Mẫu bệnh phẩm đƣợc thu từ lợn có triệu chứng bệnh lý nhƣ: lợn sảy thai, thai chết lƣu, lợn ho kèm sốt cao lờ đờ, bỏ ăn có triệu chứng sƣng và viêm khớp, tai bầm tím (ở lợn mọi lứa tuổi). Mẫu bệnh phẩm đƣợc thu bao gồm: phổi, amiđan, hạch, lá lách, dịch tràn phổi và huyết thanh, trong đó dịch tràn phổi và huyết thanh của lợn ở mọi lứa tuổi đƣợc coi là ƣu tiên hàng đầu cho việc thu mẫu bệnh phẩm để phục vụ cho quá trình phân lập PRRSV (OIE, 2010).
Trong thời gian nghiên cứu chúng tôi nhận đƣợc 100 mẫu bệnh phẩm nghi ngờ bị bệnh tai xanh ở tại ổ dịch, bao gồm cả các nuôi theo phƣơng thức trang trại và phƣơng thức hộ gia đình trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa từ Chi Cục thú y tỉnh Khánh Hòa. Địa điểm thu mẫu bao gồm Nha Trang (NT), Diên Khánh (DK), Vạn Ninh (VN) , Ninh Hòa (NH), Cam Lâm (CL). Trong 100 mẫu bệnh phẩm đó có 37/100 mẫu huyết thanh và 63/100 mẫu hạch amiđan, lá lách và phổi. Sau đó tất cả các mẫu bệnh phẩm đƣợc xử lý và bảo quản ở nhiệt độ - 800C cho tới khi thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Bảng kết quả thu mẫu đƣợc trình bày ở bảng 3.1 (phụ lục 3).
3.2. Kết quả thực hiện phản ứng RT - PCR
PCR là phƣơng pháp đƣợc phát triển để phát hiện PRRSV trong các mẫu bệnh phẩm mà không cần phải đƣợc phân lập trên nuôi cấy tế bào. So với phƣơng pháp phân lập trên tế bào và các phƣơng pháp huyết thanh học khác thì phƣơng pháp PCR cho phép phát hiện sớm PRRSV có trong mẫu bệnh phẩm.
Mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm PRRSV sau khi đƣa về phòng thí nghiệm đƣợc xử lý và tách chiết RNA tổng số bằng bộ kit “QIAamp Viral Mini Kit” (QIAGEN). Quy trình tách chiết đƣợc tiến hành đúng theo quy trình của nhà sản xuất. RNA sau khi tách chiết đƣợc bảo quản ở - 800C cho tới khi thực hiện cho phản ứng RT - PCR.
Chúng tôi đã sử dụng phản ứng RT - PCR nhằm khuếch đại gen ORF5 để phát hiện các chủng PRRSV trong mẫu bệnh phẩm thu thập đƣợc. Cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT - PCR là Go3F và Go5R để phát hiện gen ORF5 có kích thƣớc sản phẩm là 720bp. Các bƣớc tiến hành phản ứng RT - PCR nhƣ đã mô tả ở phần vật liệu và phƣơng
46
pháp nghiên cứu. Sau khi thực hiện phản ứng RT - PCR, sản phẩm của phản ứng RT - PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1%, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả RT - PCR phát hiện PRRSV từ các mẫu bệnh phẩm.
Ghi chú: Giếng M: Thanh marker DNA chuẩn (1000bp) Giếng P: Mẫu đối chứng dương (PRRSV TB - 8) Giếng N: Mẫu đối chứng âm
Giếng 1-18: Các mẫu bệnh phẩm
Kết quả ghi nhận đƣợc 75 mẫu dƣơng tính với PRRSV trên 100 mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm PRRSV. Sản phẩm của phản ứng RT - PCR có kích thƣớc khoảng 720 bp (Hình 3.1), kết quả này phù hợp với kết quả của nhóm nghiên cứu (Tony và cộng sự, 2001) khi cùng sử dụng cùng cặp mồi Go3F và Go5R. Theo Tony và cộng sự (2001), RNA của các chủng virus của họ thu thập đƣợc từ mẫu bệnh phẩm thu tập từ bang Illinois và miền đông bang Iowa, Hoa Kỳ đa số của PRRSV thuộc chủng Bắc Mỹ. Gen ORF5 đƣợc khuếch đại bằng phản ứng RT - PCR và có kích thƣớc là 720 bp. Nhƣ vậy, bƣớc đầu có thể kết luận 75 mẫu dƣơng tính với PRRSV. Từ kết quả này tiến hành phân lập các chủ ng dƣơng tính trên môi trƣờng tế bào MARC - 145.
3.3. Kết quả phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC - 145
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy PRRSV là một loại virus rất khó phân lập. Trong phạm vi phòng thí nghiệm, PRRSV chỉ có thể nhân lên trong hai loại tế bào đó là đại thực bào phế nang của lợn (PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ có nguồn gốc Châu Phi (MA - 104, MARC - 145, và CL - 2621). Tuy nhiên,
M P N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
720 bp 500bp
47
dòng tế bào MARC - 145 đƣợc khuyến cáo là dòng tế bào phù hợp và tốt hơn cho việc phân lập PRRSV nhất là chủng PRRSV thuộc dòng Bắc Mỹ (OIE, 2010; Klaas và cộng sự, 2011). Tế bào MARC - 145 có thể đƣợc dùng để phân lập 11 nhóm PRRSV khác nhau của hai dòng virus Châu Âu và Bắc Mỹ. Đối với chủng HP - PRRSV của Việt Nam và Trung Quốc có khả năng thích ứng rất cao với dòng tế bào MARC - 145 và là dòng tế bào đang đƣợc sử dụng nhiều nhất hiện nay (Kim và cộng sự, 2005). Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào MARC - 145 để tiến hành phân lập PRRSV từ mẫu bệnh phẩm đƣợc kết luận dƣơng tính với PRRSV bằng phản ứng RT - PCR.
Sau 2 – 3 ngày gây nhiễm trên bề mặt tế bào xuất hiện một số mẫu bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào gây nhiễm. Sau 4 ngày gây nhiễm xuất hiện nhiều cụm tế bào nhiều hơn và bắt đầu quan sát thấy hiện tƣợng CPE trên bề mặt tế bào (Hình 3.2b; Hình 3.3b). Hiện tƣợng này là do trong quá trình nhân lên trong tế bào MARC - 145, PRRSV sẽ phá hủy, làm cho tế bào co lại thành múi, lồi lên khỏi bề mặt và tạo những vết trống (CPE). Điều này có thể dễ dàng quan sát thấy dƣới kính hiển vi soi ngƣợc (độ phóng đại 10X). Kết quả tƣơng tự khi quan sát lớp tế bào gây nhiễm bằng chủng đối chứng dƣơng (Hình 3.3a). Kết quả này tƣơng tự với quá trình phân lập PRRSV trên dòng tế bào MARC - 145 theo mô tả của Nedzad and Carl. (2010). Kết quả sau khi phân lập có 75/75 mẫu xuất hiện hiệu ứng CPE. Tuy nhiên, mức độ gây độc tế bào có sự khác nhau. Cụ thể, khi quan sát mẫu đối chứng dƣơng và mẫu NT02 trên kính hiển vi sau 4 ngày gây nhiễm: lớp tế bào xuất hiện CPE trên mẫu đối chứng dƣơng rõ ràng hơn so với mẫu NT02.
48
Hình 3.2. Kết quả so sánh tế bào MARC - 145 sau 4 ngày gây nhiễm của mẫu đối chứng âm (a) và của mẫu NT02 (b).
Hình 3.3. Kết quả so sánh tế bào MARC - 145 sau 4 ngày gây nhiễm của mẫu đối chứng dƣơng (a) và mẫu NT02 (b).
Khi phân lập virus trên môi trƣờng tế bào, virus có thể gây bệnh tích tế bào chậm ở lần gây nhiễm đầu tiên, ở lần gây nhiễm tiếp theo khả năng gây bệnh tích tế bào nhanh hơn (Li và cộng sự, 2008). Do đó, chúng tôi tiến hành thu dịch tế bào đối với các mẫu đã gây nhiễm lần 1 và gây nhiễm lần 2 trên môi trƣờng tế bào MARC - 145 để so sánh khả năng gây bệnh tích tế bào giữa 2 lần gây nhiễm. Kết quả 2 lần gây nhiễm đƣợc thể hiện ở bảng 3.2 và bảng 3.3.
Qua bảng 3.3 và bảng 3.4 cho thấy: ở lần gây nhiễm lần thứ 1 tất cả các mẫu đều xuất hiện CPE nhƣng chỉ có 1/3 trong tổng số mẫu gây nhiễm đạt trên 70% thậm chí trong đó còn có những mẫu chỉ đạt 10 ÷ 30% tế bào sau 7 ngày gây nhiễm. Kết quả quan sát hiện tƣợng CPE trong lần gây nhiễm thứ 2 hoàn toàn khác với lần gây nhiễm thứ nhất: 75/75 giếng gây nhiễm 75 mẫu virus đạt CPE trên 70%. Kết quả này phù hợp với mô tả của Li và cộng sự. (2008).
Bảng 3.3. Kết quả phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC – 145 lần 2.
Tỷ lệ tế bào xuất hiện CPE sau 7 ngày (%)
Kết quả C.P.E < 10% 10 - 30% 30 - 50% 50 - 70% > 70%
49 0 mẫu 8 mẫu + 15 mẫu + 27 mẫu + 25 mẫu +
Bảng 3.4. Kết quả phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC – 145 lần 2.
Tỷ lệ tế bào xuất hiện CPE sau 7 ngày (%)
CPE < 10% 10 - 30% 30 - 50% 50 - 70% > 70% 0 mẫu 0 mẫu 0 mẫu 0 mẫu 75 mẫu +
PRRSV xâm nhập vào tế bào bằng con đƣờng nhập nội tế bào qua trung gian receptor vimentin. Ngƣời ta đã xác định vimentin (1 loại intermediate filament protein) là thụ thể bề mặt và là một yếu tố quan trọng trong việc ổn định cấu trúc của tế bào MARC – 145. Theo Kim và cộng sự (2005), quá trình gây nhiễm của PRRSV cũng có thể bị ngăn chặn bằng cách sử dụng các loại kháng thể đơn dòng kháng vimentin (Kim et al, 2005). Nhƣ vậy, lần gây nhiễm thứ 1 quá trình gây bệnh tích tế bào diễn ra chậm (Bảng 3.3). Đối với lần gây nhiễm lần thứ hai, sau 7 ngày gây nhiễm tỷ lệ CPE của tất cả các chủng virus đều trên 70%. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu trƣớc đây (Iris và cộng sự, 2010; Li và cộng sự, 2008). Điều này có thể giải thích là do, ở lần gây nhiễm thứ nhất số lƣợng tế bào còn quá thấp và sự thích nghi của virus đối với tế bào chƣa cao (Iris và cộng sự, 2010).
50
Sau 2 lần gây nhiễm, chúng tôi phân lập đƣợc 75 chủng virus trên tế bào MARC – 145 (Bảng 3.4). Các chủng virus này đã đƣợc kiểm tra lại bằng phản ứng RT - PCR với cặp mồi Go3F và Go5F và thành phần phản ứng đƣợc mô tả phần 2.5.2.2. Kết quả sau điện di ghi nhận 75/75 các mẫu thu đƣợc đều dƣơng tính với PRRSV. Các chủng virus sau phân lập đƣợc thu lại và bảo quản ở - 800C cho tới khi thực hiện phản ứng tiếp theo. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR, kiểm tra kết quả phân lập virus thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Kết quả RT - PCR kiểm tra PRRSV sau phân lập trên môi trƣờng tế bào MARC - 145.
Ghi chú: Giếng M: Thanh marker DNA chuẩn (1000bp) Giếng +: Mẫu đối chứng dương (PRRSV TB-8). Giếng 1 - 8: Các chủng virus sau phân lập.
Theo nhận định của Kim và cộng sự (2005): tế bào MARC - 145 là dòng tế bào nhạy cảm với PRRSV nên thích hợp cho việc phân lập virus này. Theo Klaas và cộng sự (2011), có thể phân lập PRRSV từ mẫu huyết thanh, phổi, dịch lỏng khoang phúc mạc, hạch ạch huyết và amiđan. Nhƣ vậy, kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả công bố của 2 nhóm tác giả Kim và cộng sự (2005) và Klaas và cộng sự (2011). Sản phẩm điện di đƣợc tinh sạch bằng bộ kit QIAquick PCR Purification Kit. DNA sau tinh sạch làm nguyên liệu cho quá trình giải trình tự gen.
500 bp
720bp 1000 bp
51
3.4. Kết quả giải trình tự và phân tích dữ liệu trình tự gen ORF5
Sản phẩm DNA sau tinh sạch từ PRRSV đƣợc phân lập trên tế bào MARC – 145 và sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình giải trình tự để thu nhận chuỗi nucleotide của vùng gen ORF5. Chúng tôi lựa chọn 27 chủng virus để tiến hành giải trình tự gen ORF5. Trong đó bao gồm 25 chủng virus lƣu hành trên đàn lợn nuôi tại Khánh Hòa, 1 chủng virus thuộc phân nhóm D2 (TB - 27 (T27)) và 1 chủng đối chứng dƣơng (TB – 8 (T1) - thuộc phân nhóm D1) (phụ lục 4).Quá trình giải trình tự đƣợc thực hiện bởi công ty MacroGen. Kết quả của quá trình giải trình tự sẽ đƣợc phân tích nguồn gốc di truyền bằng phƣơng pháp phân nhóm của công ty MJ - Biologics.
Công ty MJ Biologics đã chỉ ra rằng, nhiều nghiên cứu trƣớc đây chỉ có sử dụng cây phát sinh loài dựa trên sự thay đổi tổng thể trình tự nucleotide của ORF5 để so sánh sự khác nhau giữa các chủng. Tuy nhiên, có nhiều sự thay đổi trên trình nucleotide nhƣng không làm thay đổi đặc tính miễn dịch của PRRSV. Theo phƣơng pháp phân nhóm của công ty MJ - Biologics, để phân tích nguồn gốc di truyền của các chủng PRRSV lƣu hành trên lợn nuôi tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa cần phải dựa vào trình tự protein của GP5. Kết quả phân tích đƣợc trình bày ở hình 3.5.
T5 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSPHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T8 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSPHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T15 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSPHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T25 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSPHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T2 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T12 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T11 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T7 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T6 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T4 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T16 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T14 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T21 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T20 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASSSNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T9 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASNSSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T23 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASNSSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T24 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASNSSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T17 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASNSSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T10 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLVNASNNNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF T13 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFCLAVLVNASNNNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF
JXA1 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLVNASNNNSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAQKF
T27 MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVLANASRSNSSHTQLIYNLTLCELNGTDWLAKKF
T1 MLGKCLTAGCCSQLLFLWCIVPFFSAALVSANGNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLVNRF T19 MLGKCLTAGCCSQLLFLWCIVPFFSAALVSANGNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLVNRF T22 MLGKCLTAGCCSQLLFLWCIVPFFSAALVSANGNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLVNRF T3 MLGKCLTAGCCSQLLFLWCIVPFFSAALVSANGNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANRF
52 T18 MLGKCLTAGCCSQLLFLWCIVPFFSAALVSANGNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANRF ******** ***:********** *.*..*. ..*.* T5 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T8 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T15 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T25 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T2 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T12 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T11 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T7 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T6 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T4 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T16 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T14 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T21 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T20 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T9 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAFCALAAL T23 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAFCALAAL T24 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T17 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T10 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T13 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL JXA1 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYYHGRYVLSSIYAVCALAAL T27 DWAVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLATVSTAGYLHGRYVLSSIYAVCALAAL T1 DWAVESFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVALVTVSTAGFCHGRYVLSSIYAVCALAAL T19 DWAVESFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVALVTVSTAGFCHGRYVLSSIYAVCALAAL T22 DWAVESFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVALVTVSTAGFCHGRYVLSSIYAVCALAAL T3 DWAVESFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVALVTVSTAGFCHGRYVLSSIYAVCALAAL T18 DWAVESFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVALVTVSTAGFCHGRYVLSSIYAVCALAAL *****:*************************.*.******: T5 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T8 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T15 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T25 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T2 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T12 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T11 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T7 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T6 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T4 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T16 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T14 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T21 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T20 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T9 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVGGHLIDLKRVV T23 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVGGHLIDLKRVV T24 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVGGHLIDLKRVV T17 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVGGHLIDLKRVV T10 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T13 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV JXA1 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVV T27 ICFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIVEKVGKVEVGDHLIDLKR--
T1 TCFVIRFAKNCMSWRYACTRYTNFLLDTKGKLYRWRSPVIIEKRGKVEVEGHLIDLKRVV T19 TCFVIRFAKNCMSWRYACTRYTNFLLDTKGKLYRWRSPVIIEKRGKVEVEGHLIDLKRVV T22 TCFVIRFAKNCMSWRYACTRYTNFLLDTKGKLYRWRSPVIIEKRGKVEVEGHLIDLKRVV T3 TCFVIRFAKNCMSWRYACTRYTNFLLDTKGKLYRWRSPVIIEKRGKVEVEGHLIDLKRVV
53
T18 TCFVIRFAKNCMSWRYACTRYTNFLLDTKGKLYRWRSPVIIEKRGKVEVEGHLIDLKRVV *************:*********:** ***** .******* T5 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T8 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T15 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T25 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T2 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T12 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T11 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T7 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T6 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T4 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T16 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T14 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T21 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T20 LDGSAATPLTKVSAEQWGRL T9 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T23 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T24 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T17 LDGSAATPLTRVSSEQWGRL T10 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL T13 LDGSAATPLTRVSAEQWGRL JXA1 LDGSAATPLTRVSAELWGRL T27 ---SCA--- T1 LDGSAATPVTKVSAEQWGRP T19 LDGSAATPVTKVSAEQWGRP T22 LDGSAATPVTKVSAEQWGRP T3 LDGSAATPVTKVSAEQWGRP T18 LDGSAATPVTKVSAEQWGRP *.*
Hình 3.5. Kết quả phân tích mối quan hệ của các chủng PRRSV dựa trên trình tự amino axit GP5 của công ty MJ Biologics.
Theo kết quả gửi về của công ty MJ Biologics, nhóm nghiên cứu đã sử dụng trình tự amino axit - GP5 của chủng JXA1 làm trình tự amino axit đối chứng và. JXA1 là một trong những chủng HP - PRRSV đƣợc phát hiện sớm nhất và đƣợc phân lập ở Trung Quốc vào năm 2006. Bộ gen của JXA1 có độ tƣơng đồng với bộ gen của chủng Bắc Mỹ (VR - 2332) là 91%. Tuy nhiên, từ 2006 đến 2009 HP - PRRSV đã lây lan sang các nƣớc trong khu vực và sau đó đã trở thành đại dịch. Trong thời gian đó vaccine thƣơng mại sản xuất dựa trên chủng Bắc Mỹ đã không còn khả năng phòng bệnh cho đàn lợn bị nhiễm virus HP - PRRS. So với VR - 2332, HP - PRRSV có khả năng tạo ra phản ứng đáp ứng miễn dịch mạnh hơn (Galliher và cộng sự, 2015).
Theo MJ - Biologics, PRRSV đƣợc phân loại dựa trên đặc tính miễn dịch của virus. Kết quả cho thấy 25 chủngPRRSV phân lập tại Khánh Hòa sử dụng để phân tích bằng phƣơng pháp phân nhóm của công ty MJ - Biologics đều thuộc phân nhóm D1, có
54
nguồn gốc từ Trung Quốc và thuộc type II. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trƣớc đây, Nguyễn Đức Tân và cộng sự. (2015), khi phân tích trình tự gen ORF5 của 300 chủng phân lập từ miền Bắc, Trung, Nam cho thấy đa số (96,15%) các chủng PRRSV đang lƣu hành tại Việt Nam thuộc phân nhóm D1 có nguồn gốc từ Trung Quốc và chỉ một tỷ lệ rất nhỏ (3,85%) thuộc biến thể D2, D4, D6, và S3. Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng chủng PRRSV lƣu hành trên đàn lợn nuôi tại Kháng Hòa cùng nguồn gốc với JXA1.
Tuy nhiên khi so sánh với trình tự aa - GP5 của JXA1 và chủng TB – 8 chỉ có 2/25 chủng giống 100% về trình tự aa với JXA1. Kết quả phân tích đƣợc chia làm 5 nhóm biến đổi: 15/25 chủng bị biến đổi ở vị trí aa thứ 33 và aa 34; 4/25 chủng biến đổi ở vị trí aa thứ 34, aa 35, aa 149, aa 159 và 188, trong đó có 3 chủng biến đổi ở vị trí aa 57 và 2 chủng giống hoàn toàn so với chủng TB - 8; 2/25 chủng có trình tự giống hoàn toàn cho với chủng JXA1. Trình tự aa GP5 của dòng Bắc Mỹ có 200 aa, trong đó ở vùng ectodomain có 3 vị trí biển thể giữa các chủng PRRSV (vị trí aa 32; aa 33 và aa 34). Bên cạnh đó, trong trình tự aa của GP5 có 2 vùng biến đổi (aa 57 ÷ 70 và aa 121 ÷ 130), 3 vùng bảo tồn (aa 41 ÷ 56; 71 ÷ 120 và 131 ÷ 200 ). Trong đó, vị trí aa 48 (Cysteine) đƣợc xác định là aa liên quan đến việc hình thành liên kết với protein M