Sự phát triển của tảo NT6 với các mật độ ban đầu khác nhau được trình bày trên phụ lục 8 và hình 3.8.
Biến động mật độ tảo theo mật độ ban đầu
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Ngày 8 Ngày 9 Ngày 10 M ậ t đ ộ t ả o ( tr iệ u t b /m l) 10^5 tb 2x10^5 Tb 4x10^5Tb 8x10^5 tb
Hình 3.8: Sinh trưởng phát triển của tảo NT6 theo mật độ ban đầu
Kết quả trong hình 3.8 cho thấy: Ở 4 ngày đầu của quá trình sinh trưởng sự chênh lệch sinh khối không nhiều ở các mật độ 2x105 tb/ml, 4x105 tb/ml, 8x105 tb/ml. Cụ thể tảo vào ngày thứ 4 ở 2x105 tb/ml đạt mật độ 2.56x105 tb/, ở mật độ 4x105 tb/ml đạt 2.08x105 tb/ml. Tuy nhiên sang ngày thứ 6 đã có sự thay đổi rõ rệt giữa mật độ 8x105 tb/ml so với các mật độ khác, thời điểm này mật độ 8x105 tb/mlđã đạt cực đại và giảm dần ở ngày thứ 7, trong khi đó ở các mật độ còn lại, mật độ tảo đạt cực đại vào ngày 8, nhưng từ giá trị ban đầu 2x105 tb/ml. Sau 8 ngày nuôi mật độ tảo NT6 đạt cực đại là 5.94x105 tb/ml, cao hơn hẳn so với các giá trị mật độ ban đầu khác.
Khi phân tích ANOVA một nhân tố về mật độ cực đại cho thấy: Mật độ cực đại ở các mật độ giữa các lô thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa (P<0.05)
Như vậy mật độ phù hợp cho sinh trưởng và phát triển của tảo NT6 là 2x105 tb/ml .
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến sự sinh trưởng của chủng NT6
Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng và phát triển, đến khả năng sính sản của vi tảo nói chung và chi Dunaliella nói riêng. Vì vậy để tìm được điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của vi tảo Dunaliella, trong nghiên cứu
này chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm nuôi ở các ngưỡng nhiệt độ 22oC, 28oC và nhiệt độ phòng. Kết quả được trình bày trên phụ lục 9 và hình 3.9.
Biến động mật độ tảo theo nhiệt độ
0 1 2 3 4 5 6 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày 8 ngày 9 m ậ t đ ộ t ả o ( tr iệ u t b /m l) 22 do C 28 do C nhiet do phong
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến mật độ tế bào chủng NT6
Từ hình 3.9 và phụ lục 9. Trong 4 ngày đầu mật độ tảo tăng chậm, sang ngày 5 ngày nuôi mật độ tảo bắt đầu có xu hướng tăng nhanh. Lúc này mật độ tảo đã chuyển sang pha tăng trưởng, xu hướng tăng của mật độ tảo ở các lô thí nghiệm bắt đầu phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi.
28oC là nhiệt độ phù hợp nhất cho sự phát triển và thích nghi tốt của tảo NT6. Sau 4 ngàynuôi tảo đạt mật độ 1.48 x106 tb/ml. Sang ngày thứ 5 mật độ tảo tăng lên 3.12 x106 tb/ml. Pha tăng trưởng của môi trường này kéo dài tới ngày thứ 8, mật độ tảo đạt cực đại được 5.38x106 tb/ml thì tảo chuyển sang pha cân bằng. Sau ngày thứ 8, mật độ tảo giảm dần và bắt đầu chuyển sang pha tàn lụi.
Ở pha tăng trưởng của nhiệt độ 22oC và nhiệt độ phòng mật độ tảo cũng tăng nhưng không tăng đột biến như ở nhiệt độ 28oC.Mật độ tảo ở pha tăng trưởng nhiệt độ phòng hầu như luôn cao hơn ở nhiệt độ 22oC. Cụ thể ngày 3, ngày 4 ở nhiệt độ phòng là 1.05 x106 tb/ml và 1.51 x106 tb/ml tương ứng ở nhiệt độ 22oC là 0.37 x106 tb/ml, 1.12 x106 tb/ml Tuy nhiên, mật độ cực đại ở nhiệt độ phòng lại thấp hơn ở 22OC (ở nhiệt độ phòng mật độ tảo đạt cực đại 2.61 x106 tb/ml và 22OC mật độ cực đại đạt 3.26 x106 tb/ml).
độ tảo đạt kết quả cực đại cũng khác nhau. Kết quả phân tích ANOVA một nhân tố ( P< 0.05) về mật độ cực đại ở các nhiệt độ 22oC, 28oC, nhiệt độ phòng có sự sai khác thống kê về mật độ cực đại giữa các môi trường.
Dựa trên các kết quả thu được và qua phân tích ANOVA một nhân tố, NT6 là loài có khả năng thích nghi với phổ nhiệt độ rộng. Nhưng trong khoảng nhiệt độ thí nghiệm ta thấy nhiệt độ càng cao thì mức độ sinh trưởng của loài tảo này càng hạn chế. Nhiệt độ phù hợp cho sinh trưởng và phát triển của tảo NT6 là 28oC. Đây là nhiệt tối ưu cho chi tảo này đạt mật độ cao khi nuôi sinh khối.
3.3.4. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng của chủng NT6
.
Hình 3.10: Lô thí nghiệm nuôi tảo tại các cường độ ánh sáng khác nhau
Ánh sáng là yếu tố quan trọng, quyết định đến sự tồn tại, phát triển của các loài quang dưỡng. Kết quả thu được như mô tả hình 3.11 và phụ lục 10:
Biến động mật độ tảo theo ánh sáng
0 1 2 3 4 5 6 7 8
ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày 8 ngày 9
M ậ t đ ộ t ả o ( tr iệ u t b /m l) 10 klux 10.5 klux 11 klux 11.5 klux 12 lux 12.5 klux 13 klux 13.5 klux 14 klux
Thông qua phụ lục 10 cho thấy ở điều kiện 13 và 13.5Klux, chủng tảo NT6 phát triển khá nhanh, mật độ tảo tăng lên nhanh chóng và đạt mật độ cực đại vào khoảng ngày nuôi thứ 7. Trong khí đó các lô còn lại thì tảo cực đại vào ngày thứ 8. Tuy nhiên sau khi đạt mật độ cực đại thì chúng tàn lụi rất nhanh, tương ứng giảm từ 5.12x106 tb/ml còn 4.06x106 tb/ml và từ 4.96x106 tb/ml còn 3.92x106 tb/mlchỉ trong vòng 1 ngày. Nhìn chung những ngày đầu tiên tốc độ tăng trưởng đồng đều đến ngày thứ 5 trở đi tốc độ tăng trưởng bắt đầu có xu hướng gia tăng khác nhau theo các cường độ ánh sáng khác nhau.
Mật độ cực đại của tảo ở tất cả các lô 10.5 Klux, 11 Klux, 11.5 Klux không chênh lệch nhau quá nhiều ở ngày 8, dao động trong khoảng 5.53x106 tb/ml đến 5.62x106 tb/ml.
Ở điều kiện cường độ chiếu sáng 14Klux và 10Klux, sự gia tăng về số lượng tảo được thể hiện rõ nhất. Ở các cường độ chiếu sáng này tảo thích ứng rất tốt. Tuy mật độ tảo cực đại ở 14 Klux cao hơn ở 10Klux nhưng mật độ tảo trong pha tăng trưởng và pha cân bằng luôn thấp hơn so với ở điều kiện 10Klux. Mật độ đạt cực đại rơi vào ngày nuôi thứ 8, với số lượng lên tới 6.53x106tb/ml đến 7.2x106 tb/ml.
Ở điều kiện ánh sáng 12Klux, 12.5Klux, tảo NT6 phát triển tương đối chậm, mật độ tảo tăng lên từ từ, không có những bước nhảy cao về mật độ như ở các cường độ chiếu sáng khác và mật độ cao nhất ngày thứ 8 là: 3.95-3.98x106tb/ml Chu kỳ sinh trưởng ở mức ánh sáng này diễn ra tương đối chậm. Điều này được giải thích là do ở điều kiện ánh sáng này quá trình chuyển hóa năng lượng của tế bào vi tảo là tương đối thấp, nên tăng trưởng và phát triểncủa tảo cũng vì thế mà yếu hơn.
Kết quả phân tích ANOVA trình bày trong phụ lục 10 cho thấy: ở cường độ chiếu sáng khác nhau thì mật dộ tảo đạt cực đại khác nhau. Kết quả phân tích ANOVA một nhân tố (P<0.05) thấy có sự sai khác về mật độ cực đại giữa các cường độ chiếu sáng. Qua thẩm định thống kê tại phụ lục 10 tại 3 lô 10.5Klux, 11Klux, 11.5Klux không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với lô 12Klux, 13Klux nhưng có sự sai khác so với các lô cònlại (P<0.05). Lô 12.5Klux không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với lô 12Klux, nhưng có sự sai khác về mặt thống kê so với các lô còn lại. Cường độ chiếu sáng 14Klux cũng có sự sai khác về mặt thống kê so với các lô còn lại
Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy tảo NT6 có khả năng thích nghi và phát triển ở cường độ ánh sáng là 10klux – 14klux khi nuôi ở thể tích 500ml, NT6 phát triển tốt ở cường độ chiếu sáng là 10 Klux và 14Klux và đạt mật độ cực đại trong điều kiện 14Klux.
3.3.5. Ánh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng của chủng NT6
Kết quả thu được trình bày ở Hình 3.12 và phụ lục 11:
Biến động mật độ tảo theo độ mặn
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
ngay1 ngay2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày 8 ngày 9
M ậ t đ ộ t ả o ( tr iệ u T b /m l) 0.5 M 1 M 1.5 M 2 M 3 M 4 M 5 M 5.13 M 5.64 M
Hình 3.12: Sinh trưởng phát triển của tảo Dunalielle sp theo độ mặn
Tảo Dunaliella là các loài rất ưa mặn, có thể tồn tại từ độ mặn 0.5M đến 5.5M. Tuy nhiên với NT6 từ ruộng muối Khánh Hòa khi thay đổi từ 0.5M đên 5.64M thấy tảo có thể phát triển ở độ mặn từ 0.5 đến 4M và phát triển mạnh nhất từ 1.5M và 2M. Ở độ mặn 5M, 5.13M, 5.64M nhìn chung số lượng tảo giảm dần và sau 9 ngày không còn tế bào tảo. Sự chết của tế bào tảo ở độ mặn 5M đến 5.64M có thể do shock muối, độ mặn cao quá gây stress cho tảo, có thể tế bào không kịp tích lũy glycerol để thay đổi áp suất thẩm thấu của màng tế bào thích nghi với môi trường, nên nước từ trong tế bào đi ra ngoài, làm tế bào teo lại và tảo chết.
Những ngày đầu của quá trình thí nghiệm, sự khác nhau về mật độ NT6 ở các độ mặn chưa đáng kể. Tuy nhiên sau ngày thứ 5, sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05). Mật độ NT6 đạt cực đại sau 8 ngày nuôi cấy, trong đó cao nhất là ở độ mặn 2M với 6.24x106tb/ml, kế tiếp là 1.5M với 6.05x106tb/ml, 3M với 5.33x106tb/ml, 0.5M là 4.91x106tb/ml, 1M là 4.59x106tb/ml, thấp nhất tại 4M là 4.52x106tb/ml. Sau ngày thứ 8, sự tàn lụi ở các lô 1.5M; 2M; 3M chậm hơn so với 3 lô 0.5M; 1M;
4M. Đường cong sinh trưởng của quần thể tảo ở lô 1.5M và 2M tương đối đều và ổn định, sau khi đạt cự đại mật độ của tảo không giảm mạnh như các lô thí nghiệm còn lại. Mật độ cực đại của tảo ở lô 2M là 6.2x106 tb/ml lại lớn hơn so với ở lô 1.5M 6.05 x106tb/ml. NT6 có dải độ mặn rộng từ 0.5-4M nhưng cực thuận độ mặn thích hợp nhất là 2M.
3.3.6. Xây dựng đường cong sinh trưởng
Để xác định đường cong sinh trưởng chúng tôi tiến hành nuôi tảo NT6 trong môi trường J/l có pH = 7, mật độ ban đầu 5x103 tb/ml, nhiệt độ 280C, cường độ ánh sáng 14Klux, độ mặn 2M. Tiến hành xác định số lượng tế bào sau các ngày nuôi cấy. Kết quả trình bày hình 3.13.
Kết quả ở hình 3.13 cho thấy NT6 thể hiện đầy đủ các pha của quá trình sinh trưởng, bao gồm pha lag, log, cân bằng và pha suy vong. Trong 12 ngày đầu của quá trình nuôi cấy, mật độ tế bào nhìn chung không có sự thay đổi, khoảng thời gian này biểu hiện cho pha lag của quá trình sinh trưởng phát triển. Pha log thể hiện rõ sau 12 ngày nuôi và kéo dài đến ngày thứ 17, mật độ tế bào tăng theo hàm mũ và đạt cực đại vào ngày 17 với số lượng tế bào là 5.95x106 tb/ml. Từ ngày thứ 17 đến ngày 19, sự khác biệt về mật độ tế bào là không chênh lệch nhiều do đây là giai đoạn tảo đang ở trong pha ổn định của quá trình sinh trưởng phát triển. Sau 19 ngày nuôi cấy, tảo đi vào pha tử vong, số lượng tế bào chết tăng lên. Sau 20 ngày nuôi cấy số lượng tế bào chỉ còn 4.68 x106 tb/ml.
Đường cong sinh trưởng
0 1 2 3 4 5 6 7 Ngà y 1 Ngà y 3 Ngà y 5 Ngà y 7 Ngà y 9 Ngà y 11 ngày 13 Ngà y 15 Ngà y 17 ngày 19 M ậ t đ ộ t ế b à o t ả o ( tr iệ u t b /m l) J/l 2N
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Kết luận
• Phân lập: sơ bộ định danh được 3 chủng: D. salina, D. bardavil, D. acidophila.
• Bảo quản: Môi trường lỏng lưu giữ đươc 4-4.5 tháng, môi trường thạch lưu giữ được 5 tháng.
• Trong ba môi trường dinh dưỡng được thử nghiệm gồm: môi trường Wanle; J/l; F/2 thì môi trường J/l thích hợp tốt nhất cho tảo NT6 phát triển. • Mật độ ban đầu thích hợp cho sự phát triển của tảo NT6 là 2x105 tb/ml. • Với 3 mức nhiệt độ lựa chọn là 22oC, 28oC, nhiệt độ phòng thì nhiệt
độ thích hợp nhất cho tảoNT6 là 28oC
• Trong điều kiện ánh sáng nhân tạo (có cường độ từ 10 đến 14Kux), nhìn chung, mật độ tảo NT6 tăng tỷ lệ thuận với cường độ ánh sáng. Cường độ ánh sáng nhân tạo phù hợp cho sự tăng trưởng của tảo 14 Klux. • NT6 có thể phát triển ở độ mặn từ 0.5M - 4M. thuy nhiên chúng phát
triển cực thuận ở độ mặn 2M.
• Đường cong sinh trưởng của NT6 pha lag: 0 – 12 ngày, pha log: 12– 17 ngày, pha ổn định: 17 – 19 ngày, pha tử vong sau 19 ngày.
Đề xuất
• Vì chủng NT6 ưa mặn có thể cystn nên cần khảo sát quá trình bảo quản dưới dạng thể cyst.
• Sử dụng chỉ thị sinh học phân tử để định danh chính xác các loài đã phân lập
• Cần có thêm nghiên cứu đánh giá được ảnh hưởng của chu kì chiếu sáng và cường độ ánh sáng mạnh lên sinh trưởng và phát triển của vi tảo NT6.
TÀI LIỆU THAM KHẢO a) Tài liệu Tiếng Việt
1) Nguyễn Bá Lộc (1997), Quang hợp, NXB Giáo Dục, Hà Nội.
2) Trần Thị Sao Mai (2001), “Ảnh hưởng của nồng độ nitơ và chế độ sục khí lên sinh trưởng và hàm lượng sắc tố của vi tảo biển Isochrysis galbana”, Khoá luận tốt nghiệp, Đai học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
3) Đặng Xuyến Như, Nguyễn Phú Cường, Dương Hồng Dinh (1999), “Ứng dụng tảo và cột lọc sinh học trong xử lý nước thải quy mô nhỏ”, Kỷ yếu Hội nghị công nghệsinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹthuật, Hà Nội.
4) Ngô Kế Sương, Nguyễn Văn Hòa(1994) “Kết quả bước đầu nghiên cứu tảo lam cố định Nitơ”. Tạp chí sinh học 16; trang 50-54.
5) Đặng Thị Sy (2005), Tảo học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
6) Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (1998), Hệthống học thực vật. NXB Đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
7) Dương Đức Tiến (2006), “Phân loại , phân lập, bảo quản một số vi tảo biển và quy trình sản xuất phục vụ cho nuôi trồng thủy sản”, Báo cáo tổng kết đề tài Trung tâm CNSH, ĐHQGHN.
8) Nguyễn Thụy Vỹ Tuyền (2004), “Nghiên cứu thành phần loài của chi Prorocentrum Ehrenberg, 1934 ở vịnh Nha Trang và thăm dò ảnh hưởng của một số nhân tố sinh thái đến sinh trưởng quần thể của một loài Prorocentrum
tiêu biểu trong điều kiện phòng thí nghiệm”, Luận văn Thạc sĩ Khoa học Sinh học, Đại học Khoa học, Huế.
9) Trần Văn Tựa, Nguyễn Thị Hồng, Đặng Đình Kim (2003), “Khả năng loại bỏ niken và crom từ dung dịch của vi tảo Chlorella sp. và ảnh hưởng của các kim loại này lên sinh trưởng của tảo”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học và Kỹthuật,Hà Nội, tr. 405 – 407. .
b) Tài liệu Tiếng Anh
10) Alkayal F., Albion R. L., Tillett R. L., Hathwaik L. T., Lemos M. S., Cushman J. C (2010) Expressed sequence tag (EST) profiling in hyper saline shocked
Dunaliella salina reveals high expression of protein synthetic apparatus components. Plant Sci, (179) 437- 449 .