2.4.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu nghiên cứu là mẫu mô và mẫu huyết thanh đƣợc thu thập trên lợn nghi ngờ nhiễm bệnh tai xanh đƣợc nuôi theo phƣơng thức hộ gia đình và trang trại.
2.4.2. Động vật thí nghiệm
Lợn 4 - 6 tuần tuổi, khỏe mạnh, không nhiễm PRRSV, không có kháng thể kháng PRRSV. Mẫu huyết thanh đƣợc kiểm tra tại phòng chẩn đoán - Phân viên thú y miền Trung.
31
2.4.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 2.4.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị 2.4.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị
- Bộ điện di DNA (Bio - Rad, American).
- Tủ cấy (CLASS II, type A2, ESCO, Singapore). - Kính hiển vi điện tử (CKX41, OLYMPUS, Japan). - Lò vi sóng (EM - S5597W, SANYO, Japan).
- Máy PCR (Mastercycler proS, Eppendorf, Germany). - Máy realtime RT - PCR (iQ5, Biorad, USA ).
- Máy ly tâm lạnh (H36 ZK, HERMLE Labortechnik, Germany). - Máy soi gel (XR, Bio - Rad, USA).
- Máy khuấy từ (MS300HS, MISUNG, Korea). - Máy vortex (MS2, IKA, USA).
- Nồi hấp tiệt trùng ( HV - 85, Hirayama, Japan). - Tủ lạnh -200C ( HITACHI, Thailand).
- Tủ lạnh -800C (SANYO, Japan). - Tủ ấm CO2 (SANYO, Japan).
- Bộ pipetman (10µl, 20µl, 100µl, 200µl, 1000µl) và đầu côn các loại, lọ đựng môi trƣờng, chai nuôi cấy tế bào loại 25cm2
, 75cm2, đĩa 24 giếng và đĩa 96 giếng, lọc kích thƣớc 45µm…
2.4.3.2. Hóa chất
Hóa chất, môi trƣờng trong nghiên cứu - Agarose (Promega, USA).
- EDTA 0,5M, pH = 8 (Promega, USA).
- Ethanol 96% (Merck KgaA, Darmstadt, Germany). - HEPES 100ml (Gibco, USA).
- Huyết thanh bào thai bê (FBS) (Gibco, USA). - PBS 1X.
- Trypsin - EDTA (1X, 0.25%) (Gibco, USA). - Na2CO3 (Sodium cacbonate).
- Bộ kit SuperScript One step RT - PCR with Platinum Tap (Invitrogen, USA). - Các loại hóa chất dùng cho phản ứng PCR.
32
- Cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT – PCR, realtime RT – PCR, probe: Go5F Go3R; F7 và R7 (Integrated DNA Technologies, Coralville - Iowa, American). - Bộ kit tách RNA tổng số “QIAamp Viral RNA Mini Kit” (QIAGEN, Germany). - Kit tinh sạch sản phẩm PCR (QIAGEN, Germany: QIAquick PCR Purification Kit). - Môi trƣờng E’MEM (đã bổ sung 3% L - Glutamin, 0,5% HEPES buffer, 1%
kháng sinh Peni - Strept) (Gibco, USA). - Các loại hóa chất xử lý, vô hiệu hóa virus.
Các dung dịch dùng trong điện di trên thạch agarose. - Dung dịch đệm TBE 1X.
- Đệm tra mẫu (loading dye 6X): 0,25% bromophenol blue, 0,25% xylen cyanol FF, 30% glycerol.
- Dung dịch nhộm gel: ethidium bromide (EtBr, 0,5 mg/ml).
2.4.3.3. Chủng PRRSV đối chứng dƣơng
Chủng PRRSV TB - 8 lƣu giữ tại Phân viện Thú y miền Trung đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng dƣơng.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.5.1 Phƣơng pháp thu mẫu và xử lý mẫu
Phƣơng pháp thu mẫu thực hiện theo OIE. (2010). Mẫu bệnh phẩm đƣợc thu tại các ổ dịch PRRS, các mẫu đƣơc lƣu trữ tại Chi cục thú y Khánh Hòa và Phân viện thú y miền Trung.
Lợn nghi mắc bệnh tai xanh ở các đàn lợn nuôi trên toàn tỉnh Khánh Hòa đƣợc tiến hành lấy máu và mẫu phủ tạng. Mẫu máu đƣợc lấy ở tĩnh mạch tai hoặc tĩnh mạch cổ vào lúc 7 - 8 giờ sáng trƣớc khi cho lợn ăn. Sau khi lấy máu, giữ cố định xilanh máu để tránh vỡ hồng cầu và chuyển về phòng thí nghiệm trƣớc khi tiến hành tách huyết thanh.
Mẫu máu đƣợc ủ ở 37oC trƣớc khi tách huyết thanh. Huyết thanh đƣợc tách bằng cách ly tâm ở tốc độ 2.500 vòng/phút trong 5 phút. Huyết thanh sau khi tách đƣợc hút vào eppendorf vô trùng và bảo quản ở -80ºC.
33
Mẫu phủ tạng đƣợc nghiền nhỏ với cát vô trùng trong PBS 1X (1 gam mẫu bệnh phẩm nghiền trong 10ml PBS). Sau đó mẫu đƣợc ly tâm ở 5.000 vòng/phút trong 15 phút. Dịch nổi đƣợc hút vào eppendorf vô trùng và bảo quản ở -80ºC.
2.5.2. Phản ứng RT - PCR
2.5.2.1. Tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm
Tách chiết RNA tổng số từ những mẫu bệnh phẩm nghi ngờ dƣơng tính với PRRSV bằng bộ kit QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN). Thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất với các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
- Bƣớc 1: hút 560µl Buffer AVL - carrier RNA trong tube 1,5ml sạch.
- Bƣớc 2: thêm 140µl dịch mẫu bệnh phẩm đã qua xử lý vào ống tube có chứa sẵn AVL, trộn đều trên máy vortex trong 15 giây, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút. - Bƣớc 3: thêm 560µl ethanol 100% vào và vortex nhanh trong 15 giây.
- Bƣớc 4: hút chuyển 630µl hỗn hợp sang cột có màng lọc (QIAamp Mini column), ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 1 phút, bỏ dịch.
- Bƣớc 5: chuyển 630µl hỗn hợp còn lại sang cột và thực hiện nhƣ bƣớc 4.
- Bƣớc 6: thêm 500µl buffer AW1 vào, ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 1 phút, bỏ dịch.
- Bƣớc 7: thêm 500µl buffer AW2 vào, ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/ phút trong 3 phút. Bỏ dịch và ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/ phút trong 1 phút để lể làm khô hoàn toàn màng lọc.
- Bƣớc 8: chuyển cột thu ở bƣớc 7 vào một ống effendoft 1,5 ml sạch, thêm 60µl buffer AVE, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 1 phút, thu dịch. Bảo quản mẫu RNA ở nhiệt độ -80oC.
2.5.2.2. Phản ứng RT - PCR
Mục đích
Thu nhận một lƣợng lớn các phân tử DNA của vùng gen ORF5, sản phẩm RT- PCR với cặp mồi đặc hiệu, làm nguyên liệu cho quá trình điện di kiểm tra kích thƣớc sản phẩm RT-PCR để phát hiện các chủng PRRSV trong 100 mẫu bệnh phẩm nghi ngờ dƣơng tính với PRRSV.
34
Tiến hành:
Thực hiện chuỗi phản ứng RT - PCR nhân đoạn gen ORF5 với mẫu RNA tổng số thu nhận ở trên, sử dụng cặp mồi Go3F và Go5R để nhân đoạn gen ORF5 bằng bộ kit RT - PCR one step (invitrogen), trình tự cặp mồi nhƣ ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các mồi trong phản ứng RT - PCR
(Tony và cộng sự, 2001).
Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’- 3’) Tm (0C) Nồng độ sử dụng Độ dài của sản phẩm thu đƣợc Go3F GAGACCATGAGGTGGGCAAC 58,2 10µM 720bp Go5R CGCCAAAAGCACCTTTTGT 54,6 10µM Các thành phần phản ứng RT - PCR đƣợc trình bày ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng RT - PCR/ 1 ống eppendorf cho PCR. Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc tinh khiết (free RNA) 6,0
2X Reaction 12,5
Mồi xuôi Go3F 0,5
Mồi ngƣợc Go5R 0,5
Enzyme mix 0,5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khuôn RNA tổng số 5,0
Tổng thể tích 25
Phản ứng RT - PCR thực hiện trên máy luân nhiệt Model Techne TC - 512 với chu trình nhiệt của phản ứng gồm các giai đoạn sau: 1) 500C trong 15 phút, 950C trong 2 phút, 1 chu kỳ của 950C trong 10 giây, 620C trong 30 giây, 680C trong 30 giây, 1 chu
35
kỳ của 950C trong 10 giây, 600C trong 30 giây, 680C trong 30 giây, 1 chu kỳ của 950C trong 10 giây, 580C trong 30 giây, 680C trong 30 giây, cuối cùng ở 250C trong 10 giây. Kích thƣớc trình tự DNA mục tiêu của sản phẩm RT - PCR là 720bp. Sản phẩm sau điện di đƣợc bảo quản ở 40C.
2.5.2.3. Kỹ thuật điện di kiểm tra sản phẩm RT - PCR
- Mục đích: kiểm tra kích thƣớc DNA sản phẩm RT - PCR.
- Tiến hành: thực hiện điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 1% bằng bộ điện di DNA (Bio - Rad), đọc kết quả trên máy soi gel (Phụ lục 1).
2.5.3. Phƣơng pháp phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC - 145
Để tiến hành phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC - 145, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy dựa trên mô tả của OIE. (2010) và kết hợp theo quy trình phân lập virus ở mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với PRRSV đƣợc chuẩn hóa theo quy trình nghiên cứu thƣờng qui của Bộ môn nghiên cứu siêu vi trùng - Phân viện thú y miền Trung.
2.5.3.1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC - 145
MARC - 145 thuộc nhóm tế bào biểu mô và là loại tế bào dòng có nguồn gốc từ tế bào MA - 104. MA - 104 là những tế bào dòng ở đời 104 có nguồn gốc từ tế bào thai thận khỉ châu Phi. Các dòng tế bào này phát triển tốt ở 370C, 5% CO2 trong môi trƣờng nuôi cấy DMEM hoặc E’MEM có bổ sung 10% FBS (Lei và cộng sự, 2013).
Tế bào MARC - 145 đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng trong ở nhiệt độ -196ºC, sau khi lấy ra khỏi môi trƣờng nitơ lỏng MARC - 145 đƣợc làm ấm ở nhiệt độ phòng cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đó hút 1ml tế bào MARC - 145 chuyển vào bình 25cm2
có chứa 10ml môi trƣờng E’MEM (10% FBS). Dùng pipet 10ml đảo nhẹ để hỗn hợp đồng nhất, lắc nhẹ bình 25cm2 để các tách rời các tế bào.
Quan sát tế bào dƣới kính hiển vi, nếu các tế bào đã tách rời nằm rải rác trong môi trƣờng, không bám thành cụm thì đem nuôi cấy tế bào ở 37ºC, 5% CO2. Sau 48 giờ nuôi cấy, quan sát tế bào nếu tế bào đã mọc đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành 1 lớp thì có thể dùng để cấy chuyển hoặc gây nhiễm PRRSV.
36
2.5.3.2. Phƣơng pháp cấy chuyển tế bào MARC - 145.
Cấy chuyển tế bào đƣợc thực hiện khi tế bào đã mọc dầy bề mặt nuôi cấy, các bƣớc thực hiện quá trình cấy chuyển nhƣ sau:
- Bƣớc 1: hút bỏ môi trƣờng trong bình nuôi cấy. Rửa lớp tế bào bằng 5 ml PBS 1X. - Bƣớc 2: hút 1ml trypsin 0,05% vào bình nuôi cấy, ủ bình trong tủ ấm ở 37ºC, 5%
CO2 trong 10 phút để trypsin thực hiện phiện phản ứng cắt tách các tế bào thành những tế bào đơn.
- Bƣớc 3: cấy chuyển tế bào MARC - 145 sang 2 bình 25cm2
mới và đĩa 24 giếng. Cấy chuyển tế bào MARC - 145 sang 2 bình 25cm2 mới: hút 20ml môi trƣờng E’MEM bổ sung 10% FBS, dùng pipet đồng nhất sau đó chia đều cho 2 bình 25cm2.
Cấy chuyển tế bào MARC - 145 sang đĩa 24 giếng: hút 24ml môi trƣờng E’MEM bổ sung 10% FBS, dùng pipet đồng nhất sau đó chia mỗi giếng 1ml. Quan sát dƣới kính hiển vi, nếu tế bào chƣa đều thì gõ nhẹ bình hoặc đĩa đến khi tế bào tách thành từng tế bào đơn nằm rải rác trong môi trƣờng.
- Bƣớc 4: nuôi cấy tế bào ở điều kiện 37ºC, 5% CO2. Sau 48 giờ, bình 25cm2đƣợc sử dụng cho quá trình cấy chuyển tiếp theo. Đĩa 24 giếng đƣợc sử dụng cho quá trình gây nhiễm PRRSV.
2.5.3.3. Phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC - 145
PRRSV đƣợc phân lập dựa theo phƣơng pháp (OIE, 2010) và đƣợc chuẩn hóa theo sơ đồ trình bày ở hình 1.
Phƣơng pháp xử lý mẫu bệnh phẩm trƣớc gây nhiễm
Trƣớc khi gây nhiễm, mẫu bệnh phẩm đã xử lý đƣợc ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó dịch nổi đƣợc lọc qua màng lọc 0,45µm trƣớc khi gây nhiễm trên môi trƣờng tế bào MARC - 145.
37 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phƣơng pháp gây nhiễm virus lần thứ nhất
Quá trình gây nhiễm virus đƣợc thực hiện trên đĩa 24 giếng đã nuôi cấy tế bào MARC - 145, quá trình gây nhiễm đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: - Bƣớc 1: hút bỏ môi trƣờng cũ ở ở các giếng (thao tác trên đĩa tế bào MARC -
145).
- Bƣớc 2: hút 100µl mẫu bệnh phẩm đã đƣợc xử lý (đã đƣợc lọc qua màng lọc 0,45µm), nhỏ từng giọt thật nhẹ nhàng lên trên bề mặt tế bào MARC - 145. Sau đó mẫu đƣợc ủ ở 37ºC, 5% CO2 trong 1 giờ.
Mẫu bệnh phẩm Xử lý mẫu
Gây nhiễm virus lần 2 Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hàng ngày trong 7 ngày
Gây nhiễm virus lần 1
Có bệnh tích tế bào Không có bệnh tích tế bào
Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào
hàng ngày trong 7 ngày Không thu hoạch dịch tế bào Thu hoạch dịch tế bào
RT-PCR Thu hoạch dịch tế bào
Bảo quản ở -80ºC
Ghi nhận kết quả phân lập ƣợc
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC - 145.
38
- Bƣớc 3: bổ sung 1ml môi trƣờng E’MEM (5% FBS) vào mỗi giếng có chứa tế bào đã đƣợc nhiễm virus. Lƣu ý thao thao tác thật nhẹ nhàng tránh làm rách lớp tế bào MARC - 145 bám đầy bề mặt nuôi cấy.
- Bƣớc 4: ủ ở 37ºC, 5% CO2, theo dõi và ghi nhận bệnh tích hàng ngày trong 7 ngày. Đối với những giếng xuất hiện bệnh tích chậm cần quan sát kỹ và tiến hành thu hoạch dịch tế bào nuôi cấy khi xuất hiện dấu hiệu bệnh tích.
Phƣơng pháp gây nhiễm PRRSV lần thứ hai
Các bƣớc thực hiện gây nhiễm lần thứ hai tƣơng tự lần gây nhiễm thứ nhất, chỉ thay mẫu bệnh phẩm bằng dịch tế bào (đã đƣợc xử lý sau thu hoạch) ở lần gây nhiễm thứ nhất.
Phƣơng pháp thu hoạch dịch tế bào
Sau khi theo dõi và ghi nhận kết quả gây nhiễm PRRSV trong hai lần gây nhiễm. Tiến hành thu toàn bộ dịch nuôi PRRSV và tế bào bị xâm nhiễm sau đó trữ ở nhiệt độ - 20oC. Đông tan từ 2 đến 3 lần, sau đó ly tâm 15.000rpm/10 phút. Thu phần dịch nổi chứa virus để sử dụng cho các mục đích tiếp theo.
Phản ứng RT - PCR
- Mục đích: kiểm tra kết quả phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC - 145, sản phẩm DNA của phản ứng RT - PCR làm nguyên liệu cho quá trình giải trình tự gen.
- Tiến hành: các bƣớc thực hiện, thành phần, cặp mồi sử dụng, chu trình nhiệt nhƣ đƣợc mô tả ở trên (phần 2.5.2.2).
- Điện di DNA sản phẩm RT - PCR: thực hiện điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 1,2% bằng bộ điện di DNA (Bio - Rad), đọc kết quả trên máy soi gel. Các bƣớc thực hiện đƣợc mô tả ở phụ lục 2.
- Sản phẩm DNA trên gel agarose đƣợc thu hồi và đƣợc tinh sạch bằng bộ kit tinh sạch gel QIAquick PCR Purification Kit – Qiagen
2.5.4. Giải trình tự và phân tích dữ liệu trình tự gen ORF5 2.5.4.1. Giải trình tự DNA 2.5.4.1. Giải trình tự DNA
Sản phẩm DNA của phản ứng RT - PCR sau khi tinh sạch bằng bộ kit tinh sạch gel QIAquick PCR Purification Kit - Qiagen (quy trình tinh sạch theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất) đƣợc gửi tới công ty Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự gen.
39
2.5.4.2. Phân tích dữ liệu trình tự gen ORF5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định nguồn gốc của các chủng PRRSV dựa trên cơ sở gen ORF5 của các chủng thu nhận đƣợc bằng phƣơng pháp phân nhóm của công ty MJ - Biologic Hoa Kỳ. Theo MJ - Biologics, PRRSV đƣợc phân loại dựa trên đặc tính miễn dịch của virus. Các chủng PRRSV đƣợc phân làm 24 nhóm, trong đó các chủng Bắc Mỹ có nhóm D và nhóm S (16 nhóm), chủng Châu Âu đƣợc phân làm 8 nhóm và theo sơ đồ hình 2.3.
Hình 2.2. Sơ đồ phân nhóm PRRSV theo công ty MJ - Biologics
(http://www.mjbio.com/index.php).
2.5.5. Phƣơng pháp xác định TCID50 của PRRSV
Mục đích: Xác định hiệu giá virus (liều gây nhiễm 50% tế bào).
Tiến hành: quá trình xác định giá trị TCID50 đƣợc thực hiện trên môi trƣờng E’MEM bổ sung 5% FBS, các bƣớc thực hiện đƣợc mô tả nhƣ sau:
- Bƣớc 1: chuẩn bị một đĩa tế bào 96 giếng, tế bào đã phát triển đầy bề mặt dụng cụ nuôi cấy.
- Bƣớc 2: dùng 1 đĩa 96 giếng mới để pha loãng virus cần chuẩn độ.
+ Dãy A: pha loãng ở nồng độ 10-1 (pha trong 10 giếng, mỗi giếng 200µl V sau pha loãng).
+ Dãy B: pha loãng ở nồng độ 10-2 (pha trong 10 giếng, mỗi giếng 200µl V sau pha loãng).
40
- Bƣớc 3: hút chuyển 100µl mỗi giếng ở mỗi dãy nồng độ pha loãng vào dãy tƣơng ứng trên đĩa tế bào.
- Bƣớc 4: nuôi trong tủ ấm 370
C, 5% CO2, trong khoảng 5 - 7 ngày. - Bƣớc 5: theo dõi, kiểm tra hàng ngày.
- Bƣớc 6: đọc kết quả đối với những giếng có bệnh tích.
Giá trị TCID50/0,1ml theo phƣơng pháp của Spearman Karber (Huỳnh Thị Mỹ Lệ và Nguyễn Văn Giáp, 2013).
LogTCID50 = (X0 + d/2) – d x ∑(ri/n) (2.1) Trong đó:
X0: là log của bậc pha loãng cao nhất. d: là log của bậc pha loãng.
ri: là số giếng tế bào âm tính ở mỗi bậc pha loãng.
n: là số giếng tế bào đƣợc gây nhiễm ở mỗi bậc pha loãng.