Đầu thế kỷ 18, các nhà khoa học cho rằng Dunaliella giống với Haematococcus, nhưng nửa sau thế kỷ 19, họ tìm ra rằng chi này khác biệt với Haematococcus và đặt tên mới là Dunaliella [11]. Cho đến nay, 28 loài Dunaliella
đã được công nhận (Hình 1.1). Chúng bao gồm năm loài (từ mẫu 1-5 ở Hình 1.1) sống trong nước ngọt và hiếm khi xuất hiện, trong khi đó 23 loài trong số này (từ mẫu 6-28 ở Hình 1.1) có mặt trong môi trường mặn [11]. Hình dạng tế bào của
Dunaliella thay đổi từ hình elip, hình trứng, hình trụ và hình quả lê đến gần hình cầu [13]. Các tế bào của một loài nhất định có thể thay đổi hình dạng với điều kiện thay đổi, thường trở thành hình cầu trong điều kiện không thuận lợi [12]. Kích thước tế bào cũng có thể thay đổi với điều kiện sinh trưởng và cường độ ánh sáng [17]. Tổ chức tế bào nói chung được nghiên cứu tương đối chi tiết trong D. salina
trên kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử.
Tế bào không có thành, nhưng có lớp áo là màng nhầy nguyên sinh chất bao quanh. Tế bào có 2 roi đều nhau, và thường chuyển động đồng thời. Có một thể lục lạp đơn chiếm gần hết khoang tế bào. Thể này có thể có hình chén, đĩa, chuông và có một phần dày hơn có chứa một pyrenoit (dạng nhân, hạt tinh bột, thể vùi). Thể lục lạp chia thành nhiều thùy, các chồng thylacoit của thể lạp thỉnh thoảng tập trung thành từng cụm gồm trên 10 đơn vị. Các cụm thylacoit được cho là có liên quan đến sự sinh trưởng của tế bào trong điều kiện ánh sáng mạnh và nồng độ muối cao. Hạt tinh bột thường bao quanh pyrenoit, nhưng cũng có thể được tìm thấy tại các nơi khác của lục lạp. Ở một số loài (D. salina, D. parva) thể lạp cũng có thể tích lũy một số lượng lớn β-caroten trong các giọt dầu ở khoảng trong màng thylacoit, vì vậy tế bào thường có màu cam đỏ hơn là màu xanh. Hạt β-caroten của D. salina chỉ có các giọt mỡ trung tính, hơn một nửa trong số đó là β-caroten. Phần lớn các dạng màu đỏ sẽ mất màu trong điều kiện ánh sáng yếu [35].
Điểm mắt (eyespot) thường phân bố ở phần trước trong thể lục lạp. Ở một số loài, đặc biệt là D. salina, điểm mắt hầu như rất khó quan sát dưới kính hiển vi quang học. Thể nhân (nucleus) thường bị che khuất bởi một số lượng lớn các hạt.
Nó chiếm hầu hết phần trước của tế bào và được bao quanh bởi các thùy trước của thể lạp. Nghiên cứu siêu cấu trúc cho thấy nó có một vỏ có lỗ (porous envelope) và một hạch nhân đơn, lồi được bao quanh bởi các cấu trúc chromatin. Có thể quan sát thấy cấu trúc ti thể ở nhiều phần khác nhau của tế bào. Số lượng và kích thước ty thể thay đổi rất lớn giữa các tế bào ở những giai đoạn sinh trưởng khác nhau. Tế bào có từ 2-4 thể Golgi. Mạng lưới nội chất (ER) thường nằm phía dưới màng sinh chất. Trong suốt thời kỳ bị stress do muối cao, ER tăng về số lượng, ER đóng vai trò như một bể nhân tạo chứa vật chất màng khi các thành phần chính của tế bào co lại. Không bào rất đa dạng, có chứa một số thành phần tế bào và các túi, bọng, các hạt hay vật chất khác của tế bào chất. Các giọt lipid lớn hoặc là không bào chứa các giọt lipid nhỏ hơn có thể tìm thấy ở nhiều nơi trong tế bào. Các thể cyst sinh sản vô tính có thể được tạo thành khi điều kiện sống trở nên khắc nghiệt, ví dụ môi trường bị khô hạn quá mức, hoặc bị pha loãng quá mức. Sinh sản hữu tính bằng đẳng giao (isogamy), với phương thức tiếp hợp giao tử giống như cách thức của nguyên sinh động vật (Chlamydomonas). Trong cùng một loài, các giao tử có cùng kích thước và đặc điểm cấu trúc giống như tế bào sinh dưỡng. Một số loài Dunaliella đồng tản, trong khi đó D. salina dị tản. Hợp tử thường có màu xanh hay màu đỏ và được bao bọc bởi một thành nhẵn và dày. Sau giai đoạn nghỉ, nhân của nó bắt đầu phân chia tạo thành nhiều hơn 32 tế bào, chúng sẽ được giải phóng khi thành của tế bào mẹ bị vỡ. Giảm phân xảy ra trong suốt quá trình nảy mầm của hợp tử.
Hình dạng tế bào có thể bị ảnh hưởng bởi mức độ thay đổi của điều kiện sinh trưởng. Những thay đổi rõ rệt có thể xảy ra giữa pha logarit và pha cân bằng. Nồng độ muối, cường độ ánh sáng và nhiệt độ sẽ có ảnh hưởng lên cấu trúc của thylacoit, pyrenoit và ER. Trước đây, Dunaliella và một số loài có roi không có thành tế bào được phân loại vào họ Polyblepharidaceae trong bộ Volvocales. Tuy nhiên sau này những nghiên cứu chi tiết hơn trên nhiều loài có roi màu xanh đã dẫn đến việc phân loại lại các chi này vào taxon khác. Dunaliella được phân thành một chi riêng của họ Chlorophyceae (Chi Dunaliellales). Mặc dù thiếu thành cứng, Dunaliella cũng mang nhiều đặc điểm chung với họ Chlamydomonadales [11].
Hình 1.1: Hình thái các loài tảo thuộc chi Dunaliella
1. D. acidophila; 2. D. flagellata; 3. D. lateralis; 4. D. obliqua; 5. D. paupera, 6. D. maritima, 7. D. polymorpha, 8. D. primolecta, 9. D. quartolecta, 10.
D. tertiolecta, 11. D. parva, 12. D.pseudosalina, 13. D. salina, 14. D. baas- beckingii, 15. D. bioculata, 16. D. carpatica, 17. D. gracili, 18. D. granulata, 19. D. media, 20. D minuta, 21. D. minutissima, 22. D. ruineniana, 23. D.terricola, 24. D. viridis, 25. D. asymmetrica, 26. D. jacobae, 27. D. peircei, 28. D. turcomanica.
Hình 1.2: Sự sinh trưởng của Dunaliella salina trong môi trường có nồng độ NaCl khác nhau. Loài tảo này có thể phát triển trong môi trường có
phổ muối rộng, từ 0.17 M đến 4M NaCl [24] 1.4.2. Điều hòa áp suất thẩm thấu và sản xuất glycerol
Hình 1.3: Hàm lượng glycerol nội bào có chức năng cân bằng với NaCl ngoại bào trong Dunaliella salina. Glycerol nội bào và hàm lượng chất diệp lục trong các tế bào đã được xác định tăng trong môi trường có nồng
độ muối chỉ định [24].
Chi Dunaliella bao gồm nhiều loài có khả năng sinh trưởng trong phổ muối rộng, từ 0.05 - 5.5M [11] nhưng sinh trưởng tối ưu khác nhau ở các loài. Theo Hadi et al (2008) sinh trưởng tối ưu của D. salina (chủng Iran) là 2M NaCl. Dunaliella là loài tảo chính của các hồ nước mặn. Nó có thể có mặt trong tất cả các môi trường
mặn tự nhiên. Khác với các loài tảo xanh khác, tế bào của chi Dunaliella không có thành tế bào cứng, nhưng có màng tế bào mỏng linh động có thể thích nghi nhanh với sự thay đổi của áp suất thẩm thấu bằng cách thay đổi thể tích tế bào [38]. Vì vậy, Dunaliella có thể tăng hoặc giảm 3 - 4 lần kích thước tế bào bằng cách co lại (shink) hoặc nở ra (swell). Tuy nhiên, những sự thay đổi lớn hơn sẽ dẫn tới vỡ tế bào (cell - bursting) trong quá trình hạ áp suất thẩm thấu, và ngược lại là co bất thuận nghịch dưới điều kiện tăng áp suất thẩm thấu.
Yếu tố cân bằng nội môi dưới điều kiện thay đổi của áp suất thẩm thấu là glycerol, bởi vì nồng độ nội môi của nó ở mức rất cao để đáp ứng với sự thay đổi này [24]. Khi tế bào Dunaliella sinh trưởng ở nồng độ muối cao, nồng độ glycerol có thể lên tới trên 50% đủ để đáp ứng với sự thay đổi của áp suất thẩm thấu. Glycerol được sản xuất trong điều kiện sốc muối (bằng cách chuyển từ môi trường chứa 1M NaCl sang 3M NaCl). Tuy nhiên, glycerol tích lũy trong Dunaliella để đáp ứng với stress môi trường có thể khác nhau ở các loài. Một vai trò khác của glycerol là “chất hòa tan thay thế” bảo vệ hoạt động của các enzyme.
Hình 1.4: Các phản ứng trong quá trình tổng hợp glycerol của Dunaliella
salina trong 1M NaCl và bị gây stress bằng cách chuyển đến 3M
NaCl. Thời gian được tính từ thời điểm chuyển sang nồng độ muối cao hơn [24]
Glycerol trong Dunaliella parva có thể tích lũy tối đa khoảng 55% khối lượng tế bào dưới điều kiện NaCl bão hòa [10]. Khi tế bào bị sốc muối trong một vài giây, nước đi vào hoặc đi ra làm thay đổi đáng kể thể tích tế bào. Sau đó, phụ thuộc vào chiều hướng và mức độ của shock muối và các điều kiện chuyển hóa của
tế bào, glycerol được tổng hợp hoặc loại trừ thông qua các con đường enzyme phụ thuộc nhiệt độ, đi kèm với việc trở lại hoặc đi ra của nước, vì vậy tế bào trở lại kích thước gần giống ban đầu. Glycerol được tạo thành trong Dunaliella theo 2 con đường: cố định CO2 bằng quang hợp hoặc thoái biến tinh bột.
Hình 1.5: Con đường sinh tổng hợp glycerol trong Dunaliellai [11]
Tuy nhiên, việc tổng hợp glycerol bằng con đường nào còn phụ thuộc vào cường độ ánh sáng, tích lũy của các hạt tinh bột, hay kích thước của các hạt muối
gây stress. Trong pha tối, Dunaliella sản xuất glycerol chủ yếu bằng thoái biến tinh bột, do đó khả năng phục hồi của tế bào phụ thuộc vào sự có mặt của các bể chứa hạt tinh bột. Tuy nhiên, sự thoái biến tinh bột cũng góp phần vào việc tăng tổng hợp glycerol đáp ứng với các sốc bằng tăng cường độ ánh sáng. Phức hợp tác động lẫn nhau giữa tổng hợp glycerol và thoái biến tinh bột có thể có nguyên nhân từ nhu cầu đường glucose cao cho quá trình tổng hợp glycerol, và từ việc ức chế sự quang hợp bằng quá trình tăng áp suất thẩm thấu. Sốc bằng giảm áp suất thẩm thấu cảm ứng
Dunaliella giảm thành phần glycerol và tăng thành phần tinh bột. Sự tổng hợp tinh bột có thể cũng bị ức chế mạnh bởi sốc giảm áp suất thẩm thấu.
1.4.3. β-caroten
β-caroten là các hợp chất béo vòng thơm, có 5 nhóm isoprene, và thuộc vào nhóm hợp chất carotenoid. Hợp chất này chỉ chứa hydro (H) và và oxy (O). β- caroten là sắc tố có nhiều trong thực vật và tảo. β-caroten phổ biến trong tự nhiên, có nhiều vai trò khác nhau bao gồm: hoạt tính tiền vitamin A, hấp thụ năng lượng ánh sáng, dập tắt các gốc tự do, hoạt tính chống oxi hóa, vận chuyển oxy, tạo nên màu sắc khác nhau của sinh vật. Công thức phân tử của β-caroten là C40H56, khối lượng phân tử 536,9, mười một liên kết đôi liên hợp, tinh thể mầu tím - đỏ điển hình và tạo thành dung dịch với dầu. Hấp thụ cực đại của β-caroten trong ete dầu là 453nm và 481nm. Thành phần β-caroten trong thực vật thay đổi từ 0.01- 10mg/100g. Thực vật giầu β-caroten nhất là các cây lá xanh như rau mùi tây, rau bina và bông cải xanh, các loại trái cây màu vàng cam như xoài, đào và một số loại rau khác như cà rốt, cà chua, bí ngô. Một vài vi sinh vật tích lũy β-carotene cao như các loại nấm mốc Phycomyces blakesleanus và nấm men Rhodotortila có thể tích lũy β-carotene từ 5 - 0,5 mg/g trọng lượng khô. Dunaliella đã được chứng minh là loài tảo có khả năng tích lũy carotene với lượng lớn trong các giọt dầu ở khoảng gian bào giữa các thylacoit trong lục lạp. Các chủng giàu β-caroten thường phân bố ở những nơi có chứa >10% muối, và chiếm ưu thế ở nơi có nồng độ muối bão hòa [37]. Màu đỏ cam của các hồ nước mặn dưới điều kiện chiếu sáng mạnh thường là màu beta carotene của Dunaliella. Trong điều kiện sinh trưởng bình thường (1-2M NaCl) D.salina thường có màu xanh, và chỉ chứa 0.3% β-caroten, tương tự như các
loài thực vật và tảo khác. Tuy nhiên, nếu bị sốc mạnh hàm lượng β-caroten được tích lũy có thể lên tới trên 10% khối lượng khô, là mức hàm lượng cao nhất so với bất kỳ loài tảo và thực vật nào đã được biết. Mức độ tổng hợp β-carotene còn phụ thuộc vào các thông số sinh trưởng sinh lý, cụ thể là cường độ ánh sáng, nồng độ muối, nhiệt độ và thiếu dinh dưỡng [28], [29]. Các stress môi trường càng mạnh càng làm chậm tốc độ tăng trưởng của tảo, và làm tăng hàm lượng beta carotene tích lũy. Tuy nhiên, nếu các stress này xảy ra cùng một lúc, sẽ làm giảm số lượng tế bào/đơn vị thể tích, ảnh hưởng đến sự tồn tại của tế bào. Vì vậy, theo một nhóm tác giả, việc điều chỉnh cường độ ánh sáng và độ mặn có thể là chiến lược tốt nhất để đạt được mức tích lũy beta carotene tối ưu [30]. Chủng D.salina của Iran có màu xanh khi sinh trưởng trong môi trường NaCl 1-2M, trong khi đó nó có mầu cam khi sinh trưởng trong môi trường NaCl 4M. Sự tích lũy carotene là nguyên nhân chính gây nên sự đổi màu từ mầu xanh sang màu cam của D.salina tại NaCl 4M.
Hình 1.6: Bốn loàiD. Parva, D. salina, D. viridis and D. pseudosalina sinh trưởng trong NaCl 4.0 M (A), Bể muối ở Gave-Khooni Salt Marsh, Iran có mặt D. salina màu đỏ cam (B), hình dạng của D. salina sinh trưởng trong NaCl 4 M (C) và hình dạng của D. salina sinh trưởng
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng tảo sử dụng trong nghiên cứu được thu thập từ các ruộng muối ở 2 huyện Ninh Diêm và Ninh Thủy thuộc tỉnh Khánh Hòa.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu 8/2012 đến tháng 6/2013 - Địa điểm: Trường Đại học Nha Trang
2.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu Môi trường F/2 Môi trường F/2 Thành phần Hàm lượng Sol 1 (100ml) ZnSO4 : 0.23(g/l) (NH4)6Mo7O24.4H2O 0.0529(g/l) CaCl2.6H2O 0.119 (g/l) CuSO4.5H2O 0.1 (g/l) Sol 2 (100ml) MnCl2.4H2O 0.178 (g/l) FeCl3.6H20 3.162(g/l) EDTA (292,25) 3.419 (g/l) Sol 3 (100ml) B12 50mg/l H 50mg/l Sol 5 (100ml) NaNO3 7.48g/l Sol 6(100ml) NaH2PO4.2H2O 0.566g/l
Môi trường Walne Thành phần Hàm lượng Dung dịch vi lượng (50ml) ZnCl2 1.05g/l CaCl2.6H2O 1g/l (NH4)6Mo7O24.4H2O 0.45g/l CuSO4.5H2O 1g/l 1ml Dung dịch Vitamin (50ml) Vitamin B12 5mg/l Vitamin B1 5mg/l Vitamin H 1mg 0.1ml
Dung dịch đa lượng (100ml)
FeCl3.6H2O 0.13g/l MnCl2.6H2O 0.036g/l H3BO3 3.36g/l EDTA (Na2) 4.5g/l NaH2PO4.2H2O 2g/l NaNO3 10g/l 1ml
Môi trường Jonhson Thành phần Hàm lượng Dung dịch A MgCl2.6H2O 15g MgSO4.7H2O 5g KCl 2g KNO3 10g KH2PO4 0.35g Dung dịch B CaCl2.2H2O 2g Dung dịch C NaHCO3 4.3g Dung dịch D Na2EDTA 1.89g FeCl6.6H2O 2.44g Dung dịch E CuSO4.5H2O 6g ZnCl2 4.1g MnCl2 4.1g H3BO3 3.05g (NH4)6Mo7O24.4H2O 1.9g * Thiết bị
Box cấy vô trùng Nồi khử trùng Máy li tâm
Kính hiển vi có gắn màn hình máy tính Tủ sấy, tủ lạnh 22oC, 2-4oC
Máy đo cường độ ánh sáng Máy sục khí, dây dẫn khí
Máy đo UV_Vis Khúc xạ kế đo độ mặn Máy đo pH
* Dụng cụ nuôi tảo
Các loại bình thủy tinh, bình serum, màng lọc, ống nghiệm, đĩa peptri giá để ống nghiệm, đèn cồn và các dụng cụ khác…
* Nước biển tự nhiên dùng để nuôi tảo: Nước biển này đã được lọc bằng cát. Sau đó để lắng và tiến hành khử trùng bằng chlorine 200ppm.
* Nước cất 1 lần
2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phân lập tảo Dunaliella sp 2.4.1. Phân lập tảo Dunaliella sp
Việc phân lập tảo được làm qua các bước sau:
Lấy mẫu ở các ruộng muối
Kiểm tra các điều kiện( nhiệt độ, pH, độ mặn) Lọc mẫu
Soi mẫu để kiểm tra sự có mặt của Dunaliella
Nuôi tăng sinh bằng môi trường J/l 8,8%
Soi mẫu để quan sát mức độ phát triển trong các quần thể Dunaliella
Pha loãng mẫu theo các nồng độ khác nhau hoặc cấy trên môi trường thạch Phân lập được chủng tảo Dunaliella sp thuần
Thuyết minh quy trình
Thu mẫu là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu bất kì vi sinh vật nào. Mẫu được thu từ các ruộng muối của các xã Ninh Hải, Ninh Thủy của huyện Ninh Hòa tỉnh Khánh Hòa được đựng trong các chai nhựa. Tại địa điểm thu mẫu tiến
hành kiểm tra các điều kiện như pH, độ mặn, ánh sáng. Ta có thể sử dụng một số dụng cụ sau để kiểm tra các thông số trên như:
Sử dụng nhiệt kế thủy ngân chia vạch (0 – 100oC) để xác định nhiệt độ. Sử dụng giấy quỳ tím để đo pH: Sự thay đổi màu của giấy quỳ cho ta biết pH khi so sánh với thang màu chuẩn pH.
Sử dụng khúc xạ kế để đo độ mặn của nguồn nước: Nhỏ 1-2 giọt nước trong mẫu nước cần xác định độ mặn lên mặt kính, rồi đưa kính ra nơi sáng quan sát, đọc