Cấu trúc hạt
Hạt virus hình khối đa diện có cấu trúc đối xứng 20 mặt, đƣờng kính khoảng 45 - 70nm, chứa nhân nucleocapsid (gồm lõi RNA và capsid do nhiều capsome tạo thành) có đƣờng kính khoảng 30 - 35nm và đƣợc bao bọc ngoài cùng bởi một lớp vỏ bọc dính chặt với các cấu trúc bề mặt của virus giống nhƣ tổ ong, vỏ có chứa lipid. Lúc tế bào nhiễm virus dƣới kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy một đám lớn các hạt virus tập hợp lại với nhau tạo các thể bao hàm (quần thể, hay là cụm virus).
14
Hình 1.1. Sơ đồ biểu diễn của hạt PRRSV.
(Nedzad and Carl, 2010).
Axit nucleic
PRRSV có cấu trúc RNA mạch đơn dƣơng, có đƣờng kính 40 - 70nm, có vỏ bọc, kích thƣớc genome dài khoảng 15kb (Kim và cộng sự, 2005), đƣợc bắt đầu bằng vùng không mã hóa (đầu 5’) và kết thúc bằng vùng không mã hoá (đầu 3’) trong đó có chuỗi poly A, mã hoá cho 7 khung đọc mở (ORF) lồng vào nhau, cấu trúc tƣơng tự các ORF của Coronavirus. Khi phân tích hệ gen PRRS ngƣời ta thấy rằng các khung đọc mở (ORF) lồng vào nhau từ 1 - 253 bp (Cavanagh, 1997).
Độ dài các gen hoàn toàn khác nhau giữa PRRS dòng châu Âu và Bắc Mỹ phản ánh chênh lệch di truyền và mức độ tƣơng đồng kháng nguyên giữa các chủng thuộc 2 dòng này. Trong cùng một dòng Bắc Mỹ, các gen mã hoá cho các protein chức năng (ORF2 - 7) có độ dài gần nhƣ nhau, nhƣng có độ khác nhau về kích thƣớc và thành phần gen mã hoá cho RNA - polymerase (ORF1a và ORF1b). Đặc điểm gen và hệ gen này là yếu tố ảnh hƣởng đến độc lực của virus PRRS mới xuất hiện gần đây ở Trung Quốc từ cuối năm 2006 (Zhou và cộng sự, 2008) và có lẽ xâm nhập vào Việt Nam đầu năm 2007 (OIE, 2013). Sự xuất hiện và lan toả của PRRS độc lực cao (Highly Pathogenic – HP – PRRSV, là chủng biến thể của VR - 2332) ở Trung Quốc, Việt
15
Nam và và một số nƣớc Nam Á, và đa nhiễm trộn lẫn các dòng PRRS trên thế giới sẽ làm phức tạp hoá dịch tễ học và vaccine phòng chống (Zhou và cộng sự, 2008).
Hình 1.2. Sơ đồ biểu diễn tổ chức hệ gen của PRRSV.
(Phani, 2010).
Bộ gen của PRRSV gồm có 7 ORF (ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7). Trong đó, ORF1 đƣợc chia làm 2 phần ORF1a và ORF1b, chiếm tới khoảng 80% tổng số độ dài hệ gen của virus, chịu trách nhiệm mã hóa RNA thông tin tổng hợp các enzyme RNA polymerase của virus. Đầu 3’ của ORF1a đƣợc lồng vào đầu 5’ của ORF1b bởi 16 nucleotide. Tại đầu cuối ORF1a có chuỗi gen gồm 7 nucleotide (UUUAAAC) tạo thành một vòm (loop), và cấu trúc này đƣợc coi là rất cần thiết cho quá trình sao chép và biểu hiện gen của ORF1b theo cơ chế chuyển đổi khung ribosome (Hình1.2) (Meulenberg và cộng sự, 1997). Nhƣ vậy, chuỗi gen của ORF1a ngoài nhiệm vụ tổng hợp nên protein còn chịu trách nhiệm là chuỗi gen điều hoà quá trình tổng hợp của ORF1b. ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7 là các phần gen tạo nên khung đọc mở mã hoá các protein tƣơng ứng, đó là GP2 (glycoprotein 2), GP3, GP4, GP5 (hay còn gọi là glycoprotein vỏ (E, envelope)), protein màng M (Membrane protein), và protein cấu trúc capsid N (nucleocapsid protein) (Meulenberg và cộng sự, 1997). Các protein đƣợc glycosyl hóa là: GP2, GP3, GP4, GP5, và các protein không đƣợc glycosyl hóa là M và N. Glycosyl hoá (glycosylation) là hiện tƣợng gắn thêm hydratcarbon vào một vị trí amino axit xác định là Asparagine (N) theo quy luật N - (X) - S/T, trong đó N: Asparagine, X: bất kỳ (trừ Proline), S/T: hoặc Serine hoặc
16
Threonine. Tuy nhiên chỉ có 3 ORF có ý nghĩa quan trọng trong định danh virus, đó là ORF 5, 6 và 7 quy định tổng hợp các protein tƣơng ứng: glycoproteins envelope (protein GP5) 25kDa, matrix (M) 19kDa và nucleocapsid (N) 15kDa. Đây là những protein cấu trúc quan trọng nhất, chúng chiếm 90 - 95% lƣợng protein cấu trúc của virus.
Hình 1.3. Sơ đồ một số protein GP2a, GP3, GP4, GP5 của PRRSV
17
H
ì
Hình 1.4. Sơ đồ biểu diễn quá trình sao chép hệ gen của PRRSV
(Nedzad and Carl, 2010).
Protein N là một protein nhỏ (15kDa) và có tính kiềm cao, điều này có thể giúp nó tƣơng tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA. Protein N hiện diện ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm PRRSV và chiếm từ 85% lƣợng protein của phân tử virus. Hiện nay protein N đƣợc dùng nhƣ là một kháng nguyên để phát hiện kháng thể trong huyết thanh của lợn. Protein M có trọng lƣợng phân tử khoảng 18kDa. Mặc dù chức năng của nó đƣợc biết rất ít nhƣng nó đƣợc xem nhƣ có vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M - GP5 để kết hợp với thụ thể trên tế bào đích (Delputte và cộng sự, 2001). Protein GP5 có trọng lƣợng phân tử khoảng 25kDa, chiếm 15% tổng lƣợng protein của virus, là nguyên nhân gây ra hiện tƣợng apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện thụ thể trên tế bào đích (Nathalie và cộng sự, 2003). Qua phân tích gen và theo dõi sự thay đổi trình tự Nu của các dòng PRRS, ngƣời ta đã xác định rằng ở dòng Châu Mỹ, các ORF7 và 6 có tính ổn định rất cao, chúng gần nhƣ không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của dòng virus
18
này. Tuy nhiên, sự khác biệt giữa dòng virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2 ORF này là rất rõ, chẳng hạn sự tƣơng đồng về trình tự axit amin của ORF7 giữa 2 dòng virus này chỉ vào khoảng 57 - 59% và của ORF6 là 70 - 81%. Trong khi đó, khung đọc mở ORF5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng 1 dòng Bắc Mỹ và chỉ tƣơng đồng với dòng Châu Âu khoảng 51-60%. Sự tƣơng đồng về trình tự axit amin quy định do các khung đọc mở ORF2, 3 và 4 giữa các dòng Bắc Mỹ và Châu Âu tƣơng ứng chỉ ở từ 63,58% và 68% (Nguyễn Ngọc Hải., 2007).
Trong các tế bào bị nhiễm virus PRRS, có tất cả 6 RNA thông tin (mRNA) đƣợc tổng hợp, tất cả 6 mRNA đều chứa trình tự sắp xếp chung nhận đƣợc từ đầu 5' của hệ gen RNA trong gen và tất cả chúng đều có gắn thêm đuôi 3' polyA (Nedzad and Carl, 2010).
Chức năng của các ORF
- ORF1a và 1b mã hoá protein enzyme RNA polymerase có chức năng xúc tác sao chép và tổng hợp nhƣ các RNA polymerase của các virus RNA khác.
- ORF2 đến ORF6 mã hoá cho các protein kết hợp với màng của virus, trong đó đã xác định:
+ Envelope glycoprotein (E, ORF5) có trọng lƣợng phân tử từ 24 - 25kDa là protein liên kết vỏ bọc kết hợp glycogen. Các kháng thể trung hoà chủ yếu liên kết trực tiếp với các epitope có trên bề mặt của protein GP5, do vậy virus có thể bị trung hoà (Nelson và cộng sự, 1994). Những epitope trung hoà này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá. Ngƣời ta cũng thấy rằng phân tử GP4 và protein M cũng chứa các epitope trung hoà (Meulenberg và cộng sự, 1997) và phân tử GP3 cũng chứa một epitope trung hoà. Mặc dù vậy, những protein này có tác dụng kích thích miễn dịch và sinh học nhỏ hơn đáng kể so với protein GP5 (Cancel và cộng sự, 2004).
+ Membrane protein: (M, ORF6) có khối lƣợng phân tử khoảng 18 - 19kDa, không đƣợc glycosyl hoá, là protein liên kết vỏ bọc, mang tính kháng nguyên và có tính bảo tồn cao nhất. Protein M có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cấu trúc protein M của các virus thuộc nhóm Coronavirus. Protein M hình thành cầu nối disunfit với glycoprotein 5 (GP5) cấu thành một phần virus và đƣợc tìm thấy trong tế bào nhiễm nhƣng cầu nối sunfit này không cấu thành nên hạt virus (Meulenberg và cộng sự, 1997).
19 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Nucleocapsid protein (N, ORF7) có khối lƣợng phân tử khoảng 14 - 15kDa, đây là protein vỏ bọc nhân, có tính kháng nguyên cao. Protein N chiếm khoảng 20 - 40% protein của hạt virus.
Phân tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hoá do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gen (Cho and Dee, 2006). Sự khác biệt về kiểu gen đƣơng nhiên sẽ liên quan đến sự khác biệt về kiểu hình và nhƣ vậy có thể dựa vào đặc điểm gen để chẩn đoán dòng virus và ngƣợc lại. Nhƣ vậy, trên cơ sở về kiểu gen, dịch tễ học phân tử cho phép xác định chính xác bản đồ dịch tễ của một căn bệnh, quá trình xuất hiện, phát triển của PRRSV (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nghiên cứu virus ở mức độ phân tử còn cho phép xác định đƣợc khả năng sản xuất và sử dụng virus nhƣợc độc để làm vaccine. Ngƣời ta đã ghi nhận nhiều trƣờng hợp bệnh tai xanh trở nên trầm trọng hơn sau khi đàn lợn đƣợc tiêm vaccine PRRSV nhƣợc độc vì cấu trúc gen của virus nhƣợc độc thay thế glycine bằng arginine ở vị trí 151 của ORF5 sẽ hoàn nguyên rất nhanh bộ gen của chúng so với bộ gen của virus nguyên thuỷ ngay sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, và nhƣ thế độc lực của chúng cũng đƣợc phục hồi (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Chính sự khác biệt và sự đa dạng về tính kháng nguyên, khả năng biến đổi cấu trúc kháng nguyên của virus đã làm tăng thêm những khó khăn trong việc sản xuất vaccine phòng chống bệnh này. Điều cần lƣu ý nữa là sự đa nhiễm PRRSV ở một số quốc gia, đó là sự trộn lẫn nhiều genotype, tức là căn bệnh do PRRSV lƣu hành trên đàn lợn gồm cả 2 dòng virus: Bắc Mỹ và châu Âu (Cavanagh, 1997).