỏ ăn có triệu chứng sƣng và viêm khớp, tai bầm tím (ở lợn mọi lứa tuổi). Mẫu bệnh phẩm đƣợc thu bao gồm: phổi, amiđan, hạch, lá lách, dịch tràn phổi và huyết thanh, trong đó dịch tràn phổi và huyết thanh của lợn ở mọi lứa tuổi đƣợc coi là ƣu tiên hàng đầu cho việc thu mẫu bệnh phẩm để phục vụ cho quá trình phân lập PRRSV (OIE, 2010).
Trong thời gian nghiên cứu chúng tôi nhận đƣợc 100 mẫu bệnh phẩm nghi ngờ bị bệnh tai xanh ở tại ổ dịch, bao gồm cả các nuôi theo phƣơng thức trang trại và phƣơng thức hộ gia đình trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa từ Chi Cục thú y tỉnh Khánh Hòa. Địa điểm thu mẫu bao gồm Nha Trang (NT), Diên Khánh (DK), Vạn Ninh (VN) , Ninh Hòa (NH), Cam Lâm (CL). Trong 100 mẫu bệnh phẩm đó có 37/100 mẫu huyết thanh và 63/100 mẫu hạch amiđan, lá lách và phổi. Sau đó tất cả các mẫu bệnh phẩm đƣợc xử lý và bảo quản ở nhiệt độ - 800C cho tới khi thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Bảng kết quả thu mẫu đƣợc trình bày ở bảng 3.1 (phụ lục 3).
3.2. Kết quả thực hiện phản ứng RT - PCR
PCR là phƣơng pháp đƣợc phát triển để phát hiện PRRSV trong các mẫu bệnh phẩm mà không cần phải đƣợc phân lập trên nuôi cấy tế bào. So với phƣơng pháp phân lập trên tế bào và các phƣơng pháp huyết thanh học khác thì phƣơng pháp PCR cho phép phát hiện sớm PRRSV có trong mẫu bệnh phẩm.
Mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm PRRSV sau khi đƣa về phòng thí nghiệm đƣợc xử lý và tách chiết RNA tổng số bằng bộ kit “QIAamp Viral Mini Kit” (QIAGEN). Quy trình tách chiết đƣợc tiến hành đúng theo quy trình của nhà sản xuất. RNA sau khi tách chiết đƣợc bảo quản ở - 800C cho tới khi thực hiện cho phản ứng RT - PCR.
Chúng tôi đã sử dụng phản ứng RT - PCR nhằm khuếch đại gen ORF5 để phát hiện các chủng PRRSV trong mẫu bệnh phẩm thu thập đƣợc. Cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT - PCR là Go3F và Go5R để phát hiện gen ORF5 có kích thƣớc sản phẩm là 720bp. Các bƣớc tiến hành phản ứng RT - PCR nhƣ đã mô tả ở phần vật liệu và phƣơng
46
pháp nghiên cứu. Sau khi thực hiện phản ứng RT - PCR, sản phẩm của phản ứng RT - PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1%, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả RT - PCR phát hiện PRRSV từ các mẫu bệnh phẩm.
Ghi chú: Giếng M: Thanh marker DNA chuẩn (1000bp) Giếng P: Mẫu đối chứng dương (PRRSV TB - 8) Giếng N: Mẫu đối chứng âm
Giếng 1-18: Các mẫu bệnh phẩm
Kết quả ghi nhận đƣợc 75 mẫu dƣơng tính với PRRSV trên 100 mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm PRRSV. Sản phẩm của phản ứng RT - PCR có kích thƣớc khoảng 720 bp (Hình 3.1), kết quả này phù hợp với kết quả của nhóm nghiên cứu (Tony và cộng sự, 2001) khi cùng sử dụng cùng cặp mồi Go3F và Go5R. Theo Tony và cộng sự (2001), RNA của các chủng virus của họ thu thập đƣợc từ mẫu bệnh phẩm thu tập từ bang Illinois và miền đông bang Iowa, Hoa Kỳ đa số của PRRSV thuộc chủng Bắc Mỹ. Gen ORF5 đƣợc khuếch đại bằng phản ứng RT - PCR và có kích thƣớc là 720 bp. Nhƣ vậy, bƣớc đầu có thể kết luận 75 mẫu dƣơng tính với PRRSV. Từ kết quả này tiến hành phân lập các chủ ng dƣơng tính trên môi trƣờng tế bào MARC - 145.
3.3. Kết quả phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC - 145
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy PRRSV là một loại virus rất khó phân lập. Trong phạm vi phòng thí nghiệm, PRRSV chỉ có thể nhân lên trong hai loại tế bào đó là đại thực bào phế nang của lợn (PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ có nguồn gốc Châu Phi (MA - 104, MARC - 145, và CL - 2621). Tuy nhiên,
M P N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
720 bp 500bp
47
dòng tế bào MARC - 145 đƣợc khuyến cáo là dòng tế bào phù hợp và tốt hơn cho việc phân lập PRRSV nhất là chủng PRRSV thuộc dòng Bắc Mỹ (OIE, 2010; Klaas và cộng sự, 2011). Tế bào MARC - 145 có thể đƣợc dùng để phân lập 11 nhóm PRRSV khác nhau của hai dòng virus Châu Âu và Bắc Mỹ. Đối với chủng HP - PRRSV của Việt Nam và Trung Quốc có khả năng thích ứng rất cao với dòng tế bào MARC - 145 và là dòng tế bào đang đƣợc sử dụng nhiều nhất hiện nay (Kim và cộng sự, 2005). Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào MARC - 145 để tiến hành phân lập PRRSV từ mẫu bệnh phẩm đƣợc kết luận dƣơng tính với PRRSV bằng phản ứng RT - PCR.
Sau 2 – 3 ngày gây nhiễm trên bề mặt tế bào xuất hiện một số mẫu bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào gây nhiễm. Sau 4 ngày gây nhiễm xuất hiện nhiều cụm tế bào nhiều hơn và bắt đầu quan sát thấy hiện tƣợng CPE trên bề mặt tế bào (Hình 3.2b; Hình 3.3b). Hiện tƣợng này là do trong quá trình nhân lên trong tế bào MARC - 145, PRRSV sẽ phá hủy, làm cho tế bào co lại thành múi, lồi lên khỏi bề mặt và tạo những vết trống (CPE). Điều này có thể dễ dàng quan sát thấy dƣới kính hiển vi soi ngƣợc (độ phóng đại 10X). Kết quả tƣơng tự khi quan sát lớp tế bào gây nhiễm bằng chủng đối chứng dƣơng (Hình 3.3a). Kết quả này tƣơng tự với quá trình phân lập PRRSV trên dòng tế bào MARC - 145 theo mô tả của Nedzad and Carl. (2010). Kết quả sau khi phân lập có 75/75 mẫu xuất hiện hiệu ứng CPE. Tuy nhiên, mức độ gây độc tế bào có sự khác nhau. Cụ thể, khi quan sát mẫu đối chứng dƣơng và mẫu NT02 trên kính hiển vi sau 4 ngày gây nhiễm: lớp tế bào xuất hiện CPE trên mẫu đối chứng dƣơng rõ ràng hơn so với mẫu NT02.
48
Hình 3.2. Kết quả so sánh tế bào MARC - 145 sau 4 ngày gây nhiễm của mẫu đối chứng âm (a) và của mẫu NT02 (b).
Hình 3.3. Kết quả so sánh tế bào MARC - 145 sau 4 ngày gây nhiễm của mẫu đối chứng dƣơng (a) và mẫu NT02 (b). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi phân lập virus trên môi trƣờng tế bào, virus có thể gây bệnh tích tế bào chậm ở lần gây nhiễm đầu tiên, ở lần gây nhiễm tiếp theo khả năng gây bệnh tích tế bào nhanh hơn (Li và cộng sự, 2008). Do đó, chúng tôi tiến hành thu dịch tế bào đối với các mẫu đã gây nhiễm lần 1 và gây nhiễm lần 2 trên môi trƣờng tế bào MARC - 145 để so sánh khả năng gây bệnh tích tế bào giữa 2 lần gây nhiễm. Kết quả 2 lần gây nhiễm đƣợc thể hiện ở bảng 3.2 và bảng 3.3.
Qua bảng 3.3 và bảng 3.4 cho thấy: ở lần gây nhiễm lần thứ 1 tất cả các mẫu đều xuất hiện CPE nhƣng chỉ có 1/3 trong tổng số mẫu gây nhiễm đạt trên 70% thậm chí trong đó còn có những mẫu chỉ đạt 10 ÷ 30% tế bào sau 7 ngày gây nhiễm. Kết quả quan sát hiện tƣợng CPE trong lần gây nhiễm thứ 2 hoàn toàn khác với lần gây nhiễm thứ nhất: 75/75 giếng gây nhiễm 75 mẫu virus đạt CPE trên 70%. Kết quả này phù hợp với mô tả của Li và cộng sự. (2008).
Bảng 3.3. Kết quả phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC – 145 lần 2.
Tỷ lệ tế bào xuất hiện CPE sau 7 ngày (%)
Kết quả C.P.E < 10% 10 - 30% 30 - 50% 50 - 70% > 70%
49 0 mẫu 8 mẫu + 15 mẫu + 27 mẫu + 25 mẫu +
Bảng 3.4. Kết quả phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC – 145 lần 2.
Tỷ lệ tế bào xuất hiện CPE sau 7 ngày (%)
CPE < 10% 10 - 30% 30 - 50% 50 - 70% > 70% 0 mẫu 0 mẫu 0 mẫu 0 mẫu 75 mẫu +
PRRSV xâm nhập vào tế bào bằng con đƣờng nhập nội tế bào qua trung gian receptor vimentin. Ngƣời ta đã xác định vimentin (1 loại intermediate filament protein) là thụ thể bề mặt và là một yếu tố quan trọng trong việc ổn định cấu trúc của tế bào MARC – 145. Theo Kim và cộng sự (2005), quá trình gây nhiễm của PRRSV cũng có thể bị ngăn chặn bằng cách sử dụng các loại kháng thể đơn dòng kháng vimentin (Kim et al, 2005). Nhƣ vậy, lần gây nhiễm thứ 1 quá trình gây bệnh tích tế bào diễn ra chậm (Bảng 3.3). Đối với lần gây nhiễm lần thứ hai, sau 7 ngày gây nhiễm tỷ lệ CPE của tất cả các chủng virus đều trên 70%. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu trƣớc đây (Iris và cộng sự, 2010; Li và cộng sự, 2008). Điều này có thể giải thích là do, ở lần gây nhiễm thứ nhất số lƣợng tế bào còn quá thấp và sự thích nghi của virus đối với tế bào chƣa cao (Iris và cộng sự, 2010).
50
Sau 2 lần gây nhiễm, chúng tôi phân lập đƣợc 75 chủng virus trên tế bào MARC – 145 (Bảng 3.4). Các chủng virus này đã đƣợc kiểm tra lại bằng phản ứng RT - PCR với cặp mồi Go3F và Go5F và thành phần phản ứng đƣợc mô tả phần 2.5.2.2. Kết quả sau điện di ghi nhận 75/75 các mẫu thu đƣợc đều dƣơng tính với PRRSV. Các chủng virus sau phân lập đƣợc thu lại và bảo quản ở - 800C cho tới khi thực hiện phản ứng tiếp theo. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR, kiểm tra kết quả phân lập virus thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Kết quả RT - PCR kiểm tra PRRSV sau phân lập trên môi trƣờng tế bào MARC - 145.
Ghi chú: Giếng M: Thanh marker DNA chuẩn (1000bp) Giếng +: Mẫu đối chứng dương (PRRSV TB-8). Giếng 1 - 8: Các chủng virus sau phân lập.
Theo nhận định của Kim và cộng sự (2005): tế bào MARC - 145 là dòng tế bào nhạy cảm với PRRSV nên thích hợp cho việc phân lập virus này. Theo Klaas và cộng sự (2011), có thể phân lập PRRSV từ mẫu huyết thanh, phổi, dịch lỏng khoang phúc mạc, hạch ạch huyết và amiđan. Nhƣ vậy, kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả công bố