Độc lực của PRRSV có liên quan đến cấu trúc và những sản phẩm tạo tính kháng nguyên của virus gây nên. Tuy nhiên, để làm rõ vai trò gây bệnh của virus cần phải dựa trên việc xác định giá trị TCID50 và quá trình theo dõi, ghi nhận các triệu chứng lâm sàng và kiểm tra dấu hiệu bệnh tích trên vật chủ trong thời gian nhất định. Chúng tôi tiến hành lựa chọn 25 chủng PRRSV để xác định TCID50. Quá trình xác định giá trị TCID50 đƣợc thực hiện trên đĩa 96 giếng (Hình 3.6).
Giá trị TCID50 đƣợc xác định dựa trên tổng số giếng xuất hiện CPE (dƣơng tính với CPE (+) trên mỗi nồng độ pha loãng (lớn hơn 50%) sau 7 ngày gây nhiễm. Kết quả đƣợc tính theo phƣơng pháp của Spearman Karber (Huỳnh Thị Mỹ Lệ và Nguyễn Văn Giáp, 2013). Kết quả ghi nhận tổng số giếng xuất hiện CPE của các chủng virus NT02, NH02 và VN01 đƣợc trình bày ở bảng 3.4, bảng 3.6 bảng 3.7.
Bảng 3.5. Kết quả ghi nhận tổng số giếng xuất hiện CPE của chủng virus NH02.
Độ pha
loãng Tổng số giếng (+) CPE Tổng số giếng (-) CPE
10-1 10 0
56 10-3 10 0 10-4 8 2 10-5 7 3 10-6 2 8 10-7 1 9 10-8 0 10
Bảng 3.6. Kết quả ghi nhận tổng số giếng xuất hiện CPE của chủng virus NT02.
Độ pha loãng Tổng số giếng (+)
CPE Tổng số giếng (+) CPE
10-1 10 0 10-2 10 0 10-3 10 0 10-4 8 2 10-5 6 4 10-6 3 7 10-7 0 10 10-8 0 10
57
Bảng 3.7. Kết quả ghi nhận tổng số giếng xuất hiện CPE của chủng virus VN01.
Độ pha
loãng Tổng số giếng (+) CPE Tổng số giếng (-) CPE
10-1 10 0 10-2 10 0 10-3 10 0 10-4 7 3 10-5 6 4 10-6 5 5 10-7 0 10 10-8 0 10
Qua 3 bảng ghi nhận tổng số giếng xuất hiện CPE sau 7 ngày gây nhiễm, các giá trị TCID50/ml tƣơng ứng của 3 chủng virus NH02, NT02 và VN01 lần lƣợt là: 6,3lg; 6,2 lg và 6, 3lg. Kết quả tính toán giá trị TCID50 của 25 chủng virus đƣợc trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả xác định giá trị TCID50 của PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC - 145.
Stt Chủng virus TCID50/ml Stt Chủng virus TCID50/ml
1 NH02 6,2lg 14 NH13 5,4lg
2 NT02 6,3lg 15 NH19 5,4lg
3 NT18 6,0 lg 16 NH15 6,1lg
58 5 VN01 6,3lg 18 NT14 5,8lg 6 CL01 6,1lg 19 NT06 6,1lg 7 DK01 6,2lg 20 NT08 5,3lg 8 DK05 5,1lg 21 NH18 5,3lg 9 NT21 4,5lg 22 NT03 6,1lg 10 DK08 5,3lg 23 NT15A 5,3lg 11 NT07 6,1lg 24 NH16 6,1lg 12 NT06 5,8lg 25 NH12 5,2lg 13 NT02 5,6lg
Hình 3.6. Xác định hiệu giá virus trên đĩa 96 giếng.
Kết quả bảng 3.8 cho thấy giá trị TCID50 của 25 chủng virus dao động từ 4,5lg đến 6,3lg. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Trần Thị Thanh Hà và cộng sự. (2012). Nhóm tác giả này nhận thấy TCID50/ml của các chủng 0196, Châu Âu, và MLV lần lƣợt là 6,5lg, 5,5 lg và 6,7 lg TCID50/ml. Một nghiên cứu khác của Karniycuk và cộng sự (2010) cho thấy hiệu giá virus của các chủng Belgium - A và Lena phân lập từ bệnh phẩm giao động từ 2,2lg đến 7,7lg TCID50/ml.
3.5.2. Kết quả xác định độc lực của PRRSV
Theo Tian và cộng sự. (2007), biểu hiện của yếu tố nhiệt độ (sốt cao) là một trong những triệu chứng biểu hiện rõ ràng và cụ thể nhất của lợn khi khị nhiễm PRRSV.
59
Kết quả theo dõi nhiệt độ đƣợc trình bày ở bảng 3.9 và kết quả theo dõi đƣợc tính trung bình và đƣợc biểu thị rõ trên đồ thị hình 3.7.
Bảng 3.9. Kết quả theo dõi nhiệt độ của 2 lô lợn thí nghiệm trong 21 ngày. Stt (ngày) Nhóm lợn 1 (0C) Nhóm lợn 2(0C) Nhóm lợn 3(0C) Nhóm lợn 4(0C) Ghi chú
1 39,95 40,30 40,55 39,80 Lấy máu, tiêm
2 39,90 39,80 39,70 39,90 3 39,75 39,80 39,45 39,60 4 39,30 39,35 40,00 39,40 5 39,25 39,25 39,85 39,45 6 40,95 39,85 39,90 40,45 7 40,80 40,20 40,25 40,35 Lấy máu 8 40,25 41,70 40,25 40,15 9 40,35 40,70 40,40 40,05 10 39,70 39,95 39,80 39,85 11 39,75 39,50 39,40 39,80 12 39,95 39,80 39,65 40,05 13 40,10 39,80 39,05 39,35 14 39,70 39,90 39,70 39,35 Lấy máu 15 39,75 39,50 39,60 38,30 16 39,00 39,30 39,05 39,90 17 39,60 39,15 39,10 39,25 18 39,45 39,20 39,20 39,30 19 39,55 39,35 39,25 39,55
60
20 39,40 39,40 39,35 39,40
21 39,65 39,50 39,25 39,45 Lấy máu, mổ khám
Hình 3.7. Đồ thị biểu thị kết quả theo dõi sự biến đổi thân nhiệt của lợn sau 21 ngày gây nhiễm (1: từ ngày 1 - 5; 2: từ ngày 6 - 10; 3: từ tngày 11 - 15;
4: từ ngày 16 - 21 sau gây nhiễm các chủng PRRSV lên lợn).
Kết quả trong hình 3.7 cho thấy 5 ngày đầu sau gây nhiễm nhiệt độ của cả 4 nhóm lợn bắt đầu có hiện tƣợng sốt nhẹ (tăng từ 0,2 ÷ 0,40C so với nhiệt độ bình thƣờng). Hiện tƣợng lợn sốt cao bắt đầu biểu hiện rõ từ ngày thứ 5 sau gây nhiễm ở cả 4 nhóm lợn, nhiệt độ trung bình vào khoảng 40 ÷ 40,50C. Trong đó có 1 lợn có hiện tƣợng sốt cao > 410C, 3 lợn có nhiệt độ gần 410C, tất cả các nhóm lợn từ này thứ 5 đến ngày thứ 8 gây nhiễm đều có hiện tƣợng sốt từ 40 ÷ 40,50C (Bảng 3.8). Kết quả này tƣơng tự với kết quả nghiên cứu của Galliher và cộng sự (2015) và Xiuling và cộng sự (2013) đo nhiệt độ tại trực tràng của lợn bị nhiễm HP - PRRSV chủng JXA1 với liều 2ml/con ở nồng độ 106 TCID50/ml. Từ ngày thứ 10 nhiệt độ giảm dần nhƣng vẫn còn có lợn sốt, sau đó tất cả đều hồi phục, không có lợn chết. Kết quả này cũng tƣơng tự với các kết quả nghiên cứu trƣớc đây của nhiều tác giả (Tô Long Thành và cộng sự, 2008; Tian và cộng sự, 2007; Tong và cộng sự, 2007). Bên cạnh đó tất cả các nhóm lợn có dấu hiệu đứng và đi lại không vững.
61
3.5.3. Kết quả thực hiện phản ứng realtime RT-PCR
Song song với việc quan sát triệu chứng bệnh lý, chúng tôi tiến hành lấy máu ngẫu nhiên 2 lợn trên 1 nhóm (3 nhóm tiêm các chủng virus NH02, NT02 và VN01 để kiểm tra sự có mặt PRRSV bằng phản ứng realtime RT - PCR vào các thời điểm: 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày sau khi gây nhiễm. Giá trị Ct của 6 lợn đƣợc trình bày ở bảng 3.10
Bảng 3.10. Kết quả xác định giá trị Ct .
Chủng virus
Giá trị Ct sau khi tiêm PRRSV
7 ngày 14 ngày 21 ngày
NH02 – 1 25,20 34,99 38,60 NT02 - 1 28,45 35,12 00,00 VN01 – 1 22,22 30,15 33,05 NH02 – 2 24,70 32,60 36,86 NH02 – 2 30,72 36,25 00,00 VN01 – 2 32,60 37,37 39,64
Từ giá trị Ct xác định đƣợc của ba nhóm lợn (Bảng 3.10), chúng tôi thấy rằng sau 7 ngày gây nhiễm tất cả các nhóm lợn đều dƣơng tính với PRRSV. Trong đó 2 lợn tiêm chủng NH02 và VN01 nhiễm virus với mức độ trung bình, 4 lợn nhiễm với mức độ nặng. 2 lợn có hàm lƣợng virus giảm dần sau 14 ngày và kết quả PRRSV bị đào thải hết ra khỏi cơ thể và 2 lợn xác định là dƣơng tính với PRRSV sau 21 ngày sau gây nhiễm. Nhƣ vậy, sau 21 ngày gây nhiễm xác định đƣợc 2 lợn để tiến hành khám mổ, ghi nhận dấu hiệu bệnh tích. Ngoài ra, trong khoảng thời gian hàm lƣợng virus trong máu cao nhất thì thân nhiệt của lợn cũng đỉnh điểm sau 7 ngày gây nhiễm (Bảng 3.9). Điều này có thể giải thích là do: ở giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm của PRRSV, hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ đƣợc kích hoạt dẫn tới thân nhiệt của lợn tăng cao. Khi đại thực bào đƣợc kích hoạt, hiệu giá kháng thể chống lại các loại virus và vi khuẩn không
62
liên quan khác trong cơ thể của lợn tăng cao. Điều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc đánh giá mức độ miễn dịch đối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn (Rossow, 1998).
Kết quả kiểm tra dấu hiệu bệnh tích
Chúng tôi tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích 2 lợn đã đƣợc xác định dƣơng tính với PRRSV sau 21 ngày gây nhiễm. Kết quả mổ khám đƣợc thể hiện qua các hình 3.8, hình 3.9, hình 3.10, hình 3.11. Theo mô tả của Kyoungjin và cộng sự. (2003) và kết quả của nhiều nghiên cứu khác, khi lợn bị nhiễm PRRSV thì phổi là vị trí biểu hiện bệnh hay thấy nhất sau đó tới các bộ phận khác nhƣ hạch, gan có thể xuất hiện những đốm trắng. Trong một nghiên cứu khác mô tả khi lợn bị nhiễm PRRSV phổi thƣờng có hiện tƣợng sƣng phù, xuất hiện nhiều đốm trắng hoặc vàng hoại tử đi kèm dấu hiệu xuất huyết, khi soi dƣới kính hiển vi các tế bào mô phổi có thể thấy đƣợc hiện tƣợng viêm. Hạch bạch huyết thƣờng bị sƣng, phù nề, có thể bị chuyển màu nâu và hạch sƣng tạo các u cục to (Yoon và cộng sự, 2003; Tian và cộng sự, 2007; Tô Long Thành và cộng sự, 2008; Hanchun và cộng sự, 2014). So với kết quả ghi nhận triệu chứng bệnh tích tại phổi của nhóm nghiên cứu Hanchun và cộng sự (2014) (Hình 3.8b), phổi của lợn trong nghiên cứu của chúng tôi ít sƣng hơn (Hình 3.8a), nhƣng lại xuất hiện nhiều đốm trắng và hiện tƣợng viêm rõ ràng hơn. Nhƣ vậy, cùng một vị trí biểu hiện bệnh tích nhƣng mức độ có thể khác nhau. Ngoài ra, theo mô tả của Hanchun. (2014) (công ty Boehringer Ingelheim, Đức) khi lợn bị nhiễm HP - PRRSV thì phổi còn bị xuất huyết, màng bao tim bị xuất huyết và phúc mạc bị viêm.
Đặc biệt, kết quả kiểm tra dấu hiệu bệnh tích trong nghiên cứu này tƣơng đồng rất cao với kết quả nghiên cứu của Tian và cộng sự (2007); khi mô tả đặc điểm bệnh tích của đàn lợn đầu tiên bị chết do nhiễm PRRSV vào năm 2006 ở Trung Quốc. Kết quả ghi nhận trên đàn lợn chết do chủng PRRSV cho thấy rằng phổi bị sƣng phù xuất hiện những đốm xuất huyết và phổi bị hoại tử trắng hoặc vàng (Hình 3.8a, Hình 3.11), gan bị hoại tử (đốm trắng), xuất huyết (Hình 3.10), lá lách bị xuất huyết (Hình 3.10), tim, màng bao tim bị xuất huyết (Hình 3.11) và lợn bị viêm khớp. Tuy nhiên trên đàn lợn bị chết đƣợc xác định xuất hiện nhiều dấu hiệu bệnh tích khác đi kèm với tình trạng nhiễm khuẩn trầm trọng (Tian và cộng sự, 2007).
63
Hình 3.8. Phổi của lợn gây nhiễm PRRSV bị viêm.
Trong điều kiện in vivo PRRSV rất nhạy cảm với tế bào đại thực bào phế nang phổi. Khi xâm nhập vào cơ thể PRRSV nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào dẫn đến làm cho đại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng. Do vậy lợn mắc PRRS thƣờng dễ bị nhiễm khuẩn thứ phát hoặc đồng nhiễm một số mầm bệnh khác. Một số loại vi khuẩn thƣờng bị nhiễm thứ phát đó là: Escherichia coli, Streptococcus suis, Haemophilus parasuis… Một số loại khuẩn đồng nhiễm với PRRSV nhƣ: virus Classical swine fever (CSFV)…. gây bệnh dịch tả lợn, virus Porcine circo type 2 (PCV2) gây nên hội chứng suy giảm đa hệ thống sau khi cai sữa hay hội chứng còi cọc, nhiễm Mycoplasma hyopneumoniae gây bệnh viêm phổi ở lợn…(Tian và cộng sự, 2007)
(https://www.pig333.com/prrs/highly-pathogenic-prrs-hp-prrs-in-sia_9333/#comments).
Hình 3.9. Hạch lâm ba bị sƣng, màu nâu vàng có nổi u cục to.
b a
64
Hình 3.10. Phổi bị viêm, gan có đốm trắng hoại tử.
Hình 3.11. Tim sƣng, màng bao tim xuất huyết, phổi bị xuất huyết.
Khi tiến hành mổ khám lợn sau 10 ngày gây nhiễm kết quả kiểm tra tƣơng tự với kết quả mô tả của Kyoungjin và cộng sự. (2003), Yoonvà cộng sự. (2003) và Hanchun và cộng sự. (2014). Từ kết quả theo dõi các triệu chứng và tiến hành kiểm tra mổ khám các biểu hiện bệnh tích trên các cơ quan đích có thể khẳng định việc gây nhiễm với liều 2ml/con ở nồng độ 106 TCID50/ml đã làm 2 lợn trong lô thí nghiệm bị nhiễm bệnh tai xanh. Ngoài ra, yếu tố môi trƣờng nhƣ nhiệt độ và độ ẩm trong mùa hè và nhiễm khuẩn thứ phát có thể đóng góp cho sự bùng phát dịch tai xanh gây ra bởi HP – PRRSV (Tian và cộng sự, 2007).
65
Chủng D1 (cùng nguồn gốc với JXA1) là một chủng biến thể thuộc kiểu gen type II của PRRSV đƣợc phát hiện đầu tiên ở Trung Quốc vào tháng 6 năm 2006 và nhanh chóng lan sang các nƣớc Đông Nam Á ngay sau đó. Dịch bệnh đã gây ra thiệt hại nghiêm trọng đến sản xuất lợn và đã trở thành một gánh nặng cho ngƣời chăn nuôi lợn trong khu vực trong đó có Việt Nam. Đây là chủng có độc lực cao, lợn bị nhiễm bệnh có hiện tƣợng sốt cao (40 - 420C) ở mọi lứa tuổi, gây sảy thai, thai chết lƣu và có hiện tƣợng suy hô hấp ở nhiều cấp độ (OIE, 2010). Đã có nhiều nhóm nghiên cứu khả năng gây bệnh của HP - PRRSV, nhƣng với nhiều kết quả khác nhau về mức độ gây bệnh. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập, giải trình tự và phân nhóm các chủng PRRSV trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa và xác định tất cả các chủng đều thuộc chủng D1 - có độc lực cao dựa vào trình tự protein GP5. GP5 có một đoạn tín hiệu peptide định hƣớng tại đầu cuối N của protein và bị glycosyl hóa sau dịch mã từ 2 đến 4 vị trí đó là aa 30, aa 33, aa 44 hoặc aa 51. Vị trí đƣợc glycosyl hóa rất quan trọng cho quá trình hình thành cấu trúc và duy trì hoạt tính của protein GP5 (Thaa và cộng sự, 2013; Nedzad and Carl, 2010). GP5 đƣợc biết nhƣ yếu tố kích thích việc sản sinh kháng thể trung hòa ở lợn và đây là một vấn đề then chốt của miễn dịch dịch thể. Những chủng PRRSV mang đột biến loại vùng glycosyl hóa ở GP5 cho thấy khả năng kích thích sinh kháng thể trung hòa cao hơn chủng dại. Để xác định khả năng gây bệnh của PRRSV, chúng tôi tiến hành tiêm trên 4 nhóm lợn với chủng PRRSV - D1 trong 3 mẫu bệnh phẩm có giá trị TCID50 cao nhất với nồng độ 106 TCID50/ml. Kết quả tƣơng tự với kết quả thí nghiệm của Trung tâm nghiên cứu Bệnh Động vật Quốc Gia (Hoa Kỳ) – Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ. Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng PRRS là hội chứng đa yếu tố gây ra bởi PRRSV và là yếu tố quan trọng góp phần gây nên các hiện tƣợng nhiễm trùng thứ phát khác (Metwally và cộng sự, 2010).
66
Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Khi sử dụng phản ứng RT - PCR để khuếch đại gen ORF5 của chủng virus trong 100 mẫu bệnh nghi ngờ nhiễm PRRSV đã phát hiện 75/100 mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với PRRSV.
Sau khi kiểm tra kết quả phân lập bằng phản ứng RT - PCR thấy rằng 100% mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với PRRSV đều phân lập thành công trên môi trƣờng tế bào MARC - 145.
PRRSV trên đàn lợn nuôi tại Khánh Hòa đều thuộc phân nhóm D1 có cùng nguồn gốc với chủng JXA1.
TCID50/ml của PRRSV trong 25 mẫu đại diện dao động từ 4,5lg đến 6,3lg. Ở liều gây nhiễm 2ml/ con ở nồng độ 106TCID50/ml, tất cả 4 nhóm lợn đều có triệu chứng lâm sàng của bệnh tai xanh. Sau 21 ngày gây nhiễm tiến hành mổ khám kiểm tra có xuất hiện bệnh tích: lợn sốt cao, phổi bị viêm, sƣng và xuất huyết, gan có đốm trắng hoại tử, lá lách bị xuất huyết, hạch lâm ba bị sƣng và có nổi u cục to.
Khả năng gây bệnh và dấu hiệu bệnh tích của chủng D1 tƣơng tự với chủng JXA1 khi tiến hành cảm nhiễm trên động vật chủ
4.2. Kiến nghị
Tiếp tục thí nghiệm dựa trên kết quả nghiên cứu để phát triển, sản xuất vaccine tai xanh cho chính đàn lợn tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa.
Tiếp tục kết hợp nghiên cứu quá trình đồng nhiễm khuẩn và nhiễm khuẩn thứ cấp để có các biện hỗ trợ trong việc điều trị và phòng chống lây lan của dịch.
67
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tài liệu tiếng việt
1. Trần Thị Thanh Hà, Ken Inui, Phạm Thị Nga, Đặng Xuân Sinh, Trịnh Quang Đại, Trƣơng Anh Đức, Nguyễn Viết Không 2013, “Phản ứng trung hòa virus PRRS trên nuôi cấy tế bào và ứng dụng”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, số. 1, tr. 27 - 33.
2. Đậu Ngọc Hào, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long, Tiêu Quang An 2008, “Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) ở lợn từ cuối tháng 3 đến