Đã có rất nhiều nghiên cứu về quá trình xâm nhập của PRRSV vào tế bào vật chủ, kết quả đều chỉ ra rằng một trong những trung gian đầu tiên đƣợc xác định để gắn vào các đại thực bào phế nang phổi đó là sulfate heparan và vimentin là thụ thể của tế bào MARC - 145 (Delputte và cộng sự, 2002). Sulfate heparan có mặt trên hầu hết các tế bào và là một phần của proteoglycans hình thành lên glycosaminoglycans và có vai trò rất quan trọng đối với quá trình bám dính và điều chỉnh ligand ngoài tế bào. Đầu tiên PRRSV sẽ bám dính vào tế bào đại thực bào qua sulfate heparan sau đó virus xâm nhập nội bào qua sialoadhesin (glycoprotein xuyên màng) cũng có thể liên kết với virus PRRS (Vanderheijden và cộng sự, 2003). Tuy nhiên sialoadhesin không có mặt trên bề mặt tế bào MARC - 145 (Jay và cộng sự, 2007). Vimentin đƣợc xác định là trung gian
20
gắn kết giữa tế bào MARC - 145 và nucleocapsid của PRRSV. Bình thƣờng đại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, virus xâm nhập vào tế bào bằng con đƣờng nhập nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor, riêng đối với PRRSV, virus có thể nhân lên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) (phòng Dịch tễ - Cục Thú y).
Bằng kính hiển vi điện tử, ngƣời ta phát hiện những tiểu phần của virus hiện diện trong những khoang nhỏ. Kháng nguyên virus có thể phát hiện ngay 6 giờ sau gây nhiễm (Dea, 2000; Pol, 1997). Trong giai đoạn nhiễm logarit (2 - 3 ngày sau gây nhiễm) là quá trình hình thành và lây lan các cụm tế bào. Các cụm tế bào xuất hiện trƣớc sau đó mới sảy ra hiệu ứng CPE (Nedzad and Carl, 2010). PRRSV đƣợc lắp ráp khi nucleocapsid xuất hiện trong khoang của lƣới nội chất không hạt hay vùng Golgi hoặc cả hai. Trong tế bào gây nhiễm MARC - 145, protein M định vị tại bộ Golgi và protein N định vị quanh nhân và hạch nhân. Lớp vỏ bọc ngoài (envelope) chủ yếu đƣợc hình thành trong khoang của lƣới nội chất và cũng là nguyên nhân làm cho bào quan này phình to ra (Dea và cộng sự, 1995;Mardassi và cộng sự, 1994; Pol, 1997). Sau khi hình thành, virion đƣợc tập hợp lại và di chuyển ra màng bào tƣơng để giải phóng virus (Meulenberg, 2000). Sau khi nuôi cấy 9 - 12 giờ, các tế bào bị xâm nhiễm sẽ vỡ ra và giải phóng các hạt virus trƣởng thành (Pol and Wagenaar, 1997).
Hình 1.5. Đại thực bào trƣớc và sau khi bào bị nhiễm PRRSV
(http://vietbao.vn/vi/Suc-khoe/Da-tim-ra-thu-pham/30173412/248/)
PRRSV mã hoá các sản phẩm gen mà chúng có thể gây ra apoptosis, một kiểu chết phổ biến, đóng vai trò quan trọng trong sự cân bằng nội tại và loại bỏ những tế bào tổn thƣơng và già cỗi. Ngƣời ta xác định đƣợc protein GP5 của virus là tác nhân gây ra
21
hiện tƣợng apoptosis (Meulenberg, 2000). Những thay đổi có tính thoái hoá do apoptosis gây ra trong tế bào bao gồm nhân tế bào cô đặc lại, vỡ ra, không bào bị thoái hoá, tế bào chất cô đặc, nhiễm sắc thể bị đứt ra từng mảnh. Bệnh tích tế bào do PRRSV gây ra là: tế bào co tròn, tập trung lại, sau đó dày lên, nhân co lại và cuối cùng là tách khỏi tế bào một lớp sau 48 - 96 giờ nuôi cấy (Suarez, 2000; Benfield và cộng sự,1992). Virus đạt đỉnh cao lúc 24 - 48 ngày và có thể duy trì tới 60 - 70 giờ sau nuôi cấy, toàn bộ lớp tế bào bong ra sau 6 ngày (Meng và cộng sự, 1996). Trong quá trình nhân lên của PRRSV trên môi trƣờng tế bào MA - 104 (hoặc MARC - 145), hiệu giá virus có thể đạt tối đa 108,5 TCID50/0,1ml sau 48 - 72 giờ nuôi cấy (Kim và cộng sự,1993).
Khi gây nhiễm tế bào, hầu hết các chủng PRRSV đều gây bệnh tích tế bào nhƣng vẫn có một số chủng PRRSV thì không (Christianson and Joo, 1994; Yoon và cộng sự, 1992). Kết quả cũng tƣơng tự trên dòng tế bào PAM khi gây nhiễm PRRSV (Wensvoort., 1992). PRRSV thuộc dòng Bắc Mỹ phát triển khá tốt trên MARC-145 trong khi các dòng PRRSV của Châu Âu phát triển nhanh hơn trên PAM. Nhiều phòng thí nghiệm ở Hàn Quốc và Bắc Mỹ chỉ sử dụng MARC - 145 vì khó khăn khi phải nuôi cấy PAM (Chung và cộng sự, 2002). Một nghiên cứu khác cho thấy sau 40 giờ nuôi cấy, gần 40% tế bào PAM có bệnh tích tế bào. Tuy nhiên, kết quả này có thể thay đổi giữa các phòng thí nghiệm (Bloemraad, 1994; Yoon, 2003).
Vấn đề quan trọng bậc nhất trong nuôi cấy tế bào động vật là môi trƣờng nuôi cấy phải đủ chất dinh dƣỡng, nhân tố sinh trƣởng, độ pH và nồng độ muối ổn định, đồng thời phải có hệ thống thải bỏ các sản phẩm trao đổi độc hại để tế bào có thể sống và phát triển đƣợc. Môi trƣờng đặc trƣng dù ng trong nuôi cấy tế bào đô ̣ng vâ ̣t bao g ồm các amino axit, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trƣởng, muối khoáng và glucose. Ngoài ra, môi trƣờng cần đƣợc cung cấp tƣ̀ 2 - 20% (theo thể tích) huyết thanh của động vật có vú . Môi trƣờng nuôi cấy phải đẳng trƣơng để duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu. Ngƣời ta thƣờng dùng bicacbonate để tạo hệ đệm kết hợp với hệ làm giàu CO2 môi trƣờng (5 - 10% CO2/95% không khí) trong đó tế bào đƣợc nuôi. Độ pH thích hợp là 7,4 và sử dụng phenol red để kiểm tra độ pH của môi trƣờng. Tế bào MARC - 145 phát triển tốt ở 370C trong môi trƣờng nuôi cấy DMEM (Dulbecco’s minimum essential medium) hoặc E’MEM (Eagle's Minimum Essensial Medium), 10% FBS và có bố sung kháng sinh penicillin (Lei và cộng sự, 2013).
22