Tách chiết RNA tổng số từ những mẫu bệnh phẩm nghi ngờ dƣơng tính với PRRSV bằng bộ kit QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN). Thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất với các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
- Bƣớc 1: hút 560µl Buffer AVL - carrier RNA trong tube 1,5ml sạch.
- Bƣớc 2: thêm 140µl dịch mẫu bệnh phẩm đã qua xử lý vào ống tube có chứa sẵn AVL, trộn đều trên máy vortex trong 15 giây, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút. - Bƣớc 3: thêm 560µl ethanol 100% vào và vortex nhanh trong 15 giây.
- Bƣớc 4: hút chuyển 630µl hỗn hợp sang cột có màng lọc (QIAamp Mini column), ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 1 phút, bỏ dịch.
- Bƣớc 5: chuyển 630µl hỗn hợp còn lại sang cột và thực hiện nhƣ bƣớc 4.
- Bƣớc 6: thêm 500µl buffer AW1 vào, ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 1 phút, bỏ dịch.
- Bƣớc 7: thêm 500µl buffer AW2 vào, ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/ phút trong 3 phút. Bỏ dịch và ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/ phút trong 1 phút để lể làm khô hoàn toàn màng lọc.
- Bƣớc 8: chuyển cột thu ở bƣớc 7 vào một ống effendoft 1,5 ml sạch, thêm 60µl buffer AVE, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 1 phút, thu dịch. Bảo quản mẫu RNA ở nhiệt độ -80oC.
2.5.2.2. Phản ứng RT - PCR
Mục đích
Thu nhận một lƣợng lớn các phân tử DNA của vùng gen ORF5, sản phẩm RT- PCR với cặp mồi đặc hiệu, làm nguyên liệu cho quá trình điện di kiểm tra kích thƣớc sản phẩm RT-PCR để phát hiện các chủng PRRSV trong 100 mẫu bệnh phẩm nghi ngờ dƣơng tính với PRRSV.
34
Tiến hành:
Thực hiện chuỗi phản ứng RT - PCR nhân đoạn gen ORF5 với mẫu RNA tổng số thu nhận ở trên, sử dụng cặp mồi Go3F và Go5R để nhân đoạn gen ORF5 bằng bộ kit RT - PCR one step (invitrogen), trình tự cặp mồi nhƣ ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các mồi trong phản ứng RT - PCR
(Tony và cộng sự, 2001).
Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’- 3’) Tm (0C) Nồng độ sử dụng Độ dài của sản phẩm thu đƣợc Go3F GAGACCATGAGGTGGGCAAC 58,2 10µM 720bp Go5R CGCCAAAAGCACCTTTTGT 54,6 10µM Các thành phần phản ứng RT - PCR đƣợc trình bày ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng RT - PCR/ 1 ống eppendorf cho PCR. Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc tinh khiết (free RNA) 6,0
2X Reaction 12,5
Mồi xuôi Go3F 0,5
Mồi ngƣợc Go5R 0,5
Enzyme mix 0,5
Khuôn RNA tổng số 5,0
Tổng thể tích 25
Phản ứng RT - PCR thực hiện trên máy luân nhiệt Model Techne TC - 512 với chu trình nhiệt của phản ứng gồm các giai đoạn sau: 1) 500C trong 15 phút, 950C trong 2 phút, 1 chu kỳ của 950C trong 10 giây, 620C trong 30 giây, 680C trong 30 giây, 1 chu
35
kỳ của 950C trong 10 giây, 600C trong 30 giây, 680C trong 30 giây, 1 chu kỳ của 950C trong 10 giây, 580C trong 30 giây, 680C trong 30 giây, cuối cùng ở 250C trong 10 giây. Kích thƣớc trình tự DNA mục tiêu của sản phẩm RT - PCR là 720bp. Sản phẩm sau điện di đƣợc bảo quản ở 40C.