2.4.2.1. Quy trình nuôi cấy dự kiến
Để xây dựng quy trình nuôi sinh khối Dunaliella sp. cần dựa vào kết quả thu được từ những nghiên cứu về ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường (nhiệt độ,
cường độ chiếu sáng, độ mặn và ánh sáng) lên sinh trưởng và phát triển của tảo
Dunaliella. Từ đó xây dựng quy trình nuôi phù hợp cho Dunaliella sp trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Tảo giống
Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp Xác định mật độ ban đầu thích hợp
Nhân giống
Xác định các điều kiện (nhiệt độ, cường độ ánh sáng, độ mặn) Xác định mật độ tảo sau vài ngày nuôi cấy
Lựa chọn các thông số thích hợp
Hình 2.1: Quy trình nuôi cấy dự kiến Thuyết minh quy trình nuôi:
Tảo giống được chuyển từ môi trường thạch sang môi trường lỏng trong các bình tam giác 100ml, được cấy chuyển sang bình tam giác 250 đến các bình serum 500ml, cuối cùng cấy chuyển sang bình cầu 1lít. Giống tảo phải phát triển đồng nhất, không nhiễm tạp và không tàn lụi. Sau đó tiến hành nhân giống theo điều kiện chung: Môi trường dinh dưỡng J/l, thể tích tảo bằng ½ thể tích dung dịch, độ mặn 8,8%, nhiệt độ 25oC, thời gian chiếu sáng 24/24h và được sục khí liên tục. Sử dụng nguồn giống này để thực hiện các thí nghiệm.
Giống được nuôi trong điều kiện khác nhau để tìm ra các yếu tố thích hợp cho tảo phát triển. Sau 2, 3 ngày thì lấy mẫu tảo và tiến hành đếm để xác định mật độ tảo cực đại đạt được. Từ đó lựa chọn được các thông số về môi trường, mật độ ban đầu, nhiệt độ, cường độ chiếu sáng, độ mặn thích hợp để cho tảo Dunaliella sp. phát triển tốt nhất.
Giữ giống là biện pháp bảo quản kỹ thuật nhằm giữ giống gốc để chủ động trong quá trình nghiên cứu và sản xuất. Việc chọn tảo giống để giữ và nuôi sinh
khối rất quan trọng phải đảm bảo giống sạch không tạp nhiễm vì thế tất cả các thao tác kỹ thuật trong cấy và giữ giống tảo đều phải đảm bảo vô trùng
Có 2 cách để lưu giữ giống tảo: - Lưu giữ trên môi trường thạch. - Lưu giữ trên môi trường lỏng.
2.4.2.2. Lưu giữ trên môi trường thạch
a) Chuẩn bị
- Tất cả các dụng cụ phải được hấp sấy khử trùng trước khi sử dụng. - Sử dụng 20g agar/1 lít môi trường nuôi cấy.
- Môi trường J/l đã được khử trùng.
b) Pha môi trường agar
Pha môi trường agar 2% (pha 2gam agar trong 100ml nước), đun hòa tan hết agar trong lò vi song rồi đổ ra đĩa peptri (đã khử trùng) với thể tích agar bằng 1/3 thể tích đĩa Petri. Hoặc đổ thạch nghiêng. Sau đó để nguội agar trong box cấy vô trùng. Để cho thạch đông lại.
c)Trên môi trường thạch
Tảo giống được cấy trên môi trường J/lcó bổ sung agar. Dùng que cấy hơ trên ngọn lửa đèn cồn, đợi cho que cấy nguội, lấy một ít tảo giống cấy ziczac trên bề mặt thạch nghiêng trong ống nghiệm và đĩa petri, tảo nuôi giữ trong điều kiện ánh sáng 7500 lux với chu kì chiếu sáng là 24h/24h, nhiệt độ 28oC. Sau một thời gian, tảo mọc trên mặt thạch. Kiểm tra các khuẩn lạc thuần khiết, chọn ống nghiệm hoặc đĩa thạch nào có khuẩn tảo lên đẹp để lưu giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-5oC, hạn chế ánh sáng.
2.4.2.3. Lưu giữ giống trên môi trường lỏng
a)Môi trường nuôi
Môi trường dinh dưỡng J/l
b)Phương pháp lưu giữ giống
Dịch tảo thuần được thu nuôi ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng của tảo đạt tốt nhất được lấy từ nguồn giống lưu giữ, mật độ ban đầu 2x105 tb/ml. tảo được nuôi giữ trong điều kiện ánh sáng yếu, nhiệt độ 22oC.
2.4.3. Xác định mật độ tảo bằng phương pháp đếm tế bào bằngbuồng đếm hồng cầu hồng cầu
a)Mục đích
Sử dụng buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ tảo qua các giai đoạn.
b)Phương pháp tiến hành
Chu kỳ lấy mẫu: 24h/lần.
Chuẩn bị các ống eppendorf. Hút ra 300µl và cho 2 đến 3 giọt lugol. Khuấy đều để trong ít phút để cố định.
Xác định mật độ tế bào: Xác định mật độ tế bào bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer (Đức), dung vật kính 40X để quan sát.
Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5-10 tế bào. Đậy lamelle lên 2 khu vực có kẻ ô đếm. Đưa buồng đếm lên kính hiển vi, lắc mẫu cho đều dùng pipet nhỏ mẫu cần xác định vào khe buồng đếm chỗ lá kính đậy lên, dung dịch theo mao dẫn lan khắp ô đếm. Để yên buồng đếm trong khoảng 5 phút để tế bào tảo lắng xuống. Đếm tế bào tảo ở 5 ô trung bình của khu vựcđếm hồng cầu (4 ô ở 4 góc và 1 ô giữa). Trong mỗi ô trung bình đếm cả 16 ô nhỏ. Trong mỗi ô nhỏ, đếm tất cả những tế bào nằm gọn trong ô và những tế bào nằm ở cạnh trên và cạnh trái.
+ Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu: Buồng đếm hồng cầu là một miếng kính dày hình chữ nhật, mặt trên có 2 khu vực có kẻ ô đếm dưới kính hiển vi, buồng đếm được chia thành 9 ô vuông lớn, mỗi ô có diện tích 1mm2. Ô chính giữa được sử dụng để đếm được chia thành 225 ô trung bình, mỗi ô trung bình được chia thành 16 ô nhỏ. Cụ thể:
- Mỗi buồng đếm có các Block: A, B, C, D và E. Mỗi Block: A, B, C, D được chia làm 1 ô vuông nhỏ , mỗi ô vuông có diện tích 1 mm2, sâu 0,1mm nên thể tích của mỗi ô sẽ là 0,1 mm3
Nếu đếm tảo trong 4 ô này là X thì mật độ tảo là: d(tb/ml) = X x 104 (tb/ml) - Riêng Block E được chia làm 25 ô vuông nhỏ, mỗi ô có thể tích là 1/25 x 0.1 mm3 (0.004mm3 = 0.000004ml = 4 x 10-6 ml), mỗi ô vuông nhỏ lại được chia làm 16 ô vuông nhỏ hơn.
Nếu đếm tảo trong mỗi ô nhỏ (trong 25 ô vuông) là X thì mật độ tảo là: d(tb/ml) = X/V = X /4 x 106 (tb/ml)
Trong đó :
d: mật độ tế bào (tb/ml)
X : số tế bào trung bình của 1 ô (bằng tống số tế bào đếm được/số ô đếm)
V: thể tích của ô đếm.
2.4.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng của tảo Dunaliella trưởng của tảo Dunaliella
a) Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp
Để xác định môi trường nuôi cấy thích hợp chúng tôi sử dụng 3 loại môi trường thường được dùng để nuôi tảo Dunaliella là môi trường J/l. F/2, Walne.
Điều kiện thí nghiệm:
+ Mật độ tế bào vi tảo: 5x103 tb/ml [16], [18] + Nhiệt độ: 28oC
+ Cường độ chiếu sáng: 7500 lux [32] + Độ mặn: 8.8%
+ Sục khí liên tục
+ Thời gian chiếu sáng: 24h/24h + Thể tích nuôi: 500ml
Hình 2.2: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng và phát triển của tảo Dunaliella sp.
b) Xác định mật độ ban đầu thích hợp
Điều kiện thí nghiệm:
+ Mật độ 105 tb/ml, 2x105 tb/ml, 4x105 tb/ml, 8x105 tb/ml + Cường độ chiếu sáng: 7500lux
+ Môi trường từ nghiệm thức lựa chọn môi trường + Thời gian chiếu sáng: 24h/24h
+ Sục khí liên tục
+ Sử dụng môi trường J/l + Thể tích nuôi: 500ml
Tảo giống
Nhân giống
Môi trường Wanle Môi trường F/2 Môi trường J/l
Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3
Xác định mật độ tảo trong 20 ngày Lựa chọn được môi trường thích hợp
Hình 2.3: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của mật độ ban đầu đến sinh trưởng và phát triển của tảo Dunaliella sp.
c) Ảnh hưởng của nhiệt độ
Điều kiện thí nghiệm:
+ Nhiệt độ: 22oC, 28oC, nhiệt độ phòng. + Cường độ chiếu sáng: 7500lux
+ Môi trường: Từ nghiệm thức lựa chọn môi trường thích hợp
+ Mật độ ban đầu: Từ nghiệm thức lựa chọn mật độ ban đầu thích hợp + Thời gian chiếu sáng: 24/24h
+ Sục khí liên tục + Thể tích nuôi: 500ml Lần lặp 2 Lần lặp 1 Lần lặp 3 Xác định mật độ tảo Lựa chọn được mật độ thích hợp Tảo giống Nhân giống 105 tb 2x105 tb 4x105 tb 8x105 tb
Hình 2.4: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của tảo Dunaliella sp.
d) Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng
Điều kiện thí nghiệm:
+ Ánh sáng: 10Klux 14Klux
+ Môi trường: Từ nghiệm thức lựa chọn môi trường thích hợp
+ Mật độ ban đầu: Từ nghiệm thức lựa chọn mật độ ban đầu thích hợp + Nhiệt độ: Từ nghiệm thức lựa chọn nhiệt độ thích hợp.
+ Sục khí liên tục + Thể tích nuôi: 500ml
Tảo giống
Nhân giống
Nhiệt độ 22oC Nhiệt độ 28oC Nhiệt độ phòng
Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3
Xác định mật độ tảo liên tục trong 10 ngày
Hình 2.5: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và phát triển của tảo Dunaliella sp.
e) Ảnh hưởng của độ mặn
Điều kiện thí nghiệm:
+ Độ mặn: 0.5M, 1M, 1.5M, 2M, 3M, 4M, 5M, 5.13M, 5.4M. + Môi trường: Từ nghiệm thức lựa chọn môi trường thích hợp.
+ Mật độ ban đầu: Từ nghiệm thức lựa chọn mật độ ban đầu thích hợp. + Nhiệt độ: Từ nghiệm thức lựa chọn nhiệt độ thích hợp.
+ Ánh sáng: Từ nghiệm thức lựa chọn anh sáng thích hợp. + Sục khí liên tục
+ Thể tích nuôi: 500ml
Xác định mật độ tảo liên tục trong 10 ngày
Lựa chọn được ánh sáng thích hợp Lần lặp 2 Lần lặp 1 Lần lặp 3 Tảo giống Nhân giống 14 Klux 13.5 Klux 10 Klux 10.5 Klux 11 Klux 11.5 Klux 12 Klux 12.5 Klux 13 Klux
Hình 2.6: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng và phát triển của tảo Dunaliella sp.
f) Xây dựng đường cong sinh trưởng
Điều kiện thí nghiệm:
+ Mật độ ban đầu: 5x103 tb/ml.
+ Độ mặn: Từ nghiệm thức lựa chọn độ mặn thích hợp. + Nhiệt độ: Từ nghiệm thức lựa chọn nhiệt độ thích hợp. + Môi trường: Từ nghiệm thức lựa chọn môi trường thích hợp + Ánh sáng: Từ nghiệm thức lựa chọn ánh sáng thích hợp + Thể tích nuôi: 500ml
+ Sục khí liên tục
Xác định mật độ tảo liên tục trong 10 ngày
Lựa chọn được độ mặn thích hợp Lần lặp 2 Lần lặp 1 Lần lặp 3 Tảo giống Nhân giống 5.64 M 5.13 M 0.5 M 1M 1.5 M 2M 3M 4M 5M
Hình 2.7: Sơ đồ xác định đường cong sinh trưởng của tảo Dunaliella sp.
Tảo giống
Nhân giống
Lần lặp 2
Lần lặp 1 Lần lặp 3
Xác định mật độ tảo liên tục trong 10 ngày
Xây dựng đường cong sinh trưởng
Điều kiện nuôi cấy: lấy từ các nghiệm thức môi trường, mật độ ban đầu, nhiệt độ, ánh sáng, độ mặn,
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập tảo Dunaliella
3.1.1. Phân bố của tảo Dunaliella trên ruộng muối Khánh Hòa
Quá trình phân lập tảo từ lúc lấy mẫu về cho đến khi thu được chủng tảo thuần khiết được ghi lại ở hình 3.1
Hình 3.1: Quá trình phân lập chi tảo thuần Dunaliella sp. đã được phân lập
A. Mẫu tảo được lấy ở các ruộng muối ở tỉnh Khánh Hòa. B. Quan sát mẫu để phân lập.
C. Các mẫu được pha loãng ở các nồng độ khác nhau D. Nuôi cấy trên đĩa thạch.
A
C D
B
Bảng 3.1: Phân bố tảo Dunaliella trên các ruộng muối tỉnh Khánh Hòa Địa điểm thu mẫu
Thời gian thu mẫu pH Độ mặn
Sự xuất hiện của tảo Dunaliella Ninh Diêm Mẫu 1 4 >35% + Mẫu 2 4 35% + Mẫu 3 6 20% +++ Mẫu 4 5 15% + Mẫu 5 6 5.8% + Ninh Thủy + Mẫu 6 7.5 20% ++++ Mẫu 7 6.5 15% +++ Mẫu 8 6 15% +
Cuối mùa khô 2012
Mẫu 9 7 12% ++ Ninh Diêm Mẫu 15 5 10% + Mẫu 16 5 13% + Mẫu 17 6 9% + Ninh Thủy Mẫu 18 7 9% ++
Đầu mùa mưa 2012
Mẫu 19 7 7% + Ninh Diêm Mẫu 22 5 20% + Mẫu 23 4 20% - Mẫu 24 5.5 25% ++ Mẫu 25 6 25% ++++ Ninh Thủy Mẫu 26 7 15% ++++ Mẫu 27 6.5 10% +++
Đầu mùa khô 2013
Qua bảng 3.1 cho thấy các tảo Dunaliella sp. phân bố trên các ruộng muối có phổ pH từ 4-7.5, cho thấy loài tảo này có thể thích nghi trong phổ pH rộng, tuy nhiên ở môi trường có pH thấp sự có mặt của Dunaliella sp. ít hơn so với trong môi trường có giá trị pH cao. Cụ thể ở mẫu 1, 2, 16, pH = 4 không thấy hoặc rất ít
Dunaliella trong khi đó mẫu 6, 18, 19 ph từ 6-7 Dunaliella sp. rất nhiều. Các ruộng muối có dải độ mặn từ 5.8%-35% , độ mặn giảm dần vào mùa mưa do nước bị pha loãng, nhận thấy có sự khác nhau về sự có mặt của Dunaliella sp. vào mùa khô và mùa mưa. Vào mùa khô Dunaliella sp. có số lượng nhiều hơn so với mùa mưa. Giữa mùa khô , đầu mùa khô, độ mặn cao hơn, theo đó vào mùa khô hay tìm thấy sự có mặt Dunaliella sp. hơn. Vào mùa mưa, ngoài sự có mặt của tảo Dunaliella sp. còn có tảo silic khác,mùa khô đa số là Dunaliella sp. có ít tảo bám và tảo đáy do tảo
Dunaliella sp. là tảo có khả năng thích nghi độ mặn cao mà các tảo trên không có. Độ thuần chủng của Dunaliella sp. tăng nhanh lên qua các lần phân lập pha loãng và tăng nhanh sau lần phân lập thứ 6 (độ pha loãng 10-6). Qua lần phân lập này thì từ mẫu tảo thu từ ruộng muối đã được phân lập được tảo giống Dunaliella
sp. có độ thuần chủng 100% . Quan sát trên kính hiển vi thấy mật độ có cao vì vậy ở độ pha loãng về sau 10-7 vẫn thu được tảo thuần chủng. Trong quá trình thực hiện các thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy thành phần các loài tảo đất và tảo bám silic thôi, các mẫu tương đối sạch ít lẫn tạp.
Phân lập tảo Dunaliella bằng phương pháp pha loãng rồi cấy lên đĩa thạch. Tảo sẽ hình thành các khuẩn lạc từ các tế bào ban đầu mang màu sắc, đặc điểm của loài. Các hộp Petri chứa tảo được đặt trong điều kiện ánh sáng yếu 400-7500 lux, nhiệt độ thấp từ 18 -22oC. Sau một thời gian (≈ 3 tuần) khi các khuẩnlạc vi tảo đã hình thành rõ, cho mẫu lên lam kính, dùng kính hiển vi soi lại để kiểm tra độ thuần chủng. Sau đó dùng que cấy ria lấy tảo từ môi trường thạch cho vào bình 100ml chứa dịch môi trường. Sau nửa tháng dưới điều kiện ánh sáng, nhiệt độ như trên, môi trường sinh trưởng bắt đầu có màu xanh đặc trưng của loài.
3.1.2. Mô tả đặc điểm hình thái, vị trí phân loại của tảo Dunaliella
Để mô tả và định danh các chủng vi tảo Dunaliella, chúng tôi đã dựa vào một số đặc điểm hình thái của chúng. Các hình thái này được phát hiện căn cứ vào
khả năng phát triển của vi tảo trong môi trường có độ mặn lớn và sử dụng các phương pháp soi kính hiển vi quang học mô tả đặc điểm cấu trúc tế bào và đo kích thước tế bào dựa theo khóa phân loại của Tomas et al, 1997.
Kết quả: Bước đầu đã mô tả và định danh sơ bộ được 3 chủng vi tảo NT6, ND17 và NT18, phân lập được ở ruộng muối Khánh Hòa với các đặc điểm điển hình của tảo Dunaliella.
a) Chủng NT6
Nguồn gốc, đặc điểm hình thái
- Nguồn gốc: Chủng NT6 được phân lập từ mẫu 6 tại ruộng muối Ninh Thủy, thu vào cuối mùa khô năm 2012, với đặc điểm môi trường thu mẫu pH 7.5 và độ mặn là 20%.
- Mô tả đặc điểm hình thái: Tế bào nhỏ sống riêng lẻ, có 2 roi dài gấp đôi chiều dài cơ thể, chuyển động rất nhanh trên hiển vi trường, chiều dài tế bào 18 - 24µm, chiều rộng 10-15µm. Có một điểm mắt màu đỏ sậm ở một phía gần gốc roi, thể lạp xếp vòng hình chén ở phần dưới của tế bào chất, gồm những hạt nhỏ có màu đỏ nhạt, bắt màu sậm khi giảm cường độ ánh sáng (Hình 3.2 và 3.3).