Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy PRRSV là một loại virus rất khó phân lập. Trong phạm vi phòng thí nghiệm, PRRSV chỉ có thể nhân lên trong hai loại tế bào đó là đại thực bào phế nang của lợn (PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ có nguồn gốc Châu Phi (MA - 104, MARC - 145, và CL - 2621). Tuy nhiên,
M P N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
720 bp 500bp
47
dòng tế bào MARC - 145 đƣợc khuyến cáo là dòng tế bào phù hợp và tốt hơn cho việc phân lập PRRSV nhất là chủng PRRSV thuộc dòng Bắc Mỹ (OIE, 2010; Klaas và cộng sự, 2011). Tế bào MARC - 145 có thể đƣợc dùng để phân lập 11 nhóm PRRSV khác nhau của hai dòng virus Châu Âu và Bắc Mỹ. Đối với chủng HP - PRRSV của Việt Nam và Trung Quốc có khả năng thích ứng rất cao với dòng tế bào MARC - 145 và là dòng tế bào đang đƣợc sử dụng nhiều nhất hiện nay (Kim và cộng sự, 2005). Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào MARC - 145 để tiến hành phân lập PRRSV từ mẫu bệnh phẩm đƣợc kết luận dƣơng tính với PRRSV bằng phản ứng RT - PCR.
Sau 2 – 3 ngày gây nhiễm trên bề mặt tế bào xuất hiện một số mẫu bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào gây nhiễm. Sau 4 ngày gây nhiễm xuất hiện nhiều cụm tế bào nhiều hơn và bắt đầu quan sát thấy hiện tƣợng CPE trên bề mặt tế bào (Hình 3.2b; Hình 3.3b). Hiện tƣợng này là do trong quá trình nhân lên trong tế bào MARC - 145, PRRSV sẽ phá hủy, làm cho tế bào co lại thành múi, lồi lên khỏi bề mặt và tạo những vết trống (CPE). Điều này có thể dễ dàng quan sát thấy dƣới kính hiển vi soi ngƣợc (độ phóng đại 10X). Kết quả tƣơng tự khi quan sát lớp tế bào gây nhiễm bằng chủng đối chứng dƣơng (Hình 3.3a). Kết quả này tƣơng tự với quá trình phân lập PRRSV trên dòng tế bào MARC - 145 theo mô tả của Nedzad and Carl. (2010). Kết quả sau khi phân lập có 75/75 mẫu xuất hiện hiệu ứng CPE. Tuy nhiên, mức độ gây độc tế bào có sự khác nhau. Cụ thể, khi quan sát mẫu đối chứng dƣơng và mẫu NT02 trên kính hiển vi sau 4 ngày gây nhiễm: lớp tế bào xuất hiện CPE trên mẫu đối chứng dƣơng rõ ràng hơn so với mẫu NT02.
48
Hình 3.2. Kết quả so sánh tế bào MARC - 145 sau 4 ngày gây nhiễm của mẫu đối chứng âm (a) và của mẫu NT02 (b).
Hình 3.3. Kết quả so sánh tế bào MARC - 145 sau 4 ngày gây nhiễm của mẫu đối chứng dƣơng (a) và mẫu NT02 (b).
Khi phân lập virus trên môi trƣờng tế bào, virus có thể gây bệnh tích tế bào chậm ở lần gây nhiễm đầu tiên, ở lần gây nhiễm tiếp theo khả năng gây bệnh tích tế bào nhanh hơn (Li và cộng sự, 2008). Do đó, chúng tôi tiến hành thu dịch tế bào đối với các mẫu đã gây nhiễm lần 1 và gây nhiễm lần 2 trên môi trƣờng tế bào MARC - 145 để so sánh khả năng gây bệnh tích tế bào giữa 2 lần gây nhiễm. Kết quả 2 lần gây nhiễm đƣợc thể hiện ở bảng 3.2 và bảng 3.3.
Qua bảng 3.3 và bảng 3.4 cho thấy: ở lần gây nhiễm lần thứ 1 tất cả các mẫu đều xuất hiện CPE nhƣng chỉ có 1/3 trong tổng số mẫu gây nhiễm đạt trên 70% thậm chí trong đó còn có những mẫu chỉ đạt 10 ÷ 30% tế bào sau 7 ngày gây nhiễm. Kết quả quan sát hiện tƣợng CPE trong lần gây nhiễm thứ 2 hoàn toàn khác với lần gây nhiễm thứ nhất: 75/75 giếng gây nhiễm 75 mẫu virus đạt CPE trên 70%. Kết quả này phù hợp với mô tả của Li và cộng sự. (2008).
Bảng 3.3. Kết quả phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC – 145 lần 2.
Tỷ lệ tế bào xuất hiện CPE sau 7 ngày (%)
Kết quả C.P.E < 10% 10 - 30% 30 - 50% 50 - 70% > 70%
49 0 mẫu 8 mẫu + 15 mẫu + 27 mẫu + 25 mẫu +
Bảng 3.4. Kết quả phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC – 145 lần 2.
Tỷ lệ tế bào xuất hiện CPE sau 7 ngày (%)
CPE < 10% 10 - 30% 30 - 50% 50 - 70% > 70% 0 mẫu 0 mẫu 0 mẫu 0 mẫu 75 mẫu +
PRRSV xâm nhập vào tế bào bằng con đƣờng nhập nội tế bào qua trung gian receptor vimentin. Ngƣời ta đã xác định vimentin (1 loại intermediate filament protein) là thụ thể bề mặt và là một yếu tố quan trọng trong việc ổn định cấu trúc của tế bào MARC – 145. Theo Kim và cộng sự (2005), quá trình gây nhiễm của PRRSV cũng có thể bị ngăn chặn bằng cách sử dụng các loại kháng thể đơn dòng kháng vimentin (Kim et al, 2005). Nhƣ vậy, lần gây nhiễm thứ 1 quá trình gây bệnh tích tế bào diễn ra chậm (Bảng 3.3). Đối với lần gây nhiễm lần thứ hai, sau 7 ngày gây nhiễm tỷ lệ CPE của tất cả các chủng virus đều trên 70%. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu trƣớc đây (Iris và cộng sự, 2010; Li và cộng sự, 2008). Điều này có thể giải thích là do, ở lần gây nhiễm thứ nhất số lƣợng tế bào còn quá thấp và sự thích nghi của virus đối với tế bào chƣa cao (Iris và cộng sự, 2010).
50
Sau 2 lần gây nhiễm, chúng tôi phân lập đƣợc 75 chủng virus trên tế bào MARC – 145 (Bảng 3.4). Các chủng virus này đã đƣợc kiểm tra lại bằng phản ứng RT - PCR với cặp mồi Go3F và Go5F và thành phần phản ứng đƣợc mô tả phần 2.5.2.2. Kết quả sau điện di ghi nhận 75/75 các mẫu thu đƣợc đều dƣơng tính với PRRSV. Các chủng virus sau phân lập đƣợc thu lại và bảo quản ở - 800C cho tới khi thực hiện phản ứng tiếp theo. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR, kiểm tra kết quả phân lập virus thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Kết quả RT - PCR kiểm tra PRRSV sau phân lập trên môi trƣờng tế bào MARC - 145.
Ghi chú: Giếng M: Thanh marker DNA chuẩn (1000bp) Giếng +: Mẫu đối chứng dương (PRRSV TB-8). Giếng 1 - 8: Các chủng virus sau phân lập.
Theo nhận định của Kim và cộng sự (2005): tế bào MARC - 145 là dòng tế bào nhạy cảm với PRRSV nên thích hợp cho việc phân lập virus này. Theo Klaas và cộng sự (2011), có thể phân lập PRRSV từ mẫu huyết thanh, phổi, dịch lỏng khoang phúc mạc, hạch ạch huyết và amiđan. Nhƣ vậy, kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả công bố của 2 nhóm tác giả Kim và cộng sự (2005) và Klaas và cộng sự (2011). Sản phẩm điện di đƣợc tinh sạch bằng bộ kit QIAquick PCR Purification Kit. DNA sau tinh sạch làm nguyên liệu cho quá trình giải trình tự gen.
500 bp
720bp 1000 bp
51