Phân lập, lưu trữ và nghiên cứu khả năng sinh trưởng của tảo Dunaliella sp. có trên các ruộng muối ở địa bàn tỉnh Khánh Hòa

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình thái các loài tảo thuộc chi Dunaliella ...16 Hình 1.2: Sự sinh trưởng của Dunaliella salina trong môi trường có nồng độ NaCl khác nhau.. Glycerol nội bào v

PHẠM THỊ LAN

PHÂN LẬP, LƯU TRỮ VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH

TRƯỞNG CỦA TẢO DUNALIELLA SP CÓ TRÊN CÁC

RUỘNG MUỐI Ở ĐỊA BÀN TỈNH KHÁNH HÒA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(Chuyên ngành Công nghệ sinh học)

NHA TRANG – THÁNG 07 NĂM 2013

PHẠM THỊ LAN

PHÂN LẬP, LƯU TRỮ VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH

TRƯỞNG CỦA TẢO DUNALIELLA SP CÓ TRÊN CÁC

RUỘNG MUỐI Ở ĐỊA BÀN TỈNH KHÁNH HÒA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(Chuyên ngành Công nghệ sinh học)

GVHD: ThS NGUYỄN THỊ HẢI THANH

NHA TRANG – THÁNG 07 NĂM 2013

LỜI CẢM ƠN

Trong 4 năm qua, em đã được học tập, quen biết với nhiều bạn bè, được tiếp thu nhiều kiến thức bổ ích, được biết đến các máy móc thiết bị, được nghiên cứu và học tập nâng cao trình độ tay nghề để có một nghề nghiệp ổn định trong tương lai

Để đạt những kết quả đó, em xin kính gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường

đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong năm tháng ngồi trên ghế nhà trường và trong suốt thời gian em thực hiện đề tài này

Qua đây em kính gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn, kiến thức cuộc sống để em có thể vững vàng bước vào đời

Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

ThS Nguyễn Thị Hải Thanh người đã tạo điều kiện về vật chất, kinh phí và tài liệu tốt nhất cho em làm thực tập Sự chỉ bảo, hướng dẫn nhiệt tình của cô là sự động viên lớn cho em vượt qua khó khăn để thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

Nha Trang, tháng 07 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Lan

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vii

MỞ ĐẦU viii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 VÀI NÉT VỀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI TẢO 1

1.2 VAI TRÒ SINH THÁI VÀ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG CỦA VI TẢO 1

1.2.1 Vai trò sinh thái của vi tảo 1

1.2.2 Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của vi tảo 2

1.2.3 Ứng dụng của vi tảo 6

1.2.3.1 Sử dụng vi tảo làm nguồn thực phẩm cho con người và động vật .6

1.2.3.2 Khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ tảo 6

1.2.3.3 Sử dụng vi tảo trong xử lý ô nhiễm môi trường 7

1.2.3.4 Sử dụng vi tảo làm nhiên liệu sinh học 7

1.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA VI TẢO 8

1.3.1 Ánh sáng 8

1.3.2 pH môi trường 9

1.3.3 Chế độ sục khí 9

1.3.4 Nhiệt độ 10

1.3.5 Nguồn dinh dưỡng 11

1.4 Tổng quan về tảo Dunaliella .13

1.4.1 Đặc điểm sinh học, hình thái và phân loại của Dunaliella 14

1.4.2 Điều hòa áp suất thẩm thấu và sản xuất glycerol 17

1.4.3 β-caroten 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

2.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 25

2.4.1 Phân lập tảo Dunaliella sp 25

2.4.2 Nuôi cấy và bảo quản giống tảo Dunaliella 26

2.4.2.1 Quy trình nuôi cấy dự kiến 26

2.4.2.2 Lưu giữ trên môi trường thạch 28

2.4.2.3 Lưu giữ giống trên môi trường lỏng 28

2.4.3 Xác định mật độ tảo bằng phương pháp đếm tế bào bằngbuồng đếm hồng cầu 29

2.4.4 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng của tảo Dunaliella 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Phân lập tảo Dunaliella 37

3.1.1 Phân bố của tảo dunaliella trên ruộng muối Khánh Hòa 37

3.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái, vị trí phân loại của tảo Dunaliella 39

3.2 Lưu giữ, bảo quản và nhân giống tảo Dunaliella sp 43

3.3 Ảnh hưởng các yếu tố môi trường đến sinh trưởng của chủng tảo NT6 44

3.3.1 Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 44

3.3.2 Xác định mật độ nuôi cấy thích hợp 46

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt nuôi đến sự sinh trưởng của chủng NT6 46

3.3.4 Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng của chủng NT6 48

3.3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng của chủng NT6 50

3.3.6 Xây dựng đường cong sinh trưởng 51

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO a PHỤ LỤC f

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình thái các loài tảo thuộc chi Dunaliella .16

Hình 1.2: Sự sinh trưởng của Dunaliella salina trong môi trường có nồng

độ NaCl khác nhau Loài tảo này có thể phát triển trong môi trường có phổ muối rộng, từ 0.17 M đến 4M NaCl 17 Hình 1.3: Hàm lượng glycerol nội bào có chức năng cân bằng với NaCl

ngoại bào trong Dunaliella salina Glycerol nội bào và hàm lượng

chất diệp lục trong các tế bào đã được xác định tăng trong môi trường có nồng độ muối chỉ định 17 Hình 1.4: Các phản ứng trong quá trình tổng hợp glycerol của Dunaliella

salina trong 1M NaCl và bị gây stress bằng cách chuyển đến 3M

NaCl Thời gian được tính từ thời điểm chuyển sang nồng độ muối cao hơn 18 Hình 1.5: Con đường sinh tổng hợp glycerol trong Dunaliella 19

Hình 1.6: Bốn loài D Parva, D salina, D viridis and D pseudosalina sinh

trưởng trong NaCl 4.0 M (A), Bể muối ở Gave-Khooni Salt

Marsh, Iran có mặt D salina màu đỏ cam (B), hình dạng của D salina sinh trưởng trong NaCl 4 M (C) và hình dạng của D salina

sinh trưởng trong NaCl 2M(D) 21 Hình 2.1: Quy trình nuôi cấy dự kiến 27 Hình 2.2: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng và

phát triển của tảo Dunaliella sp .31

Hình 2.3: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của mật độ ban đầu đến sinh trưởng

và phát triển của tảo Dunaliella sp .32

Hình 2.4: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát

triển của tảo Dunaliella sp .33

Hình 2.5: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và

phát triển của tảo Dunaliella sp .34

Hình 2.6: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng và phát

triển của tảo Dunaliella sp .35

Hình 2.7: Sơ đồ xác định đường cong sinh trưởng của tảo Dunaliella sp 36

Hình 3.1: Quá trình phân lập chi tảo thuần Dunaliella sp đã được phân lập 37

Hình 3.2: Hình thái chủng NT6 (A) và kích thước tế bào chủng NT6 (B) trên kính hiển vi quang học (100X); mũi tên màu vàng chỉ điểm mắt (eyespot) 40

Hình 3.3: Tảo D salina NT6 trên kính hiển vi quang học(100X); mũi tên màu đỏ chỉ thể lạp hình chén .41

Hình 3.4: Hình thái chủng ND12(A) và kích thước tế bào chủng ND12 (B) trên kính hiển vi quang học (100X); mũi tên màu đỏ chỉ roi, mũi tên màu vàng chỉ điểm mắt (eyespot), mũi tên màu cam thể hiện thể lạp hình chén 42

Hình 3.5: Hình thái chủng NT13 (A) và kích thước tế bào chủng NT13 (B) trên kính hiển vi quang học (100X) .43

Hình 3.6: Lưu giữ tảo Dunaliella 44

Hình 3.7: Sinh trưởng phát triển của tảo NT6 trong các môi trường 44

Hình 3.8: Sinh trưởng phát triển của tảo NT6 theo mật độ ban đầu 46

Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến mật độ tế bào chủng NT6 47

Hình 3.10: Lô thí nghiệm nuôi tảo tại các cường độ ánh sáng khác nhau 48

Hình 3.11: Sinh trưởng phát triển của tảo NT6 theo ánh sáng 48

Hình 3.12: Sinh trưởng phát triển của tảo NT6 theo độ mặn 50

Hình 3.13: Đường cong sinh trưởng 51

MỞ ĐẦU

Vi tảo là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn của thủy vực Một số vi tảo là nguồn thực phẩm của con người, các chất được chiết xuất từ vi tảo được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và nhiều ngành công nghiệp khác Hiện nay và trong tương lai, công dụng của tảo sẽ phát triển trong lĩnh vực năng lượng, sản xuất thực phẩm và nhiều ứng dụng khác trong đời sống [21]

Sinh khối vi tảo được ứng dụng không chỉ là nguồn thức ăn cho nuôi trồng thuỷ sản mà còn được dùng làm thức ăn bổ dưỡng cho người và động vật, nguồn phân bón sinh học, nguồn tách chiết hoá chất phục vụ cho công nghiệp và dược phẩm β-caroten, protein, polysaccharide, acid béo không no như: gamma linolenic acid (GLA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), vitamine…là những hợp chất có trong thành phần cấu tạo của vi tảo đã được con người khai thác và sử dụng [21] Vai trò quan trọng của vi tảo thể hiện qua quá trình quang hợp hấp thụ CO2, cung cấp O2 cho các sinh vật khác trên trái đất, khép kín vòng tuần hoàn vật chất và làm tăng tốc độ quay vòng của các chu trình đó [4]

Tảo Dunaliella chứa nguồn caroten giàu có nhất Để tích lũy β-caroten cần

độ mặn cao, nhiệt độ cao và cường độ chiếu sáng lớn, các nghiên cứu đã chỉ ra ở độ

mặn trên 27% NaCl D salina có thể tích lũy được lượng carotenoit lên tới 14%

trọng lượng khô và có hoạt tính cao gấp nhiều lần so với caroten thực vật [12] Caroten là tiền chất của vitamin A, có tác dụng bảo vệ thị giác, tăng cường sức khoẻ

β-và sức đề kháng cho cơ thể, chống thoái hóa điểm β-vàng ở người cao tuổi Nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ vai trò và ích lợi của β-caroten trên hệ miễn dịch, ngăn ngừa nhiều loại ung thư và giảm tác hại của ánh nắng mặt trời Trên thế giới việc

việc nghiên cứu Dunaliella tổng hợp β-caroten không còn xa lạ, hằng năm mang lại

nguồn lợi vô cùng to lớn Tuy nhiên, ở Việt Nam có rất ít tài liệu nghiên cứu sinh

trưởng và khả năng sinh tổng hợp β-caroten của Dunaliella Khánh Hòa có đường

bờ biển dài, cường độ chiếu sáng mạnh quanh năm, vào mùa khô nhiệt độ luôn duy trì ở mức độ ổn định 25-35oC Hơn nữa, Khánh Hòa có các ruộng muối có độ mặn

cao, vì vậy là điều kiện rất tốt để vừa xen canh làm muối, vừa nuôi trồng vi tảo biển sinh carotenoit Do đó việc phân lập và nghiên cứu khả năng sinh β-caroten của các chủng vi tảo biển có khả năng mang lại lợi nhuận cao cho nền kinh tế

Xuất phát từ lý do trên, tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Phân lập, lưu trữ

và nghiên cứu khả năngsinh trưởng của tảo Dunaliella sp có trên các ruộng

muối ở địa bàn tỉnh Khánh Hòa’’

Nội dung chủ yếu của đề tài:

Phân lập và tuyển chọn được tảo Dunaliella sp từ ruộng muối

Xác định được môi trường nuôi cấy thích hợp

Xác định được các điều kiện thích hợp để nuôi cấy nhằm tăng sinh khối tế bào Xây dựng được đường cong sinh trưởng

Xác định các điều kiện bảo quản, lưu trữ tảo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VÀI NÉT VỀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI TẢO

Vi tảo là nhóm sinh vật có hình thái cơ thể rất đa dạng, có thể là đơn bào, tập đoàn, sợi dài, bản ống chúng phân bố rộng rãi khắp mọi loại môi trường nước, từ những vùng băng giá tới những vùng nước đọng tạm thời, từ đỉnh núi cao tới độ sâu vài nghìn mét trong đại dương [21]

Vi tảo là những cơ thể quang tự dưỡng, có chứa nhiều loại sắc tố khác nhau, mỗi nhóm tảo có một hệ sắc tố riêng Tảo lam có các loại sắc tố chlorophyll a, phycobilin và carotenoid Tảo silic có các sắc tố chlorophyll a, c1, c2, và carotenoid Tảo lục có các loại sắc tố như chlorophyll a, b và lutein Vật chất dự trữ của tảo thường là tinh bột, chúng được xếp trong các túi nhỏ nằm giữa các thylakoid Thêm vào đó các tế bào có chứa các hạt cyanophycin (arginine và asparagine) [21].

Hình thức sinh sản chủ yếu là sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính (tảo lam không có sinh sản hữu tính) Trong sinh sản vô tính chúng tạo

ra các bào tử và các động bào tử, được bao bọc bởi các túi bào tử và túi động bào tử Các động bào tử chuyển động được là nhờ các lông roi, không bào co rút Hình thức sinh sản hữu tính tạo ra các giao tử dương tính và âm tính Tùy theo hình dạng của giao tử mà có các hình thức kết hợp khác nhau như đẳng giao, dị giao, noãn giao [6]

1.2.1 Vai trò sinh thái của vi tảo

Vi tảo là những sinh vật có vai trò quan trọng bật nhất trong nước Do khả năng sinh sản nhanh, tạo ra một lượng sinh khối lớn trong một khoảng thời gian ngắn Tảo là sinh vật sản xuất đứng vị trí đầu tiên trong chuỗi thức ăn của các thủy vực Tảo cung cấp năng lượng cho các sinh vật tiêu thụ bậc trên nó dưới dạng thức

ăn Nhóm sinh vật trực tiếp sử dụng tảo thường là ấu trùng giáp xác, thân mềm, cá Theo tính toán thì 80% tổng lượng các chất hữu cơ hàng năm được tạo nên trên trái

đất có nguồn gốc từ vi tảo và các loại thực vật khác sinh sống trong các thủy vực [6]

Tảo là thành phần quan trọng trong việc đảm bảo khả năng tự làm sạch trong các thủy vực do chúng vừa là nguồn cung cấp oxygen cho các loài vi sinh vật hiếu

khí hoạt động phân giải các chất hữu cơ xâm nhập vào thủy vực, vừa là nhân tố hấp thu các loại muối khoáng trong thủy vực [6]

Bên cạnh những đóng góp tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, một số loài vi tảo khi sống trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, cùng với các điều kiện thuận lợi về khí hậu và thời tiết, chúng gây hiện tượng nở hoa nước tại các thủy vực nước ngọt hoặc hiện tượng thủy triều đỏ ngoài biển khơi gây ảnh hưởng đến các loài động vật thủy sinh Một số loài tảo lại có khả năng tiết ra độc tố, những độc tố này gây ngộ độc cho các động vật thuỷ sinh và con người khi ăn, uống hoặc tiếp xúc với nguồn nước bị nhiễm tảo độc Các loài thủy sản như ngao, sò, vẹm sống trong môi trường có tảo độc phát triển thường tích lũy độc tố và gây ảnh hưởng có hại cho con người khi sử dụng những loại hải sản này Do đó, trong khai thác thuỷ, hải sản việc quản lý các thuỷ vực để có kế hoạch khai thác phù hợp là điều hết sức quan trọng [21].

Ngoài khả năng gây độc, nguồn nước nơi tảo phát triển mạnh thường có màu và mùi tanh rất khó chịu, làm ảnh hưởng đến chất lượng nước Như vậy, sự có mặt của tảo không những góp phần tạo nên sự đa dạng trong các thủy vực mà còn quyết định đến sự tồn tại của các thủy sinh vật khác

1.2.2 Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của vi tảo

Tảo đã được con người ứng dụng từ lâu với nhiều mục đích như: thức ăn

cho người và động vật, phân bón giàu mùn và đạm, các phương thuốc chữa bệnh,

mỹ phẩm… Các sách cổ có ghi rằng, 500 năm trước công nguyên ở Trung Quốc con người đã sử dụng các loại tảo lớn làm thức ăn Từ những năm thuộc thế kỷ 14,

người Aztecs (người Mexico) đã thu sinh khối của Arthrospira từ hồ Texcoco để làm nên những cái bánh khô gọi là “Tecuitlatl” là thức ăn quí, có giá trị lớn về mặt

dinh dưỡng

Số lượng quốc gia trên thế giới sử dụng tảo không phải là ít Một số công ty

đã nuôi cấy tảo trên các vùng đất duyên hải hoặc trong các bể nuôi để phục vụ cho mục đích tiêu dùng của con người Các nước như Nhật, Ireland từ lâu đã quan tâm

đến việc tách chiết agar - agar, carrageenans có trong tảo đỏ và alginate từ tảo nâu

để xuất khẩu [21]

Ngày nay, có khoảng 42 nước trên thế giới công bố đã sản xuất được sinh

khối tảo Trung Quốc là nước đầu tiên với loài Laminaria sp., tiếp đến là Triều

Tiên, Hàn Quốc, Nhật Bản, Phi-líp-pin, Chi-lê, Indonesia, Mỹ và Ấn Độ, các quốc gia này đã đóng góp khoảng 95% lợi nhuận về sinh khối tảo trên thế giới Theo báo cáo của FAO, từ năm 1981 đến năm 2002 tổng lượng sinh khối tảo đã tăng từ 3 triệu tấn lên gần 13 triệu tấn Việc nuôi cấy vi tảo nhằm mục đích thương mại đã

được tiến hành trên các đối tượng Dunaliella, Haematococcus, Arthrospira, Chlorella, … [21]

Tảo là nguồn cung cấp nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất carotenoit, protein và vitamin Chúng cũng có thể được sử dụng để sản xuất dược phẩm, thêm vào khẩu phần ăn cho động vật và sản xuất mỹ phẩm Thương mại hóa các sản phẩm có nguồn gốc từ vi tảo đã được quan tâm ở nhiều quốc gia trên thế giới Ở Australia,

nuôi cấy Dunaliella salina để chiết xuất β - caroten, ở California người ta đã nuôi cấy Haematococcus để sản xuất astaxanthin [21]

Đến nay, có khoảng trên 40 loài vi tảo đã được phân lập, nuôi cấy và sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng các loài thủy sản Tùy thuộc vào chất lượng và tính

có sẵn của các loài vi tảo mà việc sử dụng chúng cho các đối tượng thủy sản là khác nhau ở các nước trên thế giới [15]

Bảng 1.1: Các loài vi tảo dùng làm thức ăn cho các đối tượng thủy sản [2]

Skeletonema Ấu trùng tôm biển, ấu trùng thân mềm hai

mảnh vỏ

Thalassiosira Ấu trùng tôm biển, ấu trùng thân mềm hai

mảnh vỏ

Phaeodactylum Ấu trùng tôm biển, ấu trùng thân mềm hai

mảnh vỏ, ấu trùng tôm nước ngọt

Bacillariophyceae

Chaetoceros Ấu trùng tôm biển, ấu trùng thân mềm hai

mảnh vỏ, artemia

Lớp Chi Đối tượng ứng dụng

Cylindrotheca Ấu trùng tôm biển

Bellerochea Hậu ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ

Actinocyclus Hậu ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ

Nitzchia Artemia

Cyclotella Artemia

Isochrysis Ấu trùng tôm biển, ấu trùng thân mềm hai

mảnh vỏ, hậu ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ

Pseudoisochrysis Ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ, hậu ấu trùng

thân mềm hai mảnh vỏ Haptophyceae

Dicrateria Hậu ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ

Chrysophyceae Monochrysis Ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ, hậu ấu trùng

thân mềm hai mảnh vỏ, rotifer nước mặn

Tetraselmis Ấu trùng bào ngư, hậu ấu trùng thân mềm hai

mảnh vỏ

Pyramimonas Ấu trùng thân mềm hai mãnh vỏ, hậu ấu

trùng thân mềm hai mảnh vỏ Prasinophyceae

Micromonas Hậu ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ

Chroomonas Hậu ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ

Cryptomonas Hậu ấu trùng thân mềm hai mãnh vỏ Cryptophyceae

Rhodomonas Ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ, hậu ấu trùng

thân mềm hai mảnh vỏ

Cryptophyceae Chlamydomonas Hậu ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ, rotifer

nước mặn

Xanthophyceae Olisthodiscus Hậu ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ

Carteria Hậu ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ Chlorophyceae

Dunaliella Hậu ấu trùng thân mềm hai mảnh vỏ, rotifer

nước mặn, artemia

Geitlerinema Động vật phù du nước ngọt Cyanophyceae

Spirulina Rotifer nước mặn, hậu ấu trùng thân mềm hai

mảnh vỏ

Giá trị dinh dưỡng của vi tảo phụ thuộc vào kích thước, hình dạng, khả năng tiêu hoá cũng như thành phần hoá sinh của vi tảo Mặc dù có sự khác nhau về thành phần và tỷ lệ chất dinh dưỡng trong các loài vi tảo, nhưng thường protein là nhóm chiếm hàm lượng cao nhất, tiếp đến là lipid và sau cùng là carbohydrate Cụ thể tỷ

lệ phần trăm tính theo trọng lượng khô của các nhóm chất như sau: protein 30 – 40%, lipid 10 – 20%, carbohydrate 5 – 15 % [21]

được sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản [15].

% trọng lượng khô Loài vi tảo

Protein Carbohydrate Lipid

Eustigmatophyceae Nannochloropsis oculata 35 7.8 18

11%) ở Pavlova lutheri và Cryptomonas salina, ở tảo silic hàm lượng AA chiếm 0 –

4% [21]

Hàm lượng vitamine có thể thay đổi giữa các nhóm tảo: acid ascorbic 1– 16 mg/g trọng lượng khô, β – carotene 0,5 – 1,1 mg/g, niacin 0,11 – 0,47 mg/g, α –tocopherol 0,07 – 0,29 mg/g, thiamin 29 – 109 µg/g, riboflavin 25 – 50 µg/g, acid pantothenic 14 – 38 µg/g, folate 17 – 24 µg/g, pyridoxine 3,6 – 17 µg/g, cobalamin 1,8 – 7,4 µg/g, biotin 1,1 – 1,9 µg/g, retinol < 2,2 µg/g và vitamin D < 0,45 µg/g [21]

1.2.3 Ứng dụng của vi tảo

1.2.3.1 Sử dụng vi tảo làm nguồn thực phẩm cho con người và động vật

Vào những năm gần đây việc sử dụng vi tảo làm nguồn dinh dưỡng cho con người đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, nhà sản xuất và người tiêu dùng Sinh khối tảo có giá trị dinh dưỡng cao và không có độc tố Nhưng hiện nay việc sử dụng tảo làm nguồn thực phẩm còn hạn chế vì giá thành sản xuất cao, thử nghiệm dinh dưỡng chưa đủ thuyết phục, thiếu cơ chế kiểm tra chất lượng thường xuyên và thói quen sử dụng các loại thức ăn truyền thống của người tiêu dùng Trong tương lai, vi tảo hứa hẹn là nguồn thực phẩm sử dụng phổ biến cho mọi gia đình

Chlorella, Miractinium, Scenedesmus, Oocystis, Siprulina là các loại vi tảo

thường được sử dụng để bổ sung sinh khối vi tảo vào khẩu phần ăn của các loại gia cầm Ngoài ra vi tảo cũng được sử dụng có hiệu quả trong nghề nuôi tằm và nuôi cá

cảnh Việc đưa sinh khối tảo như Chlorella (protein chiếm 40-60% TLK),

Scenedesmus (protein chiếm trên 30%), Siprulina (protein chiếm 65-70% TKL) [5]

vào khẩu phần thức ăn của gà với tỷ lệ 7,5-10% là giải pháp có lợi về kinh tế Các

nhà khoa học đã thử nghiệm việc đưa sinh khối tảo Sipirulina vào thức ăn của cá

mè trắng, trắm cỏ, rô phi, với tỉ lệ 5% làm tăng tỉ lệ sống và tốc độ tăng trưởng của

cá Những thí nghiệm gần đây cho thấy việc bổ sung tảo tươi vào khẩu phần ăn của

gà mái đẻ giúp tăng tỉ lệ đẻ và hàm lượng VTM A có trong trứng Do đó, việc sử dụng vi tảo vào ngành chăn nuôi đang được coi là một hướng đi đầy tiềm năng và

có triển vọng nhất

1.2.3.2 Khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ tảo

Nhiều VTM hòa tan trong nước (B1, B2, B6, Biotin, C) được tìm thấy trong dịch nuôi tảo lam, tảo Silic và tảo lục Những loại VTM này được phát hiện dưới

dạng các chất trao đổi trung gian như , β-, γ-tocopherol (VTM E) ở tảo lam và

α-tocopherol và VTM K ở Pophyridium cruentum Hàm lượng VTM trong sinh khối

tảo phụ thuộc vào kiểu gen, chu trình sinh trưởng, điều kiện nuôi trồng và các thao tác di truyền Hiện nay ở nhiều nước và vùng lãnh thổ như Đài Loan, Nhật Bản, các

chủng tảo Chlorella, Pophyridium đã được nuôi để sản xuất vitamin

1.2.3.3 Sử dụng vi tảo trong xử lý ô nhiễm môi trường

Theo Đặng Xuyến Như (1999), Chlorella pyrenoidosa, C vularis nuôi trong

môi trường nước thải đã xử lý sơ bộ bằng cột lọc sinh học kiểu nhỏ ở điều kiện ngoài trời thu được 1g/l sinh khối sau 7 ngày, việc kết hợp giữa cột lọc hiếu khí và

bể nuôi tảo trong xử lý nước thải sinh hoạt đã đem lại hiệu quả cao hàm lượng COD giảm 92%, N-NH4+ giảm 97%, phospho tổng số giảm 87%, coliform tổng số giảm 100% Do dó việc kết hợp cột lọc sinh học và bể tảo khắc phục được tình trạng pha loãng nước thải khi độ nhiễm quá cao, rút ngắn thời gian nuôi tảo, giảm diện tích bể nuôi tảo và có thể dùng để xử lý dòng thải liên tục Ngoài ra sự kết hợp này còn thu lại nguồn tài nguyên phục vụ cho nông nghiệp và thuỷ sản [3 ]

Theo Trần Văn Tựa (2003), Chlorella sp có khả năng hấp thu một lượng đáng kể Cr và Ni do đó có thể sử dụng tảo Chlorella sp như là chất hấp phụ sinh

học khi môi trường nước thải có hàm lượng kim loại nặng thấp [9]

1.2.3.4 Sử dụng vi tảo làm nhiên liệu sinh học

Hiện nay, tảo nổi lên như một nguyên liệu có triển vọng nhất để sản xuất nhiên liệu sinh học và đang được tập trung nghiên cứu phát triển như là một nhiên liệu sinh học thế hệ thứ ba Một số loại tảo có hàm lượng dầu đạt đến 50% và loại dầu này có thể được điều chế thành dầu diesel sinh học hoặc nhiên liệu máy bay Theo tính toán của các nhà khoa học Mỹ, dùng vi tảo lợi hơn các loại cây có dầu khác do năng suất dầu cao gấp 19-23 lần trên cùng một diện tích đất trồng Ngoài

ra, mặc dù tảo sinh ra CO2 khi bị đốt cháy, nhưng nó cũng sử dụng chính CO2 để tăng trưởng Do vậy, khi các trại nuôi trồng tảo với số lượng lớn tới mức có thể dùng sản xuất nhiên liệu sinh học, chúng sẽ hấp thụ bớt khí thải gây hiệu ứng nhà kính [42]

Một nghiên cứu gần đây của công ty nghiên cứu năng lượng nổi tiếng SBI (Mỹ) dự báo đến năm 2015, thị trường nhiên liệu sinh học tảo có thể đạt 1,6 tỉ USD, với mức tăng trưởng hàng năm 43,1% Báo cáo “Các công nghệ nhiên liệu sinh học

từ tảo: Xu hướng thị trường và sản phẩm toàn cầu 2010-2015” của SBI chỉ rõ rằng, việc sản xuất tảo cho nhiên liệu sinh học là “khả thi và hấp dẫn nhất” trong số các loại nhiên liệu sinh học do lợi nhuận cao tính theo diện tích gieo trồng và ảnh hưởng môi trường thấp nhất [42]

1.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN SINH

TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA VI TẢO

Vi tảo là sinh vật quang tự dưỡng, bằng hoạt động quang hợp chúng tự tổng hợp các chất hữu cơ từ nguồn CO2 và các chất vô cơ hòa tan trong nước để xây dựng tế bào, vì vậy trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi tảo chịu tác động của nhiều yếu tố môi trường [34]

Ba thành phần cần thiết để cấu trúc nên một hệ thống nuôi cấy vi tảo là môi trường nuôi cấy, loài tảo được nuôi cấy và lượng không khí trao đổi giữa môi trường nuôi cấy với khí quyển [21] Do đó, những thông số quan trọng điều chỉnh tốc độ sinh trưởng của vi tảo là thành phần chất dinh dưỡng, ánh sáng, pH, nhiệt độ, chế độ sục khí và độ mặn [25]

Việc tối ưu một thông số nào đó chỉ có ý nghĩa đối với một loài cụ thể và sự tác động qua lại giữa các yếu tố môi trường là điều không thể tránh khỏi [21]

1.3.1 Ánh sáng

Ánh sáng là nguồn năng lượng cho quang hợp, trong các thí nghiệm về nuôi

cấy tảo thì cường độ ánh sáng, chất lượng quang phổ và chu kỳ chiếu sáng có ảnh hưởng quyết định đến sinh trưởng phát triển của tảo [1]

Cường độ ánh sáng có vai trò quan trọng nhất Tuy nhiên, nhu cầu về cường

độ chiếu sáng lại rất khác nhau, sự khác nhau này thể hiện trên nhiều khía cạnh, có thể là sự khác nhau về các loài được nuôi cấy, về mật độ của tế bào khi nuôi, hoặc

về độ sâu của môi trường khi nuôi cấy Khi nuôi cấy với độ sâu của môi trường lớn

và mật độ tế bào cao phải tăng cường độ chiếu sáng để ánh sáng có thể xuyên qua

lớp môi trường Tuy nhiên, khi cường độ ánh sáng tăng quá mạnh có thể làm ức chế quá trình quang hợp Thông thường người ta sử dụng cường độ ánh sáng dao động

từ 100 µE sec-1 m-1 – 200 µE sec-1 m-1 tương ứng với 5% - 10% ánh sáng ban ngày Ánh sáng có thể được cung cấp tự nhiên hoặc được cung cấp từ các dàn đèn huỳnh quang, tuy nhiên cần phải chú ý đến sự tương tác giữa hai loại ánh sáng tự nhiên và nhân tạo vì có thể làm cho nhiệt độ nuôi cấy tăng lên một cách không mong muốn [25]

Hầu hết các loài vi tảo đều sống trong môi trường ánh sáng yếu có bước sóng từ xanh da trời đến xanh lục [21]

Chu kỳ chiếu sáng cũng là vấn đề đáng quan tâm khi nuôi cấy vi tảo, chu kỳ chiếu sáng thường dùng là chu kỳ ngày đêm, tuy vậy người ta có thể thay đổi thời gian chiếu sáng của các chu kỳ này để phù hợp từng trường hợp cụ thể Chu kỳ thường hay sử dụng là 12:12, 14:10 hay 16:8 [21]

1.3.2 pH môi trường

pH môi trường là yếu tố nội tại luôn thay đổi, không những do chế độ chiếu sáng, nhiệt độ, hàm lượng các chất dinh dưỡng gây nên mà còn do tác động ngược lại của chính trạng thái sinh trưởng của quần thể tảo Khi tảo phát triển càng mạnh,

pH môi trường bị thay đổi và trở thành yếu tố kìm hãm cho chính sự sinh trưởng, phát triển của chúng Do đó pH môi trường quá cao hoặc quá thấp đều làm chậm quá trình sinh trưởng của vi tảo [21]

Khoảng pH thường được sử dụng để nuôi cấy vi tảo là 7 – 9 pH tối ưu đối với nhiều loài vi tảo trong khoảng 8,2 – 8,7 [21 ] Trong các thí nghiệm về nuôi cấy, việc sục khí cũng là yếu tố để duy trì pH của môi trường [27]

1.3.3 Chế độ sục khí

Sục khí là yếu tố cần thiết để ngăn chặn sự đóng cặn của các tế bào vi tảo và

sự kết lắng của các chất dinh dưỡng Sục khí đảm bảo cho tất cả các tế bào vi tảo đều được tiếp xúc với chất dinh dưỡng và ánh sáng, ngăn chặn sự phân tầng nhiệt

độ và làm tăng khả năng trao đổi khí giữa môi trường nuôi cấy với không khí [ 21]

Sục khí giữ cho chất dinh dưỡng luôn được phân bố đều, làm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng và thu nhận ánh sáng của vi tảo, thúc đẩy quá trình sinh

trưởng Ngoài ra, một số tác giả còn sử dụng phương pháp sục khí liên tục nhằm tạo

pH ổn định trong môi trường nuôi [27]

Trong nuôi cấy vi tảo, một số loài vi tảo cần giữ ở trạng thái huyền phù để thúc đẩy quá trình sinh trưởng (tảo giáp dị dưỡng) Khi mật độ tế bào nuôi cấy tăng lên, sục khí giúp cho không khí được khuếch tán đều trong môi trường nuôi cấy làm giảm khả năng thiếu khí cục bộ tại một số điểm [25]

Phụ thuộc vào điều kiện và hệ thống nuôi cấy, việc sục khí có thể được tiến hành bằng nhiều phương pháp khác nhau Có thể tiến hành bằng cách thủ công hoặc bằng các cánh khuấy hoặc bằng cách bơm khí trực tiếp vào môi trường [21]

Tốc độ dòng khí đi vào môi trường có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của vi tảo Nếu dòng khí đi vào quá mạnh, khả năng tiếp xúc với chất dinh dưỡng và khả năng trao đổi khí của tế bào sẽ bị giảm do tốc độ di chuyển của tế bào quá lớn Ngược lại, nếu tốc độ dòng khí quá yếu sẽ không đủ lực để làm di chuyển các tế bào và chất dinh dưỡng ở trong môi trường do đó có thể xảy ra hiện tượng kết lắng tế bào tại một số điểm mà dòng khí không đủ sức đi qua [27 ]

1.3.4 Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng có vai trò quyết định đối với sinh trưởng phát triển của vi tảo, nó có ảnh hưởng rất lớn và quyết định đến hoạt động sống của sinh vật Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của vi tảo có thể trực tiếp hoặc gián tiếp và thường có tác động đồng thời với chế độ chiếu sáng và nồng độ CO2 trong môi trường [1]

Mỗi loài tảo đều có ngưỡng nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và có khả năng chịu nhiệt khác nhau Nhiệt độ có thể làm giảm mật độ tế bào hoặc giảm kích thước của tế bào dẫn đến làm giảm sinh khối của tảo [25]

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển của tảo chủ yếu thông qua hoạt tính enzyme Nếu nhiệt độ quá cao, enzyme mất hoạt tính, các phản ứng sinh hóa trong quang hợp không xảy ra, quang hợp bị đình trệ Nhiệt độ cao còn phá hủy cấu trúc bộ máy quang hợp, màng thylakoid của lục lạp là vị trí đầu tiên của sự tác động đó [1]

Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của vi tảo phụ thuộc vào nhóm tảo Đối với những tảo sống ở vùng cực là < 100C, vùng ôn đới từ 10 – 200C, vùng nhiệt đới >200C Hầu hết các loài vi tảo được nuôi cấy thường thích nghi ở khoảng nhiệt

độ 16 – 270C, tuy vậy giá trị này cũng dễ thay đổi tùy thuộc vào thành phần chất dinh dưỡng của môi trường và các chủng tảo được nuôi cấy [21]

Nhiệt độ được coi là cực thuận cho sự phát triển của một loài tảo ngoài tự nhiên không phải là cực thuận khi nuôi chúng trong phòng thí nghiệm Chẳng hạn,

Skeletonema costatum ở ngoài môi trường tự nhiên sinh trưởng tốt trong điều kiện

nhiệt độ 12 – 130C và 14 – 200C, nhưng khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, nhiệt

độ thích hợp cho sự sinh trưởng của chúng là 20 – 300C [8]

Ngoài biên độ nhiệt thì thời gian tác động của nhiệt độ cũng làm ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình quang hợp do đó làm ảnh hưởng đến sự tích luỹ sinh khối của tảo Thời gian tác động của nhiệt độ càng dài thì chiều hướng ảnh hưởng càng tăng Với nhiệt độ cao làm ức chế quang hợp nhưng thời gian tác động càng dài thì hậu quả càng nghiêm trọng [1]

Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa của vi tảo, đặc biệt là thành phần acid béo Một số loài tảo phản ứng với sự giảm nhiệt độ bằng cách tăng tỷ lệ acid béo không no trên acid béo no Ngược lại, khi sinh trưởng ở nhiệt độ cao hàm lượng acid béo không no của tảo sẽ giảm Nhiệt độ thích hợp cho sự tạo thành lipid khác nhau ở các loài tảo khác nhau [15]

1.3.5 Nguồn dinh dưỡng

Nitrogen (N) có vai trò quan trọng trong thành phần và cấu trúc của protein

mà protein là thành phần xây dựng nên bộ máy quang hợp, đặc biệt là màng quang hợp Protein cũng chính là các enzyme tham gia trong các quá trình hóa sinh Một chức năng quan trọng của N là tham gia trong cấu trúc của chlorophyll Nếu thiếu

N, chlorophyll sẽ không được tổng hợp đầy đủ N cũng là nguyên tố tham gia vào việc tạo nên các hợp chất hữu cơ khác của cơ thể từ các sản phẩm của quá trình quang hợp như các acid amin, acid nucleic, các hợp chất thứ cấp Do đó, nếu không cung cấp đầy đủ N, quá trình quang hợp sẽ bị giảm sút Nếu thiếu N kéo dài, quang hợp sẽ ngừng trệ và dẫn đến những hậu quả hết sực nghiêm trọng [1]

Nhìn chung, vi tảo có khả năng sử dụng các nguồn nitrate, ammonium hoặc các nguồn N hữu cơ khác như urea Tảo cũng có khả năng sử dụng nguồn N ở dạng nitrite nhưng nếu ở nồng độ cao sẽ ức chế sinh trưởng của tảo Việc thiếu N có thể gây tổn thương cho hệ thống sắc tố của tế bào và làm chết tế bào đồng thời còn làm giảm tốc độ hô hấp và gây hiện tượng tích lũy nhiều lipid ở một số loài tảo [21]

Phosphorus (P) trước hết là thành phần của hệ thống màng, trong đó có màng quang hợp P tham gia điều hòa pH của môi trường tế bào nhờ hệ đệm phosphate, làm cho pH tế bào ổn định, góp phần thúc đẩy các phản ứng quang hóa và hóa sinh xảy ra thuận lợi Vai trò đặc biệt của P là có mặt trong các enzyme, các hệ vận chuyển điện tử và đặc biệt là trong các hợp chất cao năng ATP, ADP, PEP, Acetyl – P P tham gia vào quá trình trao đổi năng lượng tạo nên các hợp chất cao năng

Do đó, P là yếu tố không thể thiếu trong nhu cầu dinh dưỡng của vi tảo [1]

Đối với vi tảo, P vô cơ là dạng dễ sử dụng, chúng thường được dùng để thêm vào trong các môi trường nuôi cấy vi tảo Tuy nhiên, P hữu cơ đôi lúc cũng được sử dụng Việc sử dụng các dạng P vô cơ phải chú ý đến khả năng kết tủa của chúng trong trường hợp khử trùng môi trường do đó có thể tách các thành phần có chứa P để khử trùng riêng Nhiều loài vi tảo có khả năng tiết ra môi trường phosphatase, nên có khả năng phân hủy P hữu cơ thành dạng vô cơ để sử dụng Đây cũng là một đặc điểm thích nghi trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi tảo [21]

Các nguyên tố vi lượng là thành phần bắt buột hay tác nhân kích thích hoạt động của nhiều hệ enzyme Fe có mặt trong các cytochrome, feredoxine dehydrogenase, Mo, Cu có mặt trong dehydrogenase Mn, Cu, B, Mo, Co có tác dụng thúc đẩy sinh tổng hợp chlorophyll và làm giảm sự phân hủy chlorophyll nhờ làm tăng độ bền vững của phức hệ liên kết giữa chlorophyll với protein Ngoài ra nhiều nguyên tố vi lượng còn làm tăng khả năng tổng hợp carote Các nguyên tố vi lượng thật sự cần thiết cho quá trình sinh trưởng của vi tảo Tuy nhiên, hàm lượng của chúng trong nước tự nhiên là rất thấp, có thể không cung cấp đủ cho nhu cầu sinh trưởng của vi tảo do đó việc bổ sung vi lượng vào môi trường nuôi cấy là hết sức cần thiết Trong nuôi cấy vi tảo, vi lượng thường được bổ sung với một lượng

rất nhỏ vì khi hàm lượng vượt quá ngưỡng chịu đựng của vi tảo, chúng có khả năng gây độc cho tế bào Cụ thể, khi hàm lượng Cu quá cao có thể gây độc hoặc khi dư thừa Fe chúng có khả năng gây kết tủa các thành phần khác trong môi trường làm cho tảo không thể sử dụng được [21]

Cũng như các nguyên tố vi lượng, vitamine có vai trò rất quan trọng trong các quá trình sinh trưởng của vi tảo Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh rằng, hầu hết các loài vi tảo được nuôi cấy đều có nhu cầu về vitamine B12 B12 có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển nhóm methyl và loại bỏ các nguyên tố gây độc như As, Hg, Sn, Ti, Pt, Au Theo thống kê, khoảng 20% các loài tảo có nhu cầu

về thiamine, khoảng 5% loài tảo cần biotine [21]

Việc bổ sung vitamine vào môi trường nuôi cấy cũng cần phải chú ý để tránh làm mất tính chất sinh học của vitamine đồng thời không làm nhiễm khuẩn môi trường [25]

1.4 Tổng quan về tảo Dunaliella

Lĩnh giới (Domain) Eukaryota

Giới: Phantae

Ngành: Chlorophyta

Lớp: Chlorophyceae

Bộ: Volcocales Họ: Dunaliellaceae Chi: Dunaliella

Dunaiella là một loại tảo xanh dị hợp thuộc Ngành Chlorophyta, họ

Polyblepharidaceae [11],[19] Mặc dù tế bào không có thành, các loài của chi này vẫn có thể sinh trưởng trong môi trường có độ mặn thay đổi từ 0.5M đến 5M NaCl

[36],[31],[26] Trong điều kiện bị stress, loài Dunaliella có thể tích lũy một lượng

đáng kể các hợp chất có giá trị, như carotenoid [40],[24], glycerol [24], vitamin và protein [20] Tế bào Dunaiella có thể thích ứng với phạm vi rộng của nồng độ muối

vì chúng có khả năng thay đổi nồng độ glycerol nội bào [33] Trong thực tế, sự tích lũyglycerol trong loại tảo này bị ảnh hưởng bởi nồng độ muối của môi trường [38]

1.4.1 Đặc điểm sinh học, hình thái và phân loại của Dunaliella

Đầu thế kỷ 18, các nhà khoa học cho rằng Dunaliella giống với

Haematococcus, nhưng nửa sau thế kỷ 19, họ tìm ra rằng chi này khác biệt với

Haematococcus và đặt tên mới là Dunaliella [11] Cho đến nay, 28 loài Dunaliella

đã được công nhận (Hình 1.1) Chúng bao gồm năm loài (từ mẫu 1-5 ở Hình 1.1) sống trong nước ngọt và hiếm khi xuất hiện, trong khi đó 23 loài trong số này (từ mẫu 6-28 ở Hình 1.1) có mặt trong môi trường mặn [11] Hình dạng tế bào của

Dunaliella thay đổi từ hình elip, hình trứng, hình trụ và hình quả lê đến gần hình

cầu [13] Các tế bào của một loài nhất định có thể thay đổi hình dạng với điều kiện thay đổi, thường trở thành hình cầu trong điều kiện không thuận lợi [12] Kích thước tế bào cũng có thể thay đổi với điều kiện sinh trưởng và cường độ ánh sáng

[17] Tổ chức tế bào nói chung được nghiên cứu tương đối chi tiết trong D salina

trên kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử

Tế bào không có thành, nhưng có lớp áo là màng nhầy nguyên sinh chất bao quanh Tế bào có 2 roi đều nhau, và thường chuyển động đồng thời Có một thể lục lạp đơn chiếm gần hết khoang tế bào Thể này có thể có hình chén, đĩa, chuông và

có một phần dày hơn có chứa một pyrenoit (dạng nhân, hạt tinh bột, thể vùi) Thể lục lạp chia thành nhiều thùy, các chồng thylacoit của thể lạp thỉnh thoảng tập trung thành từng cụm gồm trên 10 đơn vị Các cụm thylacoit được cho là có liên quan đến

sự sinh trưởng của tế bào trong điều kiện ánh sáng mạnh và nồng độ muối cao Hạt tinh bột thường bao quanh pyrenoit, nhưng cũng có thể được tìm thấy tại các nơi

khác của lục lạp Ở một số loài (D salina, D parva) thể lạp cũng có thể tích lũy

một số lượng lớn β-caroten trong các giọt dầu ở khoảng trong màng thylacoit, vì

vậy tế bào thường có màu cam đỏ hơn là màu xanh Hạt β-caroten của D salina chỉ

có các giọt mỡ trung tính, hơn một nửa trong số đó là β-caroten Phần lớn các dạng màu đỏ sẽ mất màu trong điều kiện ánh sáng yếu [35]

Điểm mắt (eyespot) thường phân bố ở phần trước trong thể lục lạp Ở một số

loài, đặc biệt là D salina, điểm mắt hầu như rất khó quan sát dưới kính hiển vi

quang học Thể nhân (nucleus) thường bị che khuất bởi một số lượng lớn các hạt

Nó chiếm hầu hết phần trước của tế bào và được bao quanh bởi các thùy trước của thể lạp Nghiên cứu siêu cấu trúc cho thấy nó có một vỏ có lỗ (porous envelope) và một hạch nhân đơn, lồi được bao quanh bởi các cấu trúc chromatin Có thể quan sát thấy cấu trúc ti thể ở nhiều phần khác nhau của tế bào Số lượng và kích thước ty thể thay đổi rất lớn giữa các tế bào ở những giai đoạn sinh trưởng khác nhau Tế bào

có từ 2-4 thể Golgi Mạng lưới nội chất (ER) thường nằm phía dưới màng sinh chất Trong suốt thời kỳ bị stress do muối cao, ER tăng về số lượng, ER đóng vai trò như một bể nhân tạo chứa vật chất màng khi các thành phần chính của tế bào co lại Không bào rất đa dạng, có chứa một số thành phần tế bào và các túi, bọng, các hạt hay vật chất khác của tế bào chất Các giọt lipid lớn hoặc là không bào chứa các giọt lipid nhỏ hơn có thể tìm thấy ở nhiều nơi trong tế bào Các thể cyst sinh sản vô tính có thể được tạo thành khi điều kiện sống trở nên khắc nghiệt, ví dụ môi trường

bị khô hạn quá mức, hoặc bị pha loãng quá mức Sinh sản hữu tính bằng đẳng giao (isogamy), với phương thức tiếp hợp giao tử giống như cách thức của nguyên sinh

động vật (Chlamydomonas) Trong cùng một loài, các giao tử có cùng kích thước và đặc điểm cấu trúc giống như tế bào sinh dưỡng Một số loài Dunaliella đồng tản, trong khi đó D salina dị tản Hợp tử thường có màu xanh hay màu đỏ và được bao

bọc bởi một thành nhẵn và dày Sau giai đoạn nghỉ, nhân của nó bắt đầu phân chia tạo thành nhiều hơn 32 tế bào, chúng sẽ được giải phóng khi thành của tế bào mẹ bị

vỡ Giảm phân xảy ra trong suốt quá trình nảy mầm của hợp tử

Hình dạng tế bào có thể bị ảnh hưởng bởi mức độ thay đổi của điều kiện sinh trưởng Những thay đổi rõ rệt có thể xảy ra giữa pha logarit và pha cân bằng Nồng

độ muối, cường độ ánh sáng và nhiệt độ sẽ có ảnh hưởng lên cấu trúc của thylacoit,

pyrenoit và ER Trước đây, Dunaliella và một số loài có roi không có thành tế bào

được phân loại vào họ Polyblepharidaceae trong bộ Volvocales Tuy nhiên sau này những nghiên cứu chi tiết hơn trên nhiều loài có roi màu xanh đã dẫn đến việc phân

loại lại các chi này vào taxon khác Dunaliella được phân thành một chi riêng của

họ Chlorophyceae (Chi Dunaliellales) Mặc dù thiếu thành cứng, Dunaliella cũng

mang nhiều đặc điểm chung với họ Chlamydomonadales [11]

Hình 1.1: Hình thái các loài tảo thuộc chi Dunaliella

1 D acidophila; 2 D flagellata; 3 D lateralis; 4 D obliqua; 5 D paupera, 6 D maritima, 7 D polymorpha, 8 D primolecta, 9 D quartolecta, 10

D tertiolecta, 11 D parva, 12 D.pseudosalina, 13 D salina, 14 D beckingii, 15 D bioculata, 16 D carpatica, 17 D gracili, 18 D granulata, 19 D media, 20 D minuta, 21 D minutissima, 22 D ruineniana, 23 D.terricola, 24 D viridis, 25 D asymmetrica, 26 D jacobae, 27 D peircei, 28 D turcomanica

baas-Scalebar: 10 µm [11]

Hình 1.2: Sự sinh trưởng của Dunaliella salina trong môi trường có nồng độ

NaCl khác nhau Loài tảo này có thể phát triển trong môi trường có

phổ muối rộng, từ 0.17 M đến 4M NaCl [24]

1.4.2 Điều hòa áp suất thẩm thấu và sản xuất glycerol

Hình 1.3: Hàm lượng glycerol nội bào có chức năng cân bằng với NaCl ngoại

bào trong Dunaliella salina Glycerol nội bào và hàm lượng chất diệp

lục trong các tế bào đã được xác định tăng trong môi trường có nồng

độ muối chỉ định [24]

Chi Dunaliella bao gồm nhiều loài có khả năng sinh trưởng trong phổ muối

rộng, từ 0.05 - 5.5M [11] nhưng sinh trưởng tối ưu khác nhau ở các loài Theo Hadi

et al (2008) sinh trưởng tối ưu của D salina (chủng Iran) là 2M NaCl Dunaliella là

loài tảo chính của các hồ nước mặn Nó có thể có mặt trong tất cả các môi trường

mặn tự nhiên Khác với các loài tảo xanh khác, tế bào của chi Dunaliella không có

thành tế bào cứng, nhưng có màng tế bào mỏng linh động có thể thích nghi nhanh với sự thay đổi của áp suất thẩm thấu bằng cách thay đổi thể tích tế bào [38] Vì

vậy, Dunaliella có thể tăng hoặc giảm 3 - 4 lần kích thước tế bào bằng cách co lại

(shink) hoặc nở ra (swell) Tuy nhiên, những sự thay đổi lớn hơn sẽ dẫn tới vỡ tế bào (cell - bursting) trong quá trình hạ áp suất thẩm thấu, và ngược lại là co bất thuận nghịch dưới điều kiện tăng áp suất thẩm thấu

Yếu tố cân bằng nội môi dưới điều kiện thay đổi của áp suất thẩm thấu là glycerol, bởi vì nồng độ nội môi của nó ở mức rất cao để đáp ứng với sự thay đổi

này [24] Khi tế bào Dunaliella sinh trưởng ở nồng độ muối cao, nồng độ glycerol

có thể lên tới trên 50% đủ để đáp ứng với sự thay đổi của áp suất thẩm thấu Glycerol được sản xuất trong điều kiện sốc muối (bằng cách chuyển từ môi trường

chứa 1M NaCl sang 3M NaCl) Tuy nhiên, glycerol tích lũy trong Dunaliella để đáp

ứng với stress môi trường có thể khác nhau ở các loài Một vai trò khác của glycerol

là “chất hòa tan thay thế” bảo vệ hoạt động của các enzyme

Hình 1.4: Các phản ứng trong quá trình tổng hợp glycerol của Dunaliella

salina trong 1M NaCl và bị gây stress bằng cách chuyển đến 3M

NaCl Thời gian được tính từ thời điểm chuyển sang nồng độ muối

cao hơn [24]

Glycerol trong Dunaliella parva có thể tích lũy tối đa khoảng 55% khối

lượng tế bào dưới điều kiện NaCl bão hòa [10] Khi tế bào bị sốc muối trong một vài giây, nước đi vào hoặc đi ra làm thay đổi đáng kể thể tích tế bào Sau đó, phụ thuộc vào chiều hướng và mức độ của shock muối và các điều kiện chuyển hóa của

tế bào, glycerol được tổng hợp hoặc loại trừ thông qua các con đường enzyme phụ thuộc nhiệt độ, đi kèm với việc trở lại hoặc đi ra của nước, vì vậy tế bào trở lại kích

thước gần giống ban đầu Glycerol được tạo thành trong Dunaliella theo 2 con

đường: cố định CO2 bằng quang hợp hoặc thoái biến tinh bột

Hình 1.5: Con đường sinh tổng hợp glycerol trong Dunaliellai [11]

Tuy nhiên, việc tổng hợp glycerol bằng con đường nào còn phụ thuộc vào cường độ ánh sáng, tích lũy của các hạt tinh bột, hay kích thước của các hạt muối

gây stress Trong pha tối, Dunaliella sản xuất glycerol chủ yếu bằng thoái biến tinh

bột, do đó khả năng phục hồi của tế bào phụ thuộc vào sự có mặt của các bể chứa hạt tinh bột Tuy nhiên, sự thoái biến tinh bột cũng góp phần vào việc tăng tổng hợp glycerol đáp ứng với các sốc bằng tăng cường độ ánh sáng Phức hợp tác động lẫn nhau giữa tổng hợp glycerol và thoái biến tinh bột có thể có nguyên nhân từ nhu cầu đường glucose cao cho quá trình tổng hợp glycerol, và từ việc ức chế sự quang hợp bằng quá trình tăng áp suất thẩm thấu Sốc bằng giảm áp suất thẩm thấu cảm ứng

Dunaliella giảm thành phần glycerol và tăng thành phần tinh bột Sự tổng hợp tinh

bột có thể cũng bị ức chế mạnh bởi sốc giảm áp suất thẩm thấu

1.4.3 β-caroten

β-caroten là các hợp chất béo vòng thơm, có 5 nhóm isoprene, và thuộc vào nhóm hợp chất carotenoid Hợp chất này chỉ chứa hydro (H) và và oxy (O) β-caroten là sắc tố có nhiều trong thực vật và tảo β-caroten phổ biến trong tự nhiên,

có nhiều vai trò khác nhau bao gồm: hoạt tính tiền vitamin A, hấp thụ năng lượng ánh sáng, dập tắt các gốc tự do, hoạt tính chống oxi hóa, vận chuyển oxy, tạo nên màu sắc khác nhau của sinh vật Công thức phân tử của β-caroten là C40H56, khối lượng phân tử 536,9, mười một liên kết đôi liên hợp, tinh thể mầu tím - đỏ điển hình

và tạo thành dung dịch với dầu Hấp thụ cực đại của β-caroten trong ete dầu là 453nm và 481nm Thành phần β-caroten trong thực vật thay đổi từ 0.01-10mg/100g Thực vật giầu β-caroten nhất là các cây lá xanh như rau mùi tây, rau bina và bông cải xanh, các loại trái cây màu vàng cam như xoài, đào và một số loại rau khác như cà rốt, cà chua, bí ngô Một vài vi sinh vật tích lũy β-carotene cao như

các loại nấm mốc Phycomyces blakesleanus và nấm men Rhodotortila có thể tích lũy β-carotene từ 5 - 0,5 mg/g trọng lượng khô Dunaliella đã được chứng minh là

loài tảo có khả năng tích lũy carotene với lượng lớn trong các giọt dầu ở khoảng gian bào giữa các thylacoit trong lục lạp Các chủng giàu β-caroten thường phân bố

ở những nơi có chứa >10% muối, và chiếm ưu thế ở nơi có nồng độ muối bão hòa [37] Màu đỏ cam của các hồ nước mặn dưới điều kiện chiếu sáng mạnh thường là

màu beta carotene của Dunaliella Trong điều kiện sinh trưởng bình thường (1-2M

NaCl) D.salina thường có màu xanh, và chỉ chứa 0.3% β-caroten, tương tự như các

loài thực vật và tảo khác Tuy nhiên, nếu bị sốc mạnh hàm lượng β-caroten được tích lũy có thể lên tới trên 10% khối lượng khô, là mức hàm lượng cao nhất so với bất kỳ loài tảo và thực vật nào đã được biết Mức độ tổng hợp β-carotene còn phụ thuộc vào các thông số sinh trưởng sinh lý, cụ thể là cường độ ánh sáng, nồng độ muối, nhiệt độ và thiếu dinh dưỡng [28], [29] Các stress môi trường càng mạnh càng làm chậm tốc độ tăng trưởng của tảo, và làm tăng hàm lượng beta carotene tích lũy Tuy nhiên, nếu các stress này xảy ra cùng một lúc, sẽ làm giảm số lượng tế bào/đơn vị thể tích, ảnh hưởng đến sự tồn tại của tế bào Vì vậy, theo một nhóm tác giả, việc điều chỉnh cường độ ánh sáng và độ mặn có thể là chiến lược tốt nhất để

đạt được mức tích lũy beta carotene tối ưu [30] Chủng D.salina của Iran có màu

xanh khi sinh trưởng trong môi trường NaCl 1-2M, trong khi đó nó có mầu cam khi sinh trưởng trong môi trường NaCl 4M Sự tích lũy carotene là nguyên nhân chính gây nên sự đổi màu từ mầu xanh sang màu cam của D.salina tại NaCl 4M

Hình 1.6: Bốn loàiD Parva, D salina, D viridis and D pseudosalina sinh

trưởng trong NaCl 4.0 M (A), Bể muối ở Gave-Khooni Salt Marsh,

Iran có mặt D salina màu đỏ cam (B), hình dạng của D salina sinh trưởng trong NaCl 4 M (C) và hình dạng của D salina sinh trưởng

trong NaCl 2M(D)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng tảo sử dụng trong nghiên cứu được thu thập từ các ruộng muối ở 2

huyện Ninh Diêm và Ninh Thủy thuộc tỉnh Khánh Hòa

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu 8/2012 đến tháng 6/2013

- Địa điểm: Trường Đại học Nha Trang

2.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Môi trường Walne Thành phần

Môi trường Jonhson

Máy đo UV_Vis

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân lập tảo Dunaliella sp

Việc phân lập tảo được làm qua các bước sau:

Lấy mẫu ở các ruộng muối Kiểm tra các điều kiện( nhiệt độ, pH, độ mặn)

Lọc mẫu

Soi mẫu để kiểm tra sự có mặt của Dunaliella

Nuôi tăng sinh bằng môi trường J/l 8,8%

Soi mẫu để quan sát mức độ phát triển trong các quần thể Dunaliella

Pha loãng mẫu theo các nồng độ khác nhau hoặc cấy trên môi trường thạch

Phân lập được chủng tảo Dunaliella sp thuần

Thuyết minh quy trình

Thu mẫu là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu bất kì vi sinh vật nào Mẫu được thu từ các ruộng muối của các xã Ninh Hải, Ninh Thủy của huyện Ninh Hòa tỉnh Khánh Hòa được đựng trong các chai nhựa Tại địa điểm thu mẫu tiến

hành kiểm tra các điều kiện như pH, độ mặn, ánh sáng Ta có thể sử dụng một số dụng cụ sau để kiểm tra các thông số trên như:

Sử dụng nhiệt kế thủy ngân chia vạch (0 – 100oC) để xác định nhiệt độ

Sử dụng giấy quỳ tím để đo pH: Sự thay đổi màu của giấy quỳ cho ta biết

pH khi so sánh với thang màu chuẩn pH

Sử dụng khúc xạ kế để đo độ mặn của nguồn nước: Nhỏ 1-2 giọt nước trong mẫu nước cần xác định độ mặn lên mặt kính, rồi đưa kính ra nơi sáng quan sát, đọc kết quả được hiển thị trên vạch chia độ

Sử dụng lux kế xác định cường độ ánh sáng: Đưa bộ phận cảm ứng ánh sáng của lux kế vào nơi cần đo cường độ ánh sáng Thông số cường độ ánh sáng sẽ hiển thị trên màn hình

Quan sát sự có mặt của Dunaliella bằng tiêu bản giọt ép Các mẫu xuất hiện Dunaliella cho vào môi trường J/l và bắt đầu sục khí ngay để các tế bào tảo Dunaliela phát triển Sau một thời gian, khi thấy dung dịch dần có màu xanh đặc trưng của tảo Dunaliella

Cách 1: Tiến hành phân lập bằng phương pháp pha loãng mẫu trong môi trường J/l Mẫu tảo được pha loãng ở các nồng độ khác nhau, đến khi trong mỗi ống chỉ còn 1 tế bào Thường là pha loãng theo dãy nồng độ giảm giần 10 lần

Cách 2: Tiến hành phân lập bằng phương pháp cấy trên môi trường thạch Nhỏ 1ml mẫu tảo lên bề mặt môi trường thạch và dùng que cấy trang gạt dàn đều cho đến khi dung dịch tảo khô đi trên mặt thạch

Dựa vào hình thái màu sắc để chọn mẫu tảo mong muốn Quá trình phân lập được lặp lại nhiều lần cho đến khi xác định được loài thuần khiết dựa vào quan sát trên kính hiển vi và một số tính chất khác Sau đó được cấy chuyền vào các bình thủy tinh kích thước lớn để thu được một dòng tảo thuần

2.4.2 Nuôi cấy và bảo quản giống tảo Dunaliella

2.4.2.1 Quy trình nuôi cấy dự kiến

Để xây dựng quy trình nuôi sinh khối Dunaliella sp cần dựa vào kết quả thu

được từ những nghiên cứu về ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường (nhiệt độ,

cường độ chiếu sáng, độ mặn và ánh sáng) lên sinh trưởng và phát triển của tảo

Dunaliella Từ đó xây dựng quy trình nuôi phù hợp cho Dunaliella sp trong điều

kiện phòng thí nghiệm

Tảo giống Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp Xác định mật độ ban đầu thích hợp

Nhân giống Xác định các điều kiện (nhiệt độ, cường độ ánh sáng, độ mặn)

Xác định mật độ tảo sau vài ngày nuôi cấy

Giống được nuôi trong điều kiện khác nhau để tìm ra các yếu tố thích hợp cho tảo phát triển Sau 2, 3 ngày thì lấy mẫu tảo và tiến hành đếm để xác định mật

độ tảo cực đại đạt được Từ đó lựa chọn được các thông số về môi trường, mật độ

ban đầu, nhiệt độ, cường độ chiếu sáng, độ mặn thích hợp để cho tảo Dunaliella sp

phát triển tốt nhất

Giữ giống là biện pháp bảo quản kỹ thuật nhằm giữ giống gốc để chủ động trong quá trình nghiên cứu và sản xuất Việc chọn tảo giống để giữ và nuôi sinh

khối rất quan trọng phải đảm bảo giống sạch không tạp nhiễm vì thế tất cả các thao tác kỹ thuật trong cấy và giữ giống tảo đều phải đảm bảo vô trùng

Có 2 cách để lưu giữ giống tảo:

- Lưu giữ trên môi trường thạch

- Lưu giữ trên môi trường lỏng

2.4.2.2 Lưu giữ trên môi trường thạch

a) Chuẩn bị

- Tất cả các dụng cụ phải được hấp sấy khử trùng trước khi sử dụng

- Sử dụng 20g agar/1 lít môi trường nuôi cấy

- Môi trường J/l đã được khử trùng

b) Pha môi trường agar

Pha môi trường agar 2% (pha 2gam agar trong 100ml nước), đun hòa tan hết agar trong lò vi song rồi đổ ra đĩa peptri (đã khử trùng) với thể tích agar bằng 1/3 thể tích đĩa Petri Hoặc đổ thạch nghiêng Sau đó để nguội agar trong box cấy vô trùng Để cho thạch đông lại

c)Trên môi trường thạch

Tảo giống được cấy trên môi trường J/lcó bổ sung agar Dùng que cấy hơ trên ngọn lửa đèn cồn, đợi cho que cấy nguội, lấy một ít tảo giống cấy ziczac trên bề mặt thạch nghiêng trong ống nghiệm và đĩa petri, tảo nuôi giữ trong điều kiện ánh sáng 7500 lux với chu kì chiếu sáng là 24h/24h, nhiệt độ 28oC Sau một thời gian, tảo mọc trên mặt thạch Kiểm tra các khuẩn lạc thuần khiết, chọn ống nghiệm hoặc đĩa thạch nào có khuẩn tảo lên đẹp để lưu giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-5oC, hạn chế ánh sáng

2.4.2.3 Lưu giữ giống trên môi trường lỏng

a)Môi trường nuôi

Môi trường dinh dưỡng J/l

b)Phương pháp lưu giữ giống

Dịch tảo thuần được thu nuôi ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng của tảo đạt tốt nhất được lấy từ nguồn giống lưu giữ, mật độ ban đầu 2x105 tb/ml tảo được nuôi giữ trong điều kiện ánh sáng yếu, nhiệt độ 22oC

2.4.3 Xác định mật độ tảo bằng phương pháp đếm tế bào bằngbuồng đếm

hồng cầu

a)Mục đích

Sử dụng buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ tảo qua các giai đoạn

b)Phương pháp tiến hành

Chu kỳ lấy mẫu: 24h/lần

Chuẩn bị các ống eppendorf Hút ra 300µl và cho 2 đến 3 giọt lugol Khuấy đều để trong ít phút để cố định

Xác định mật độ tế bào: Xác định mật độ tế bào bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer (Đức), dung vật kính 40X để quan sát

Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5-10 tế bào Đậy lamelle lên 2 khu vực có kẻ ô đếm Đưa buồng đếm lên kính hiển

vi, lắc mẫu cho đều dùng pipet nhỏ mẫu cần xác định vào khe buồng đếm chỗ lá kính đậy lên, dung dịch theo mao dẫn lan khắp ô đếm Để yên buồng đếm trong khoảng 5 phút để tế bào tảo lắng xuống Đếm tế bào tảo ở 5 ô trung bình của khu vựcđếm hồng cầu (4 ô ở 4 góc và 1 ô giữa) Trong mỗi ô trung bình đếm cả 16 ô nhỏ Trong mỗi ô nhỏ, đếm tất cả những tế bào nằm gọn trong ô và những tế bào nằm ở cạnh trên và cạnh trái

+ Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu: Buồng đếm hồng cầu là một miếng kính dày hình chữ nhật, mặt trên có 2 khu vực có kẻ ô đếm dưới kính hiển vi, buồng đếm được chia thành 9 ô vuông lớn, mỗi ô có diện tích 1mm2 Ô chính giữa được sử dụng để đếm được chia thành 225 ô trung bình, mỗi ô trung bình được chia thành

16 ô nhỏ Cụ thể:

- Mỗi buồng đếm có các Block: A, B, C, D và E Mỗi Block: A, B, C, D được chia làm 1 ô vuông nhỏ , mỗi ô vuông có diện tích 1 mm2, sâu 0,1mm nên thể tích của mỗi ô sẽ là 0,1 mm3

Nếu đếm tảo trong 4 ô này là X thì mật độ tảo là: d(tb/ml) = X x 104 (tb/ml)

- Riêng Block E được chia làm 25 ô vuông nhỏ, mỗi ô có thể tích là 1/25 x 0.1 mm3 (0.004mm3 = 0.000004ml = 4 x 10-6 ml), mỗi ô vuông nhỏ lại được chia làm 16 ô vuông nhỏ hơn