Vật chủ: PRRSV chỉ gây bệnh cho lợn, lợn ở tất cả các lứa tuổi đều cảm nhiễm, nhƣng lợn con và lợn nái mang thai thƣờng mẫn cảm hơn cả. Ngoài ra, lợn rừng cũng mắc bệnh và đây có thể đƣợc coi là nguồn dịch thiên nhiên và phát tán bệnh. Theo Tổ chức Nông lƣơng Thế giới (FAO), PRRS đƣợc xác định không lây truyền và gây bệnh sang gia súc khác và con ngƣời (Rossow,1998).
Đƣờng truyền lây: PRRSV có trong dịch mũi, nƣớc bọt, phân và nƣớc tiểu của lợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trƣờng; tinh dịch của lợn đực giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh. Ở lợn nái mang thai, virus có thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh. Lợn con nhiễm bệnh và lợn mang trùng có thể đào thải virus ra môi trƣờng trong vòng 6 tháng.
Bệnh truyền chủ yếu theo đƣờng không khí, có thể lây trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn ốm, lợn mang trùng với lợn khoẻ và cũng có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian (không khí, đất, nƣớc, thức ăn,…) bị nhiễm virus, virus có khả năng phát tán rộng và dễ gây nhiễm qua đƣờng hô hấp (Cho and Dee, 2006).
1.3. Vai trò của GP5 trong quá trình gây bệnh của PRRSV
Trong số các protein chức năng của PRRSV, protein vỏ GP5 đƣợc mã hóa bởi ORF5 của PRRSV. GP5 có trọng lƣợng phân tử khoảng 24 - 25kDa, là một protein
26
đƣợc glycosyl hóa có vai trò bám dính vào thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ . GP5 có tính kháng nguyên và có vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh của virus. Do vậy, GP5 đƣợc coi là protein đích trong nghiên cứu miễn dịch học, chẩn đoán, cũng nhƣ các nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống PRRS (Andrea và cộng sự, 2014; Han và cộng sự, 2006; Kumar và cộng sự,2008; Nedzad and Carl, 2010).
Cấu trúc của protein GP5 gồm có khoảng 30 aa đầu N là trình tự tín hiệu của GP5 điều kiển quá trình sản xuất protein vào trong màng lƣới nội chất (Thaa và cộng sự, 2013). Tiếp theo là vùng ectodomain (aa 32 ÷ aa 63), trong đó có chứa vùng biến thể cao giữa các chủng PRRSV (aa 32 ÷ aa 40). Sau vùng ectodomain là vùng Transmembrane (aa 64 ÷ aa 134), và kết thúc là vùng endodomain (aa 135 ÷ aa 200) (Hình 1.6) (Nedzad and Carl, 2010). Trong GP 5 có một số vị trí aa đƣợc glycosyl hóa và liên quan tới quá trình hình thành cấu trúc và duy trì hoạt tính của protein GP5 (aa 33, aa 44 và aa 51) (Thaa và cộng sự, 2013).
Hình 1.6. Cấu trúc và chức năng của protein GP5
27
Hình 1.7. Protein chức năng của PRRSV.
(http://www.mjbio.com/index.php).
Hình 1.8. Vai trò của GP5 trong quá trình bám dính tế bào.
(http://www.mjbio.com/index.php).
Protein GP5 và protein GP3 là hai loại protein cấu trúc màng của PRRSV dễ bị biến đổi nhất (Nedzad and Carl, 2010). Khi sảy ra đột biến protein GP5 vẫn có khả năng bám vào thụ thể của tế bào vật chủ và gây bệnh cho dù đàn lợn đã đƣợc tiêm vaccine
28
phòng bệnh (Hình 1.9, Hình 1.10). Sự khác nhau của gen ORF5 có thể đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp sinh học phân tử (Ansari và cộng sự, 2006).
Hình 1.9. RNA PRRSV đột biến tại vùng gen ORF5.
(http://www.mjbio.com/index.php).
Hình 1.10. Đột biến sảy ra ngoài vùng gen ORF5 của hệ gen PRRSV.
(http://www.mjbio.com/index.php).
Protein GP5 cùng với protein N là đích chủ yếu của kháng thể trung hòa, tham gia vào cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV. GP5 ngăn cản hiện tƣợng trình diện kháng nguyên virus của đại thực bào với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch trong cả miễn dịch dịch thể và qua trung gian tế bào (Faaberg và cộng sự, 2006; Nedzad and Carl, 2010). GP5 làm giảm sự phát triển của kháng thể trung hòa. GP5 chứa tối đa 4 vị trí glycosyl hóa, đƣợc định vị ở trong hoặc gần với epitope trung hòa. Epitope B là epitope trung hòa chủ yếu của PRRSV, định vị ở vùng xa đầu N của GP5
29
(aa 37 ÷ aa 44) (Ostrowski và cộng sự, 2002). Epitope A có tác dụng làm tăng đáp ứng miễn dịch, nằm ở vùng gần đầu N của GP5 (aa 27 và aa 36) và có đặc điểm của một epitope dạng lƣới (Ostrowski và cộng sự, 2002; Mater at al., 2006). Epitope dạng lƣới này có thể ngăn cản đáp ứng miễn dịch của những vùng epitope B trung hòa chủ yếu, kết quả là làm giảm đáp ứng miễn dịch của kháng thể trung hòa (Nedzad and Carl, 2010).
Bên cạnh đó, cùng với protein M, GP5 cũng tham gia vào quá trình bám dính, xâm nhập vào tế bào vật chủ. Đặc biệt hai loại protein này tham gia vào giai đoạn lắp giáp cuối cùng của virion và liên quan đến hiện tƣợng tự chết (apoptosis) của tế bào cơ thể nhiễm. Vùng gây ra hiện tƣợng apoptosis của protein GP5 đã đƣợc sơ đồ hóa tại vị trí aa 119 (Suarez và cộng sự, 1996; Miller and Fox., 200; Nedzad and Carl, 2010).
Nhƣ vậy, sự biến đổi của gen ORF5 dẫn tới làm biến đổi protein GP5, là một trong những nguyên nhân làm tăng lây nhiễm và khả năng gây bệnh của PRRSV, làm cho bệnh dịch PRRS ngày càng phức tạp do làm giảm hiệu quả phòng bệnh của các vaccine đang lƣu hành (Ostrowski và cộng sự, 2002).
Qua những hiểu biết về gen ORF5 có thể thấy rằng, phân lập PRRSV và giải mã trình tự gen ORF5 của PRRSV đƣơng nhiễm hiện nay là thực sự cần thiết, giúp chẩn đoán và xác định bệnh nhằm sớm khống chế bệnh dịch và khoanh vùng dịch tễ, giảm thiểu thiệt hại do bệnh dịch gây ra. Nghiên cứu gen ORF5 còn cho phép xác định mức độ biến đổi của PRRSV, quan trọng hơn đó là cung cấp dữ liệu di truyền của ORF5 giúp cho việc nghiên cứu, lựa chọn và phát triển và sản xuất các loại vaccine phù hợp với PRRSV đang lƣu hành.
30
Chƣơng 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc mục tiêu nghiên cứu, chúng tôi đặt ra một số nội dung nghiên cứu sau: - Kiểm tra sự có mặt của PRRSV trong các mẫu bệnh phẩm bằng phản ứng RT - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PCR.
- Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào MARC - 145.
- Giải trình tự đoạn gen ORF5 và phân tích dữ liệu trình tự bằng phƣơng pháp phân nhóm của công ty MJ - Biologic Hoa Kỳ.
- Xác định hiệu giá virus và kiểm tra độc lực của các chủng virus phân lập đƣợc.
2.2 . Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm - Bộ môn Nghiên cứu siêu vi trùng, Bộ môn Công nghệ sinh học và phòng chẩn đoán - Phân viện thú y miền trung - Nha Trang - Khánh Hòa.
- Thời gian nghiên cứu: từ 7/2014 - 7/2015
2.3. Đối tƣợng nghiên cứu
PRRSV phân lập từ lợn nhiễm bệnh tai xanh nuôi tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa.
2.4. Vật liệu nghiên cứu 2.4.1. Mẫu bệnh phẩm 2.4.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu nghiên cứu là mẫu mô và mẫu huyết thanh đƣợc thu thập trên lợn nghi ngờ nhiễm bệnh tai xanh đƣợc nuôi theo phƣơng thức hộ gia đình và trang trại.
2.4.2. Động vật thí nghiệm
Lợn 4 - 6 tuần tuổi, khỏe mạnh, không nhiễm PRRSV, không có kháng thể kháng PRRSV. Mẫu huyết thanh đƣợc kiểm tra tại phòng chẩn đoán - Phân viên thú y miền Trung.
31
2.4.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 2.4.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị 2.4.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị
- Bộ điện di DNA (Bio - Rad, American).
- Tủ cấy (CLASS II, type A2, ESCO, Singapore). - Kính hiển vi điện tử (CKX41, OLYMPUS, Japan). - Lò vi sóng (EM - S5597W, SANYO, Japan).
- Máy PCR (Mastercycler proS, Eppendorf, Germany). - Máy realtime RT - PCR (iQ5, Biorad, USA ).
- Máy ly tâm lạnh (H36 ZK, HERMLE Labortechnik, Germany). - Máy soi gel (XR, Bio - Rad, USA).
- Máy khuấy từ (MS300HS, MISUNG, Korea). - Máy vortex (MS2, IKA, USA).
- Nồi hấp tiệt trùng ( HV - 85, Hirayama, Japan). - Tủ lạnh -200C ( HITACHI, Thailand).
- Tủ lạnh -800C (SANYO, Japan). - Tủ ấm CO2 (SANYO, Japan).
- Bộ pipetman (10µl, 20µl, 100µl, 200µl, 1000µl) và đầu côn các loại, lọ đựng môi trƣờng, chai nuôi cấy tế bào loại 25cm2
, 75cm2, đĩa 24 giếng và đĩa 96 giếng, lọc kích thƣớc 45µm…
2.4.3.2. Hóa chất
Hóa chất, môi trƣờng trong nghiên cứu - Agarose (Promega, USA).
- EDTA 0,5M, pH = 8 (Promega, USA).
- Ethanol 96% (Merck KgaA, Darmstadt, Germany). - HEPES 100ml (Gibco, USA).
- Huyết thanh bào thai bê (FBS) (Gibco, USA). - PBS 1X.
- Trypsin - EDTA (1X, 0.25%) (Gibco, USA). - Na2CO3 (Sodium cacbonate). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bộ kit SuperScript One step RT - PCR with Platinum Tap (Invitrogen, USA). - Các loại hóa chất dùng cho phản ứng PCR.
32
- Cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT – PCR, realtime RT – PCR, probe: Go5F Go3R; F7 và R7 (Integrated DNA Technologies, Coralville - Iowa, American). - Bộ kit tách RNA tổng số “QIAamp Viral RNA Mini Kit” (QIAGEN, Germany). - Kit tinh sạch sản phẩm PCR (QIAGEN, Germany: QIAquick PCR Purification Kit). - Môi trƣờng E’MEM (đã bổ sung 3% L - Glutamin, 0,5% HEPES buffer, 1%
kháng sinh Peni - Strept) (Gibco, USA). - Các loại hóa chất xử lý, vô hiệu hóa virus.
Các dung dịch dùng trong điện di trên thạch agarose. - Dung dịch đệm TBE 1X.
- Đệm tra mẫu (loading dye 6X): 0,25% bromophenol blue, 0,25% xylen cyanol FF, 30% glycerol.
- Dung dịch nhộm gel: ethidium bromide (EtBr, 0,5 mg/ml).
2.4.3.3. Chủng PRRSV đối chứng dƣơng
Chủng PRRSV TB - 8 lƣu giữ tại Phân viện Thú y miền Trung đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng dƣơng.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1 Phƣơng pháp thu mẫu và xử lý mẫu
Phƣơng pháp thu mẫu thực hiện theo OIE. (2010). Mẫu bệnh phẩm đƣợc thu tại các ổ dịch PRRS, các mẫu đƣơc lƣu trữ tại Chi cục thú y Khánh Hòa và Phân viện thú y miền Trung.
Lợn nghi mắc bệnh tai xanh ở các đàn lợn nuôi trên toàn tỉnh Khánh Hòa đƣợc tiến hành lấy máu và mẫu phủ tạng. Mẫu máu đƣợc lấy ở tĩnh mạch tai hoặc tĩnh mạch cổ vào lúc 7 - 8 giờ sáng trƣớc khi cho lợn ăn. Sau khi lấy máu, giữ cố định xilanh máu để tránh vỡ hồng cầu và chuyển về phòng thí nghiệm trƣớc khi tiến hành tách huyết thanh.
Mẫu máu đƣợc ủ ở 37oC trƣớc khi tách huyết thanh. Huyết thanh đƣợc tách bằng cách ly tâm ở tốc độ 2.500 vòng/phút trong 5 phút. Huyết thanh sau khi tách đƣợc hút vào eppendorf vô trùng và bảo quản ở -80ºC.
33
Mẫu phủ tạng đƣợc nghiền nhỏ với cát vô trùng trong PBS 1X (1 gam mẫu bệnh phẩm nghiền trong 10ml PBS). Sau đó mẫu đƣợc ly tâm ở 5.000 vòng/phút trong 15 phút. Dịch nổi đƣợc hút vào eppendorf vô trùng và bảo quản ở -80ºC.
2.5.2. Phản ứng RT - PCR
2.5.2.1. Tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm
Tách chiết RNA tổng số từ những mẫu bệnh phẩm nghi ngờ dƣơng tính với PRRSV bằng bộ kit QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN). Thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất với các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
- Bƣớc 1: hút 560µl Buffer AVL - carrier RNA trong tube 1,5ml sạch.
- Bƣớc 2: thêm 140µl dịch mẫu bệnh phẩm đã qua xử lý vào ống tube có chứa sẵn AVL, trộn đều trên máy vortex trong 15 giây, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút. - Bƣớc 3: thêm 560µl ethanol 100% vào và vortex nhanh trong 15 giây.
- Bƣớc 4: hút chuyển 630µl hỗn hợp sang cột có màng lọc (QIAamp Mini column), ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 1 phút, bỏ dịch.
- Bƣớc 5: chuyển 630µl hỗn hợp còn lại sang cột và thực hiện nhƣ bƣớc 4.
- Bƣớc 6: thêm 500µl buffer AW1 vào, ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 1 phút, bỏ dịch.
- Bƣớc 7: thêm 500µl buffer AW2 vào, ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/ phút trong 3 phút. Bỏ dịch và ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/ phút trong 1 phút để lể làm khô hoàn toàn màng lọc.
- Bƣớc 8: chuyển cột thu ở bƣớc 7 vào một ống effendoft 1,5 ml sạch, thêm 60µl buffer AVE, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 1 phút, thu dịch. Bảo quản mẫu RNA ở nhiệt độ -80oC.
2.5.2.2. Phản ứng RT - PCR
Mục đích
Thu nhận một lƣợng lớn các phân tử DNA của vùng gen ORF5, sản phẩm RT- PCR với cặp mồi đặc hiệu, làm nguyên liệu cho quá trình điện di kiểm tra kích thƣớc sản phẩm RT-PCR để phát hiện các chủng PRRSV trong 100 mẫu bệnh phẩm nghi ngờ dƣơng tính với PRRSV.
34 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành:
Thực hiện chuỗi phản ứng RT - PCR nhân đoạn gen ORF5 với mẫu RNA tổng số thu nhận ở trên, sử dụng cặp mồi Go3F và Go5R để nhân đoạn gen ORF5 bằng bộ kit RT - PCR one step (invitrogen), trình tự cặp mồi nhƣ ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các mồi trong phản ứng RT - PCR
(Tony và cộng sự, 2001).
Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’- 3’) Tm (0C) Nồng độ sử dụng Độ dài của sản phẩm thu đƣợc Go3F GAGACCATGAGGTGGGCAAC 58,2 10µM 720bp Go5R CGCCAAAAGCACCTTTTGT 54,6 10µM Các thành phần phản ứng RT - PCR đƣợc trình bày ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng RT - PCR/ 1 ống eppendorf cho PCR. Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc tinh khiết (free RNA) 6,0
2X Reaction 12,5
Mồi xuôi Go3F 0,5
Mồi ngƣợc Go5R 0,5
Enzyme mix 0,5
Khuôn RNA tổng số 5,0
Tổng thể tích 25
Phản ứng RT - PCR thực hiện trên máy luân nhiệt Model Techne TC - 512 với chu trình nhiệt của phản ứng gồm các giai đoạn sau: 1) 500C trong 15 phút, 950C trong 2 phút, 1 chu kỳ của 950C trong 10 giây, 620C trong 30 giây, 680C trong 30 giây, 1 chu
35
kỳ của 950C trong 10 giây, 600C trong 30 giây, 680C trong 30 giây, 1 chu kỳ của 950C trong 10 giây, 580C trong 30 giây, 680C trong 30 giây, cuối cùng ở 250C trong 10 giây. Kích thƣớc trình tự DNA mục tiêu của sản phẩm RT - PCR là 720bp. Sản phẩm sau điện di đƣợc bảo quản ở 40C.
2.5.2.3. Kỹ thuật điện di kiểm tra sản phẩm RT - PCR
- Mục đích: kiểm tra kích thƣớc DNA sản phẩm RT - PCR.
- Tiến hành: thực hiện điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 1% bằng bộ điện di DNA (Bio - Rad), đọc kết quả trên máy soi gel (Phụ lục 1).
2.5.3. Phƣơng pháp phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC - 145
Để tiến hành phân lập PRRSV trên môi trƣờng tế bào MARC - 145, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy dựa trên mô tả của OIE. (2010) và kết hợp theo quy trình phân lập virus ở mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với PRRSV đƣợc chuẩn hóa theo quy trình nghiên cứu thƣờng qui của Bộ môn nghiên cứu siêu vi trùng - Phân viện thú y miền Trung.
2.5.3.1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC - 145
MARC - 145 thuộc nhóm tế bào biểu mô và là loại tế bào dòng có nguồn gốc từ tế bào MA - 104. MA - 104 là những tế bào dòng ở đời 104 có nguồn gốc từ tế bào thai thận khỉ châu Phi. Các dòng tế bào này phát triển tốt ở 370C, 5% CO2 trong môi trƣờng nuôi cấy DMEM hoặc E’MEM có bổ sung 10% FBS (Lei và cộng sự, 2013).
Tế bào MARC - 145 đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng trong ở nhiệt độ -196ºC, sau khi lấy ra khỏi môi trƣờng nitơ lỏng MARC - 145 đƣợc làm ấm ở nhiệt độ phòng cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đó hút 1ml tế bào MARC - 145 chuyển vào bình 25cm2
có chứa 10ml môi trƣờng E’MEM (10% FBS). Dùng pipet 10ml đảo nhẹ để hỗn hợp đồng nhất, lắc nhẹ bình 25cm2 để các tách rời các tế bào.
Quan sát tế bào dƣới kính hiển vi, nếu các tế bào đã tách rời nằm rải rác trong môi trƣờng, không bám thành cụm thì đem nuôi cấy tế bào ở 37ºC, 5% CO2. Sau 48 giờ nuôi cấy, quan sát tế bào nếu tế bào đã mọc đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành 1 lớp thì có thể dùng để cấy chuyển hoặc gây nhiễm PRRSV.
36
2.5.3.2. Phƣơng pháp cấy chuyển tế bào MARC - 145.
Cấy chuyển tế bào đƣợc thực hiện khi tế bào đã mọc dầy bề mặt nuôi cấy, các bƣớc thực hiện quá trình cấy chuyển nhƣ sau:
- Bƣớc 1: hút bỏ môi trƣờng trong bình nuôi cấy. Rửa lớp tế bào bằng 5 ml PBS 1X. - Bƣớc 2: hút 1ml trypsin 0,05% vào bình nuôi cấy, ủ bình trong tủ ấm ở 37ºC, 5% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CO2 trong 10 phút để trypsin thực hiện phiện phản ứng cắt tách các tế bào thành những tế bào đơn.
- Bƣớc 3: cấy chuyển tế bào MARC - 145 sang 2 bình 25cm2
mới và đĩa 24 giếng. Cấy chuyển tế bào MARC - 145 sang 2 bình 25cm2 mới: hút 20ml môi trƣờng