2.4.1. Phân lập tảo Dunaliella sp
Việc phân lập tảo được làm qua các bước sau:
Lấy mẫu ở các ruộng muối
Kiểm tra các điều kiện( nhiệt độ, pH, độ mặn) Lọc mẫu
Soi mẫu để kiểm tra sự có mặt của Dunaliella
Nuôi tăng sinh bằng môi trường J/l 8,8%
Soi mẫu để quan sát mức độ phát triển trong các quần thể Dunaliella
Pha loãng mẫu theo các nồng độ khác nhau hoặc cấy trên môi trường thạch Phân lập được chủng tảo Dunaliella sp thuần
Thuyết minh quy trình
Thu mẫu là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu bất kì vi sinh vật nào. Mẫu được thu từ các ruộng muối của các xã Ninh Hải, Ninh Thủy của huyện Ninh Hòa tỉnh Khánh Hòa được đựng trong các chai nhựa. Tại địa điểm thu mẫu tiến
hành kiểm tra các điều kiện như pH, độ mặn, ánh sáng. Ta có thể sử dụng một số dụng cụ sau để kiểm tra các thông số trên như:
Sử dụng nhiệt kế thủy ngân chia vạch (0 – 100oC) để xác định nhiệt độ. Sử dụng giấy quỳ tím để đo pH: Sự thay đổi màu của giấy quỳ cho ta biết pH khi so sánh với thang màu chuẩn pH.
Sử dụng khúc xạ kế để đo độ mặn của nguồn nước: Nhỏ 1-2 giọt nước trong mẫu nước cần xác định độ mặn lên mặt kính, rồi đưa kính ra nơi sáng quan sát, đọc kết quả được hiển thị trên vạch chia độ.
Sử dụng lux kế xác định cường độ ánh sáng: Đưa bộ phận cảm ứng ánh sáng của lux kế vào nơi cần đo cường độ ánh sáng. Thông số cường độ ánh sáng sẽ hiển thị trên màn hình.
Quan sát sự có mặt của Dunaliella bằng tiêu bản giọt ép. Các mẫu xuất hiện
Dunaliella cho vào môi trường J/l và bắt đầu sục khí ngay để các tế bào tảo
Dunaliela phát triển. Sau một thời gian, khi thấy dung dịch dần có màu xanh đặc trưng của tảo Dunaliella.
Cách 1: Tiến hành phân lập bằng phương pháp pha loãng mẫu trong môi trường J/l. Mẫu tảo được pha loãng ở các nồng độ khác nhau, đến khi trong mỗi ống chỉ còn 1 tế bào. Thường là pha loãng theo dãy nồng độ giảm giần 10 lần.
Cách 2: Tiến hành phân lập bằng phương pháp cấy trên môi trường thạch. Nhỏ 1ml mẫu tảo lên bề mặt môi trường thạch và dùng que cấy trang gạt dàn đều cho đến khi dung dịch tảo khô đi trên mặt thạch.
Dựa vào hình thái màu sắc để chọn mẫu tảo mong muốn. Quá trình phân lập được lặp lại nhiều lần cho đến khi xác định được loài thuần khiết dựa vào quan sát trên kính hiển vi và một số tính chất khác. Sau đó được cấy chuyền vào các bình thủy tinh kích thước lớn để thu được một dòng tảo thuần.
2.4.2. Nuôi cấy và bảo quản giống tảo Dunaliella 2.4.2.1. Quy trình nuôi cấy dự kiến 2.4.2.1. Quy trình nuôi cấy dự kiến
Để xây dựng quy trình nuôi sinh khối Dunaliella sp. cần dựa vào kết quả thu được từ những nghiên cứu về ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường (nhiệt độ,
cường độ chiếu sáng, độ mặn và ánh sáng) lên sinh trưởng và phát triển của tảo
Dunaliella. Từ đó xây dựng quy trình nuôi phù hợp cho Dunaliella sp trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Tảo giống
Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp Xác định mật độ ban đầu thích hợp
Nhân giống
Xác định các điều kiện (nhiệt độ, cường độ ánh sáng, độ mặn) Xác định mật độ tảo sau vài ngày nuôi cấy
Lựa chọn các thông số thích hợp
Hình 2.1: Quy trình nuôi cấy dự kiến Thuyết minh quy trình nuôi:
Tảo giống được chuyển từ môi trường thạch sang môi trường lỏng trong các bình tam giác 100ml, được cấy chuyển sang bình tam giác 250 đến các bình serum 500ml, cuối cùng cấy chuyển sang bình cầu 1lít. Giống tảo phải phát triển đồng nhất, không nhiễm tạp và không tàn lụi. Sau đó tiến hành nhân giống theo điều kiện chung: Môi trường dinh dưỡng J/l, thể tích tảo bằng ½ thể tích dung dịch, độ mặn 8,8%, nhiệt độ 25oC, thời gian chiếu sáng 24/24h và được sục khí liên tục. Sử dụng nguồn giống này để thực hiện các thí nghiệm.
Giống được nuôi trong điều kiện khác nhau để tìm ra các yếu tố thích hợp cho tảo phát triển. Sau 2, 3 ngày thì lấy mẫu tảo và tiến hành đếm để xác định mật độ tảo cực đại đạt được. Từ đó lựa chọn được các thông số về môi trường, mật độ ban đầu, nhiệt độ, cường độ chiếu sáng, độ mặn thích hợp để cho tảo Dunaliella sp. phát triển tốt nhất.
Giữ giống là biện pháp bảo quản kỹ thuật nhằm giữ giống gốc để chủ động trong quá trình nghiên cứu và sản xuất. Việc chọn tảo giống để giữ và nuôi sinh
khối rất quan trọng phải đảm bảo giống sạch không tạp nhiễm vì thế tất cả các thao tác kỹ thuật trong cấy và giữ giống tảo đều phải đảm bảo vô trùng
Có 2 cách để lưu giữ giống tảo: - Lưu giữ trên môi trường thạch. - Lưu giữ trên môi trường lỏng.
2.4.2.2. Lưu giữ trên môi trường thạch
a) Chuẩn bị
- Tất cả các dụng cụ phải được hấp sấy khử trùng trước khi sử dụng. - Sử dụng 20g agar/1 lít môi trường nuôi cấy.
- Môi trường J/l đã được khử trùng.
b) Pha môi trường agar
Pha môi trường agar 2% (pha 2gam agar trong 100ml nước), đun hòa tan hết agar trong lò vi song rồi đổ ra đĩa peptri (đã khử trùng) với thể tích agar bằng 1/3 thể tích đĩa Petri. Hoặc đổ thạch nghiêng. Sau đó để nguội agar trong box cấy vô trùng. Để cho thạch đông lại.
c)Trên môi trường thạch
Tảo giống được cấy trên môi trường J/lcó bổ sung agar. Dùng que cấy hơ trên ngọn lửa đèn cồn, đợi cho que cấy nguội, lấy một ít tảo giống cấy ziczac trên bề mặt thạch nghiêng trong ống nghiệm và đĩa petri, tảo nuôi giữ trong điều kiện ánh sáng 7500 lux với chu kì chiếu sáng là 24h/24h, nhiệt độ 28oC. Sau một thời gian, tảo mọc trên mặt thạch. Kiểm tra các khuẩn lạc thuần khiết, chọn ống nghiệm hoặc đĩa thạch nào có khuẩn tảo lên đẹp để lưu giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-5oC, hạn chế ánh sáng.
2.4.2.3. Lưu giữ giống trên môi trường lỏng
a)Môi trường nuôi
Môi trường dinh dưỡng J/l
b)Phương pháp lưu giữ giống
Dịch tảo thuần được thu nuôi ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng của tảo đạt tốt nhất được lấy từ nguồn giống lưu giữ, mật độ ban đầu 2x105 tb/ml. tảo được nuôi giữ trong điều kiện ánh sáng yếu, nhiệt độ 22oC.
2.4.3. Xác định mật độ tảo bằng phương pháp đếm tế bào bằngbuồng đếm hồng cầu hồng cầu
a)Mục đích
Sử dụng buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ tảo qua các giai đoạn.
b)Phương pháp tiến hành
Chu kỳ lấy mẫu: 24h/lần.
Chuẩn bị các ống eppendorf. Hút ra 300µl và cho 2 đến 3 giọt lugol. Khuấy đều để trong ít phút để cố định.
Xác định mật độ tế bào: Xác định mật độ tế bào bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer (Đức), dung vật kính 40X để quan sát.
Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5-10 tế bào. Đậy lamelle lên 2 khu vực có kẻ ô đếm. Đưa buồng đếm lên kính hiển vi, lắc mẫu cho đều dùng pipet nhỏ mẫu cần xác định vào khe buồng đếm chỗ lá kính đậy lên, dung dịch theo mao dẫn lan khắp ô đếm. Để yên buồng đếm trong khoảng 5 phút để tế bào tảo lắng xuống. Đếm tế bào tảo ở 5 ô trung bình của khu vựcđếm hồng cầu (4 ô ở 4 góc và 1 ô giữa). Trong mỗi ô trung bình đếm cả 16 ô nhỏ. Trong mỗi ô nhỏ, đếm tất cả những tế bào nằm gọn trong ô và những tế bào nằm ở cạnh trên và cạnh trái.
+ Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu: Buồng đếm hồng cầu là một miếng kính dày hình chữ nhật, mặt trên có 2 khu vực có kẻ ô đếm dưới kính hiển vi, buồng đếm được chia thành 9 ô vuông lớn, mỗi ô có diện tích 1mm2. Ô chính giữa được sử dụng để đếm được chia thành 225 ô trung bình, mỗi ô trung bình được chia thành 16 ô nhỏ. Cụ thể:
- Mỗi buồng đếm có các Block: A, B, C, D và E. Mỗi Block: A, B, C, D được chia làm 1 ô vuông nhỏ , mỗi ô vuông có diện tích 1 mm2, sâu 0,1mm nên thể tích của mỗi ô sẽ là 0,1 mm3
Nếu đếm tảo trong 4 ô này là X thì mật độ tảo là: d(tb/ml) = X x 104 (tb/ml) - Riêng Block E được chia làm 25 ô vuông nhỏ, mỗi ô có thể tích là 1/25 x 0.1 mm3 (0.004mm3 = 0.000004ml = 4 x 10-6 ml), mỗi ô vuông nhỏ lại được chia làm 16 ô vuông nhỏ hơn.
Nếu đếm tảo trong mỗi ô nhỏ (trong 25 ô vuông) là X thì mật độ tảo là: d(tb/ml) = X/V = X /4 x 106 (tb/ml)
Trong đó :
d: mật độ tế bào (tb/ml)
X : số tế bào trung bình của 1 ô (bằng tống số tế bào đếm được/số ô đếm)
V: thể tích của ô đếm.
2.4.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng của tảo Dunaliella trưởng của tảo Dunaliella
a) Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp
Để xác định môi trường nuôi cấy thích hợp chúng tôi sử dụng 3 loại môi trường thường được dùng để nuôi tảo Dunaliella là môi trường J/l. F/2, Walne.
Điều kiện thí nghiệm:
+ Mật độ tế bào vi tảo: 5x103 tb/ml [16], [18] + Nhiệt độ: 28oC
+ Cường độ chiếu sáng: 7500 lux [32] + Độ mặn: 8.8%
+ Sục khí liên tục
+ Thời gian chiếu sáng: 24h/24h + Thể tích nuôi: 500ml
Hình 2.2: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng và phát triển của tảo Dunaliella sp.
b) Xác định mật độ ban đầu thích hợp
Điều kiện thí nghiệm:
+ Mật độ 105 tb/ml, 2x105 tb/ml, 4x105 tb/ml, 8x105 tb/ml + Cường độ chiếu sáng: 7500lux
+ Môi trường từ nghiệm thức lựa chọn môi trường + Thời gian chiếu sáng: 24h/24h
+ Sục khí liên tục
+ Sử dụng môi trường J/l + Thể tích nuôi: 500ml
Tảo giống
Nhân giống
Môi trường Wanle Môi trường F/2 Môi trường J/l
Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3
Xác định mật độ tảo trong 20 ngày Lựa chọn được môi trường thích hợp
Hình 2.3: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của mật độ ban đầu đến sinh trưởng và phát triển của tảo Dunaliella sp.
c) Ảnh hưởng của nhiệt độ
Điều kiện thí nghiệm:
+ Nhiệt độ: 22oC, 28oC, nhiệt độ phòng. + Cường độ chiếu sáng: 7500lux
+ Môi trường: Từ nghiệm thức lựa chọn môi trường thích hợp
+ Mật độ ban đầu: Từ nghiệm thức lựa chọn mật độ ban đầu thích hợp + Thời gian chiếu sáng: 24/24h
+ Sục khí liên tục + Thể tích nuôi: 500ml Lần lặp 2 Lần lặp 1 Lần lặp 3 Xác định mật độ tảo Lựa chọn được mật độ thích hợp Tảo giống Nhân giống 105 tb 2x105 tb 4x105 tb 8x105 tb
Hình 2.4: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của tảo Dunaliella sp.
d) Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng
Điều kiện thí nghiệm:
+ Ánh sáng: 10Klux 14Klux
+ Môi trường: Từ nghiệm thức lựa chọn môi trường thích hợp
+ Mật độ ban đầu: Từ nghiệm thức lựa chọn mật độ ban đầu thích hợp + Nhiệt độ: Từ nghiệm thức lựa chọn nhiệt độ thích hợp.
+ Sục khí liên tục + Thể tích nuôi: 500ml
Tảo giống
Nhân giống
Nhiệt độ 22oC Nhiệt độ 28oC Nhiệt độ phòng
Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3
Xác định mật độ tảo liên tục trong 10 ngày
Hình 2.5: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và phát triển của tảo Dunaliella sp.
e) Ảnh hưởng của độ mặn
Điều kiện thí nghiệm:
+ Độ mặn: 0.5M, 1M, 1.5M, 2M, 3M, 4M, 5M, 5.13M, 5.4M. + Môi trường: Từ nghiệm thức lựa chọn môi trường thích hợp.
+ Mật độ ban đầu: Từ nghiệm thức lựa chọn mật độ ban đầu thích hợp. + Nhiệt độ: Từ nghiệm thức lựa chọn nhiệt độ thích hợp.
+ Ánh sáng: Từ nghiệm thức lựa chọn anh sáng thích hợp. + Sục khí liên tục
+ Thể tích nuôi: 500ml
Xác định mật độ tảo liên tục trong 10 ngày
Lựa chọn được ánh sáng thích hợp Lần lặp 2 Lần lặp 1 Lần lặp 3 Tảo giống Nhân giống 14 Klux 13.5 Klux 10 Klux 10.5 Klux 11 Klux 11.5 Klux 12 Klux 12.5 Klux 13 Klux
Hình 2.6: Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng và phát triển của tảo Dunaliella sp.
f) Xây dựng đường cong sinh trưởng
Điều kiện thí nghiệm:
+ Mật độ ban đầu: 5x103 tb/ml.
+ Độ mặn: Từ nghiệm thức lựa chọn độ mặn thích hợp. + Nhiệt độ: Từ nghiệm thức lựa chọn nhiệt độ thích hợp. + Môi trường: Từ nghiệm thức lựa chọn môi trường thích hợp + Ánh sáng: Từ nghiệm thức lựa chọn ánh sáng thích hợp + Thể tích nuôi: 500ml
+ Sục khí liên tục
Xác định mật độ tảo liên tục trong 10 ngày
Lựa chọn được độ mặn thích hợp Lần lặp 2 Lần lặp 1 Lần lặp 3 Tảo giống Nhân giống 5.64 M 5.13 M 0.5 M 1M 1.5 M 2M 3M 4M 5M
Hình 2.7: Sơ đồ xác định đường cong sinh trưởng của tảo Dunaliella sp.
Tảo giống
Nhân giống
Lần lặp 2
Lần lặp 1 Lần lặp 3
Xác định mật độ tảo liên tục trong 10 ngày
Xây dựng đường cong sinh trưởng
Điều kiện nuôi cấy: lấy từ các nghiệm thức môi trường, mật độ ban đầu, nhiệt độ, ánh sáng, độ mặn,
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập tảo Dunaliella
3.1.1. Phân bố của tảo Dunaliella trên ruộng muối Khánh Hòa
Quá trình phân lập tảo từ lúc lấy mẫu về cho đến khi thu được chủng tảo thuần khiết được ghi lại ở hình 3.1
Hình 3.1: Quá trình phân lập chi tảo thuần Dunaliella sp. đã được phân lập
A. Mẫu tảo được lấy ở các ruộng muối ở tỉnh Khánh Hòa. B. Quan sát mẫu để phân lập.
C. Các mẫu được pha loãng ở các nồng độ khác nhau D. Nuôi cấy trên đĩa thạch.
A
C D
B
Bảng 3.1: Phân bố tảo Dunaliella trên các ruộng muối tỉnh Khánh Hòa Địa điểm thu mẫu
Thời gian thu mẫu pH Độ mặn
Sự xuất hiện của tảo Dunaliella Ninh Diêm Mẫu 1 4 >35% + Mẫu 2 4 35% + Mẫu 3 6 20% +++ Mẫu 4 5 15% + Mẫu 5 6 5.8% + Ninh Thủy + Mẫu 6 7.5 20% ++++ Mẫu 7 6.5 15% +++ Mẫu 8 6 15% +
Cuối mùa khô 2012
Mẫu 9 7 12% ++ Ninh Diêm Mẫu 15 5 10% + Mẫu 16 5 13% + Mẫu 17 6 9% + Ninh Thủy Mẫu 18 7 9% ++
Đầu mùa mưa 2012
Mẫu 19 7 7% + Ninh Diêm Mẫu 22 5 20% + Mẫu 23 4 20% - Mẫu 24 5.5 25% ++ Mẫu 25 6 25% ++++ Ninh Thủy Mẫu 26 7 15% ++++ Mẫu 27 6.5 10% +++
Đầu mùa khô 2013
Qua bảng 3.1 cho thấy các tảo Dunaliella sp. phân bố trên các ruộng muối có phổ pH từ 4-7.5, cho thấy loài tảo này có thể thích nghi trong phổ pH rộng, tuy nhiên ở môi trường có pH thấp sự có mặt của Dunaliella sp. ít hơn so với trong môi trường có giá trị pH cao. Cụ thể ở mẫu 1, 2, 16, pH = 4 không thấy hoặc rất ít
Dunaliella trong khi đó mẫu 6, 18, 19 ph từ 6-7 Dunaliella sp. rất nhiều. Các ruộng muối có dải độ mặn từ 5.8%-35% , độ mặn giảm dần vào mùa mưa do nước bị pha loãng, nhận thấy có sự khác nhau về sự có mặt của Dunaliella sp. vào mùa khô và mùa mưa. Vào mùa khô Dunaliella sp. có số lượng nhiều hơn so với mùa mưa. Giữa mùa khô , đầu mùa khô, độ mặn cao hơn, theo đó vào mùa khô hay tìm thấy sự có mặt Dunaliella sp. hơn. Vào mùa mưa, ngoài sự có mặt của tảo Dunaliella sp. còn có tảo silic khác,mùa khô đa số là Dunaliella sp. có ít tảo bám và tảo đáy do tảo
Dunaliella sp. là tảo có khả năng thích nghi độ mặn cao mà các tảo trên không có.