1.2.5.1. Đáp ứng miễn dịch dịch thể
Thông thƣờng khi nhiễm virus, cơ thể động vật chống lại bằng cách tiết interferon (INF), các cytokine gây nhiễm để cản trở sự nhân lên và hạn chế sự lan tràn của virus. Khi lợn nhiễm PRRSV, hệ thống miễn dịch không chống virus tại chỗ nhiễm, không tiết ra INF - α và các cytokine gây nhiễm. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên yếu đối với virus PRRS dẫn đến kích thích không hoàn chỉnh đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Bên cạnh đó giảm hoặc triệt tiêu đáp ứng miễn dịch tự nhiên chống virus có thể tăng nguy cơ nhiễm trùng kế phát. PRRSV không kích thích cơ thể sản sinh các cytokine gây nhiễm, các cytokine này có vai trò rất quan trọng trong đáp ứng miễn dịch khởi phát đối với các virus gây bệnh đƣờng hô hấp.
Kháng thể dịch thể, đặc biệt là kháng thể trung hoà có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống lại PRRS. Các kháng thể lƣu hành chống lại PRRSV đƣợc phát hiện vào các ngày 5 - 7 ở lợn sau nhiễm và có sự biến đổi trong huyết thanh vào ngày 14 sau nhiễm, sau đó giảm xuống tới mức không phát hiện đƣợc vào ngày 42 sau nhiễm. Nồng độ IgG đạt giá trị tối đa vào khoảng các ngày 21 - 49 sau nhiễm với các kháng thể trung hoà.
Những kháng thể xuất hiện sớm nhất là kháng thể trực tiếp kháng lại protein nhân (N), tiếp theo là protein M, sau đến glycoprotein 5 (GP5) (Nelson và cộng sự, 1994). Một protein phi cấu trúc 2 (NSp2) chứa một cụm epitope B không trung hoà và chúng là những protein miễn dịch quan trọng nhất của PRRSV (Oleksiewicz và cộng sự, 2001). Hầu hết các test chẩn đoán chủ yếu phát hiện kháng thể kháng protein N. Những kháng thể này xuất hiện trong tuần đầu tiên sau nhiễm trùng và tồn tại trong vài tháng, nhƣng không có khả năng bảo vệ cơ thể bị nhiễm virus.
Kháng thể trung hoà đƣợc phát hiện ổn định vào ngày thứ 28 sau nhiễm hoặc muộn hơn, đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch với PRRSV, và có sự khác nhau trong nhiễm trùng tự nhiên so với tiêm phòng vaccine (Diaz, 2006).
Sự xuất hiện sớm của các kháng thể không trung hoà có thể tác động đáng kể đến sự tiến triển bệnh của PRRSV. Ngoài ra kháng thể không trung hoà làm tăng sự lây nhiễm của virus trong các túi thực bào của các đại thực bào, do tăng quá trình đáp ứng
24
phụ thuộc kháng thể. Đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng thể không trung hoà có thể tác động mạnh mẽ tới PRRSV thông qua việc thoát vỏ (“cởi áo”) của virus và làm tăng sự bắt giữ các tiểu phần virus trong các tế bào đại thực bào.
1.2.5.2. Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào
Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (CMI, cell mediated immunity) cũng vô cùng quan trọng trong miễn dịch chống lại PRRSV. Virus PRRS ngăn cản sự trình diện kháng nguyên và hoạt hoá tế bào lympho T. PRRSV làm giảm đáp ứng miễn dịch tự nhiên bằng cách thay đổi hình dạng của tế bào thực bào và giảm sự xuất hiện phân tử trình diện kháng nguyên đi kèm trên bề mặt tế bào đại thực bào trong việc trình diện kháng nguyên.
Những cá thể lợn đang bình phục có sự đáp ứng tăng sinh mạnh mẽ các tế bào lympho, hiện tƣợng này không đƣợc phát hiện trong 4 tuần sau nhiễm trùng và cùng với đáp ứng với kháng thể trung hoà (Bautista and Molitor, 1997). Các đáp ứng có vai trò cytokine, chủ yếu là interferon (IFN - c) và IL - 2 nhƣng vai trò interferon kéo dài ít hơn so với interleukin (Mateu và cộng sự, 2006).
Sự điều biến và lẩn tránh đáp ứng miễn dịch của PRRSV
Những đặc điểm bất thƣờng của phản ứng thích ứng miễn dịch đối với PRRSV cho thấy virus có khả năng điều biến mạnh mẽ chống lại đáp ứng miễn dịch của vật chủ.
+ Vai trò interferon: PRRSV tăng nhạy cảm với tác động của IFN type I, chúng có thể đã kháng lại với những phản ứng của IFN - α. Các chủng PRRSV khác nhau có khả năng tác động khác nhau không chỉ với IFN - α mà còn cả với INF - α; IL - 10 và IL - 2, trong túi thực bào của các đại thực bào và tế bào tua (dendritic cells). Sự giảm tiết IFN - α đƣợc gây ra do tác động tăng trƣởng của một hiệu ứng đáp ứng miễn dịch của tế bào T hỗ trợ type 1.
+ Vai trò Interleukin: IL - 10 có vai trò quan trọng trong điều hoà đáp ứng miễn dịch với PRRSV. Sau nhiễm trùng với PRRSV, hiệu giá của mRNA của IL - 10 đã tăng lên ở các tế bào phế nang phổi của lợn và trong dịch phế quản (Diaz, 2006).
25
+ Vai trò “tự chết” (apoptosis): Trong sự nhiễm trùng của lợn với PRRSV, các tế bào chết do cơ chế apoptosis đã đƣợc tìm thấy rải rác khắp nơi trong các mô bị nhiễm trùng (bao gồm: phổi, tinh hoàn và các hạch lympho). Phần lớn các tế bào apoptosis đã không bị nhiễm với PRRSV, nhƣ vậy rất có thể tế bào chết do apoptosis thông qua tín hiệu chuyển tải. PRRSV có khả năng trực tiếp gây ra apoptosis các tế bào đã tự chết một cách chủ động ở các con lợn bị nhiễm trùng, hoặc gián tiếp thông qua INF - α đƣợc giải phóng từ các đại thực bào sau nhiễm PRRSV, tác động gây ra apoptosis trong các tế bào không bị nhiễm trùng bên cạnh. Các tế bào tự chết có thể gián tiếp thông qua con đƣờng phụ thuộc AIF (apoptosis inducing factor), sảy ra thứ phát bởi các yếu tố kích ứng apoptosis do nhiễm trùng hoặc bởi các tế bào bên cạnh, chứ không phải là kết quả “đặc trƣng” trực tiếp của apoptosis ở tế bào bị nhiễm (Miller và cộng sự, 2004).
1.2.6. Vật chủ và phƣơng thức truyền lây
Vật chủ: PRRSV chỉ gây bệnh cho lợn, lợn ở tất cả các lứa tuổi đều cảm nhiễm, nhƣng lợn con và lợn nái mang thai thƣờng mẫn cảm hơn cả. Ngoài ra, lợn rừng cũng mắc bệnh và đây có thể đƣợc coi là nguồn dịch thiên nhiên và phát tán bệnh. Theo Tổ chức Nông lƣơng Thế giới (FAO), PRRS đƣợc xác định không lây truyền và gây bệnh sang gia súc khác và con ngƣời (Rossow,1998).
Đƣờng truyền lây: PRRSV có trong dịch mũi, nƣớc bọt, phân và nƣớc tiểu của lợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trƣờng; tinh dịch của lợn đực giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh. Ở lợn nái mang thai, virus có thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh. Lợn con nhiễm bệnh và lợn mang trùng có thể đào thải virus ra môi trƣờng trong vòng 6 tháng.
Bệnh truyền chủ yếu theo đƣờng không khí, có thể lây trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn ốm, lợn mang trùng với lợn khoẻ và cũng có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian (không khí, đất, nƣớc, thức ăn,…) bị nhiễm virus, virus có khả năng phát tán rộng và dễ gây nhiễm qua đƣờng hô hấp (Cho and Dee, 2006).
1.3. Vai trò của GP5 trong quá trình gây bệnh của PRRSV
Trong số các protein chức năng của PRRSV, protein vỏ GP5 đƣợc mã hóa bởi ORF5 của PRRSV. GP5 có trọng lƣợng phân tử khoảng 24 - 25kDa, là một protein
26
đƣợc glycosyl hóa có vai trò bám dính vào thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ . GP5 có tính kháng nguyên và có vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh của virus. Do vậy, GP5 đƣợc coi là protein đích trong nghiên cứu miễn dịch học, chẩn đoán, cũng nhƣ các nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống PRRS (Andrea và cộng sự, 2014; Han và cộng sự, 2006; Kumar và cộng sự,2008; Nedzad and Carl, 2010).
Cấu trúc của protein GP5 gồm có khoảng 30 aa đầu N là trình tự tín hiệu của GP5 điều kiển quá trình sản xuất protein vào trong màng lƣới nội chất (Thaa và cộng sự, 2013). Tiếp theo là vùng ectodomain (aa 32 ÷ aa 63), trong đó có chứa vùng biến thể cao giữa các chủng PRRSV (aa 32 ÷ aa 40). Sau vùng ectodomain là vùng Transmembrane (aa 64 ÷ aa 134), và kết thúc là vùng endodomain (aa 135 ÷ aa 200) (Hình 1.6) (Nedzad and Carl, 2010). Trong GP 5 có một số vị trí aa đƣợc glycosyl hóa và liên quan tới quá trình hình thành cấu trúc và duy trì hoạt tính của protein GP5 (aa 33, aa 44 và aa 51) (Thaa và cộng sự, 2013).
Hình 1.6. Cấu trúc và chức năng của protein GP5
27
Hình 1.7. Protein chức năng của PRRSV.
(http://www.mjbio.com/index.php).
Hình 1.8. Vai trò của GP5 trong quá trình bám dính tế bào. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(http://www.mjbio.com/index.php).
Protein GP5 và protein GP3 là hai loại protein cấu trúc màng của PRRSV dễ bị biến đổi nhất (Nedzad and Carl, 2010). Khi sảy ra đột biến protein GP5 vẫn có khả năng bám vào thụ thể của tế bào vật chủ và gây bệnh cho dù đàn lợn đã đƣợc tiêm vaccine
28
phòng bệnh (Hình 1.9, Hình 1.10). Sự khác nhau của gen ORF5 có thể đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp sinh học phân tử (Ansari và cộng sự, 2006).
Hình 1.9. RNA PRRSV đột biến tại vùng gen ORF5.
(http://www.mjbio.com/index.php).
Hình 1.10. Đột biến sảy ra ngoài vùng gen ORF5 của hệ gen PRRSV.
(http://www.mjbio.com/index.php).
Protein GP5 cùng với protein N là đích chủ yếu của kháng thể trung hòa, tham gia vào cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV. GP5 ngăn cản hiện tƣợng trình diện kháng nguyên virus của đại thực bào với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch trong cả miễn dịch dịch thể và qua trung gian tế bào (Faaberg và cộng sự, 2006; Nedzad and Carl, 2010). GP5 làm giảm sự phát triển của kháng thể trung hòa. GP5 chứa tối đa 4 vị trí glycosyl hóa, đƣợc định vị ở trong hoặc gần với epitope trung hòa. Epitope B là epitope trung hòa chủ yếu của PRRSV, định vị ở vùng xa đầu N của GP5
29
(aa 37 ÷ aa 44) (Ostrowski và cộng sự, 2002). Epitope A có tác dụng làm tăng đáp ứng miễn dịch, nằm ở vùng gần đầu N của GP5 (aa 27 và aa 36) và có đặc điểm của một epitope dạng lƣới (Ostrowski và cộng sự, 2002; Mater at al., 2006). Epitope dạng lƣới này có thể ngăn cản đáp ứng miễn dịch của những vùng epitope B trung hòa chủ yếu, kết quả là làm giảm đáp ứng miễn dịch của kháng thể trung hòa (Nedzad and Carl, 2010).
Bên cạnh đó, cùng với protein M, GP5 cũng tham gia vào quá trình bám dính, xâm nhập vào tế bào vật chủ. Đặc biệt hai loại protein này tham gia vào giai đoạn lắp giáp cuối cùng của virion và liên quan đến hiện tƣợng tự chết (apoptosis) của tế bào cơ thể nhiễm. Vùng gây ra hiện tƣợng apoptosis của protein GP5 đã đƣợc sơ đồ hóa tại vị trí aa 119 (Suarez và cộng sự, 1996; Miller and Fox., 200; Nedzad and Carl, 2010).
Nhƣ vậy, sự biến đổi của gen ORF5 dẫn tới làm biến đổi protein GP5, là một trong những nguyên nhân làm tăng lây nhiễm và khả năng gây bệnh của PRRSV, làm cho bệnh dịch PRRS ngày càng phức tạp do làm giảm hiệu quả phòng bệnh của các vaccine đang lƣu hành (Ostrowski và cộng sự, 2002).
Qua những hiểu biết về gen ORF5 có thể thấy rằng, phân lập PRRSV và giải mã trình tự gen ORF5 của PRRSV đƣơng nhiễm hiện nay là thực sự cần thiết, giúp chẩn đoán và xác định bệnh nhằm sớm khống chế bệnh dịch và khoanh vùng dịch tễ, giảm thiểu thiệt hại do bệnh dịch gây ra. Nghiên cứu gen ORF5 còn cho phép xác định mức độ biến đổi của PRRSV, quan trọng hơn đó là cung cấp dữ liệu di truyền của ORF5 giúp cho việc nghiên cứu, lựa chọn và phát triển và sản xuất các loại vaccine phù hợp với PRRSV đang lƣu hành.
30
Chƣơng 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc mục tiêu nghiên cứu, chúng tôi đặt ra một số nội dung nghiên cứu sau: - Kiểm tra sự có mặt của PRRSV trong các mẫu bệnh phẩm bằng phản ứng RT -
PCR.
- Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào MARC - 145.
- Giải trình tự đoạn gen ORF5 và phân tích dữ liệu trình tự bằng phƣơng pháp phân nhóm của công ty MJ - Biologic Hoa Kỳ.
- Xác định hiệu giá virus và kiểm tra độc lực của các chủng virus phân lập đƣợc.
2.2 . Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm - Bộ môn Nghiên cứu siêu vi trùng, Bộ môn Công nghệ sinh học và phòng chẩn đoán - Phân viện thú y miền trung - Nha Trang - Khánh Hòa.
- Thời gian nghiên cứu: từ 7/2014 - 7/2015
2.3. Đối tƣợng nghiên cứu
PRRSV phân lập từ lợn nhiễm bệnh tai xanh nuôi tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa.
2.4. Vật liệu nghiên cứu 2.4.1. Mẫu bệnh phẩm 2.4.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu nghiên cứu là mẫu mô và mẫu huyết thanh đƣợc thu thập trên lợn nghi ngờ nhiễm bệnh tai xanh đƣợc nuôi theo phƣơng thức hộ gia đình và trang trại.
2.4.2. Động vật thí nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lợn 4 - 6 tuần tuổi, khỏe mạnh, không nhiễm PRRSV, không có kháng thể kháng PRRSV. Mẫu huyết thanh đƣợc kiểm tra tại phòng chẩn đoán - Phân viên thú y miền Trung.
31
2.4.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 2.4.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị 2.4.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị
- Bộ điện di DNA (Bio - Rad, American).
- Tủ cấy (CLASS II, type A2, ESCO, Singapore). - Kính hiển vi điện tử (CKX41, OLYMPUS, Japan). - Lò vi sóng (EM - S5597W, SANYO, Japan).
- Máy PCR (Mastercycler proS, Eppendorf, Germany). - Máy realtime RT - PCR (iQ5, Biorad, USA ).
- Máy ly tâm lạnh (H36 ZK, HERMLE Labortechnik, Germany). - Máy soi gel (XR, Bio - Rad, USA).
- Máy khuấy từ (MS300HS, MISUNG, Korea). - Máy vortex (MS2, IKA, USA).
- Nồi hấp tiệt trùng ( HV - 85, Hirayama, Japan). - Tủ lạnh -200C ( HITACHI, Thailand).
- Tủ lạnh -800C (SANYO, Japan). - Tủ ấm CO2 (SANYO, Japan).
- Bộ pipetman (10µl, 20µl, 100µl, 200µl, 1000µl) và đầu côn các loại, lọ đựng môi trƣờng, chai nuôi cấy tế bào loại 25cm2
, 75cm2, đĩa 24 giếng và đĩa 96 giếng, lọc kích thƣớc 45µm…
2.4.3.2. Hóa chất
Hóa chất, môi trƣờng trong nghiên cứu - Agarose (Promega, USA).
- EDTA 0,5M, pH = 8 (Promega, USA).
- Ethanol 96% (Merck KgaA, Darmstadt, Germany). - HEPES 100ml (Gibco, USA).
- Huyết thanh bào thai bê (FBS) (Gibco, USA). - PBS 1X.
- Trypsin - EDTA (1X, 0.25%) (Gibco, USA). - Na2CO3 (Sodium cacbonate).
- Bộ kit SuperScript One step RT - PCR with Platinum Tap (Invitrogen, USA). - Các loại hóa chất dùng cho phản ứng PCR.
32
- Cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT – PCR, realtime RT – PCR, probe: Go5F Go3R; F7 và R7 (Integrated DNA Technologies, Coralville - Iowa, American). - Bộ kit tách RNA tổng số “QIAamp Viral RNA Mini Kit” (QIAGEN, Germany). - Kit tinh sạch sản phẩm PCR (QIAGEN, Germany: QIAquick PCR Purification Kit). - Môi trƣờng E’MEM (đã bổ sung 3% L - Glutamin, 0,5% HEPES buffer, 1%
kháng sinh Peni - Strept) (Gibco, USA). - Các loại hóa chất xử lý, vô hiệu hóa virus.
Các dung dịch dùng trong điện di trên thạch agarose. - Dung dịch đệm TBE 1X.
- Đệm tra mẫu (loading dye 6X): 0,25% bromophenol blue, 0,25% xylen cyanol FF, 30% glycerol.
- Dung dịch nhộm gel: ethidium bromide (EtBr, 0,5 mg/ml).
2.4.3.3. Chủng PRRSV đối chứng dƣơng
Chủng PRRSV TB - 8 lƣu giữ tại Phân viện Thú y miền Trung đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng dƣơng.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1 Phƣơng pháp thu mẫu và xử lý mẫu
Phƣơng pháp thu mẫu thực hiện theo OIE. (2010). Mẫu bệnh phẩm đƣợc thu tại các ổ dịch PRRS, các mẫu đƣơc lƣu trữ tại Chi cục thú y Khánh Hòa và Phân viện thú y miền Trung. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lợn nghi mắc bệnh tai xanh ở các đàn lợn nuôi trên toàn tỉnh Khánh Hòa đƣợc tiến hành lấy máu và mẫu phủ tạng. Mẫu máu đƣợc lấy ở tĩnh mạch tai hoặc tĩnh mạch cổ vào lúc 7 - 8 giờ sáng trƣớc khi cho lợn ăn. Sau khi lấy máu, giữ cố định xilanh máu để tránh vỡ hồng cầu và chuyển về phòng thí nghiệm trƣớc khi tiến hành tách huyết thanh.
Mẫu máu đƣợc ủ ở 37oC trƣớc khi tách huyết thanh. Huyết thanh đƣợc tách bằng cách ly tâm ở tốc độ 2.500 vòng/phút trong 5 phút. Huyết thanh sau khi tách đƣợc hút vào eppendorf vô trùng và bảo quản ở -80ºC.
33
Mẫu phủ tạng đƣợc nghiền nhỏ với cát vô trùng trong PBS 1X (1 gam mẫu bệnh phẩm nghiền trong 10ml PBS). Sau đó mẫu đƣợc ly tâm ở 5.000 vòng/phút trong 15 phút. Dịch nổi đƣợc hút vào eppendorf vô trùng và bảo quản ở -80ºC.
2.5.2. Phản ứng RT - PCR
2.5.2.1. Tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm
Tách chiết RNA tổng số từ những mẫu bệnh phẩm nghi ngờ dƣơng tính với PRRSV bằng bộ kit QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN). Thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất với các bƣớc thực hiện nhƣ sau: