Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của Chitosan từ xương mực đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối ướt trên cà chua nguyên liệu sau thu hoạch

 Cơ chế kháng khuẩn của chitosan Khả năng kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nó đã được nghiên cứu bởi một số tác giả, trong đó cơ chế kháng khuẩn.. MIC của Chitosan và dẫn xuất đ



PHẠM VĂN TRUNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN TỪ XƯƠNG MỰC ĐỐI VỚI VI KHUẨN

ERWINIA SP GÂY BỆNH THỐI ƯỚT TRÊN CÀ CHUA

NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN:

PGS.TS TRANG SĨ TRUNG ThS NGUYỄN CÔNG MINH

Nha Trang, tháng 06 năm 2013

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt đợt thực tập tốt nghiệp này, tôi đã nhận được nhiều sự ủng

hộ, giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn:

Gia đình vì đã động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong suốt những năm con đi học

Ban Giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm và các thầy cô giáo đã tận tình dạy dỗ, dìu dắt và truyền đạt cho chúng em nhiều kiến thức bổ ích

Thầy Trang Sĩ Trung, thầy Nguyễn Công Minh, cô Phạm Thị Đan Phượng, thầy Hoàng Ngọc Cương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

Em xin cảm ơn đến Quí thầy cô giáo phụ trách phòng thí nghiệm – Trung tâm thí nghiệm thực hành đã tạo điều kiện cho e về hóa chất và trang thiết bị thí nghiệm trong thời gian thực hiện đề tài

Các bạn lớp 51CBTS cùng các bạn làm tại phòng chế biến 3, phòng công nghệ sinh học đã động viên, hỗ trợ tôi trong thời gian làm đề tài

Khánh Hòa, tháng 6 năm 2013

Phạm Văn Trung

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU vii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về chitosan từ xương mực 1

1.1.1 Xương mực 1

1.1.2 Chitosan 3

1.2 Tổng quan về cà chua, bệnh thối ướt ở cà chua 16

1.2.1 Giới thiệu về cà chua 16

1.2.2 Thành phần hóa học của cà chua 17

1.2.3 Vai trò của cà chua 18

1.2.4 Bệnh thối ướt ở cà chua 19

1.3 Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia sp 20

1.3.1 Phân loại: 20

1.3.2 Đặc điểm 20

1.3.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn Erwinia sp 21

1.3.4 Ứng dụng của chitosan trong bảo quản cà chua 22

1.3.5 Một số nghiên cứu của chitosan đối với vi khuẩn Erwinia sp 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Chitosan 24

2.1.2 Vi khuẩn Erwinia sp 24

2.1.3 Môi trường nuôi cấy PGA 25

2.1.4 Acid Acetic 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 26

2.2.2 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và độ deacetyl của chitosan đến khả năng kháng Erwinia sp 27

2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian bảo quản của dung dịch chitosan đến khả năng kháng Erwinia sp 30

2.3 Phương pháp phân tích 31

2.3.1 Xác định độ nhớt biểu kiến của chitosan được đo bằng nhớt kế Rôto Brookfield 31

2.3.2 Xác định hàm lượng ẩm và khoáng theo phương pháp của AOAC 31

2.3.3 Phương pháp xác định khối lượng phân tử 31

2.3.4 Xác định độ deacetyl theo phương pháp quang phổ 31

2.3.5 Phương pháp xác định trọng lượng phẩn tử trung bình 31

2.3.6 Xác định khả năng kháng khuẩn của chitosan bằng phương pháp đục lổ 32

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Xác định các tính chất ban đầu của chitosan từ xương mực 33

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và độ deacetyl của Chitosan đến khả năng kháng Erwinia sp 34

3.4 Kết quả nghiên cứu xác định độ bền về khả năng kháng Erwinia sp của chitosan khi bảo quản chitosan theo thời gian ở nhiệt độ lạnh (tº< 4ºC) 39

3.5 Kết quả nghiên cứu xác định độ bền về khả năng kháng Erwinia sp của chitosan khi bảo quản theo thời gian ở nhiệt độ thường (t º phòng) 44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 49

I Kết luận 49

II Đề xuất ý kiến 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 56

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 MIC của Chitosan và dẫn xuất đối với một số vi khuẩn 8

Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu ban đầu của chitosan từ xương mực 33

Bảng 3.2 Kết quả đo độ nhớt của chitosan bảo quản lạnh theo thời gian 41

Bảng 3.3 Kết quả đo độ nhớt của chitosan bảo quản nhiệt độ thường theo thời gian 46

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Xương mực 1

Hình 1.2 Công thức cấu tạo Chitosan 3

Hình 2.1 Chitosan dạng hạt 24

Hình 2.2 Vi khuẩn Erwinia sp .25

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 26

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ và độ deacetyl của chitosan đến khả năng kháng Erwinia sp 27

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian bảo quản của dung dịch chitosan đến khả năng kháng Erwinia sp 30

Hình 3.1 Đường kính vòng kháng khuẩn của chitosan C và chitosan C1 35

Hình 3.2 Hình ảnh kháng Erwinia sp của dung dịch CTS C và CTS C1 38

Hình 3.3 Sự thay đổi về độ nhớt và khả năng kháng Erwinia sp của chitosan C và chitosan C1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ lạnh 40

Hình 3.4 Kết quả kháng Erwinia sp của CTS C và CTS C1 bảo quản theo thời gian ở nhiệt độ lạnh (tº < 4ºC) 43

Hình 3.5 Sự thay đổi về độ nhớt và khả năng kháng Erwinia sp của chitosan C và chitosan C1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ thường (tº phòng) 44

Hình 3.6 Kết quả kháng Erwinia sp của CTS C và CTS C1 bảo quản theo thời gian ở nhiệt độ thường (tº phòng) 48

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một quốc gia ven biển Đông Nam Á, có 3260 km bờ biển từ Móng Cái đến Hà Tiên và là vùng biển nhiệt đới nên Việt Nam có một tiềm năng phong phú về nguồn lợi thủy sản

Là một trong những ngành kinh tế trọng tâm của nền kinh tế quốc dân, ngành thủy sản đã góp một phần không nhỏ vào nền kinh tế Cùng với nhịp độ phát triển của nền kinh tế trong và ngoài nước, ngành thủy sản trong những năm gần đây đã đạt được những thành tựu đáng kể về nuôi trồng, chế biến thủy sản cũng như xuất nhập khẩu Nhưng đi cùng với sự phát triển của ngành, vấn đề phế liệu trong chế biến thủy sản là một điểm hạn chế do lượng phế liệu thải ra từ công nghiệp chế biến thủy sản hàng năm là rất lớn Nếu không có biện pháp xử lý thích hợp sẽ gây ra ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Vì vậy những yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh mà chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ, xương mực đang ngày càng trở nên cấp bách Đây là nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất chitin -chitosan Do vậy việc nghiên cứu và phát triển sản xuất chitin-chitosan là rất quan trọng để nâng cao giá trị sử dụng phế liệu này và làm sạch môi trường

Chitosan là một polysaccharid có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua, ghẹ, xương mực Đặc tính của chitosan là không tan trong nước, có thể hòa tan trong acid nhẹ và có khả năng kháng khuẩn cao Chitosan đang được các nhà công nghệ chế biến nghiên cứu sử dụng trong nhiều lĩnh vực công nghệ Trong công nghệ sau thu hoạch, chitosan được sử dụng làm màng bao bên ngoài của các các loại trái cây như xoài, chôm chôm,… để hạn chế sự thoát hơi nước và kháng khuẩn Vì thế khi nhúng chitosan bên ngoài trái cây sẽ tạo cho trái cây có cảm quan đẹp bóng, giúp kéo dài thời gian bảo quản trái cây

Trong lĩnh vực chế biến thủy sản, chitosan được dùng để xử lý thịt, cá, tôm nhằm hạn chế sự hao hụt khối lượng trong quá trình cấp đông cũng như hạn chế sự phát triển của VSV gây hư hỏng sản phẩm, không những thế thủy sản sẽ có chất lượng cảm quan tốt hơn

Hiện nay, chitosan đã không còn là nguồn vật liệu quá xa lạ với chúng ta Chitosan được ứng dụng nhiều trong cuộc sống nhờ khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa của nó Với tình hình hiện nay, nhu cầu thực phẩm tươi sạch là rất thiết yếu, các hóa chất bảo quản độc hại như hàn the, urea… bị cấm sử dụng trong thực phẩm thì chitosan đã mở ra một hướng đi mới cho ngành công nghệ thực phẩm Đã có rất nhiều nghiên cứu về chitosan từ nguồn nguyên liệu là vỏ tôm, còn chitosan được sản xuất từ xương mực thì chưa có nhiều Do đó, tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu khả

năng kháng khuẩn của chitosan từ xương mực đối với vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh

thối ướt trên cà chua nguyên liệu sau thu hoạch ” nhằm đánh giá khả năng sử dụng

loại chitosan này trong việc ức chế vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh trên cà chua cũng

như bảo quản cà chua sau thu hoạch

Mục tiêu nghiên cứu:

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan

từ xương mực đối với vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối ướt trên cà chua nguyên

liệu sau thu hoạch

Nội dung nghiên cứu:

- Xác định ảnh hưởng của nồng độ dung dịch chitosan đến khả năng kháng

sử dụng để chiết xuất chitin - khử khoáng và deproteinization - nhưng do hàm lượng thấp của các hợp chất vô cơ điều trị kiềm hai bước là đủ để sản xuất β-chitin có hàm lượng thấp của tro (≤ 0,7 %)

Thật vậy, các hàm lượng thấp của tro và kim loại, chẳng hạn như Ca (≤ 10,4 ppm), Mg (≤ 2,5 ppm), Mn (≤ 3,1 ppm) và Fe (≤ 1,8 ppm), thấp hơn so với báo cáo trong hầu hết các giấy tờ tìm thấy trong các tài liệu Ngoài ra, các β-chitin chiết xuất bằng cách sử dụng chỉ điều trị kiềm là acetyl hóa hơn so với các mẫu khác chuẩn bị trong công tác này Không phụ thuộc vào điều trị được sử dụng để tách các β-chitin

từ xương mực, quang phổ hồng ngoại và hình ảnh nhiễu xạ tia X trình bày chỉ khác biệt nhỏ, tuy nhiên họ đã phân biệt rõ ràng từ thương mại α-chitin

Hình 1.1 Xương mực

Chitin là một polymer sinh học tuyến tính bởi 2 glucopyranose đơn vị liên kết bởi β (1 → 4) glyco-sidic, có chuỗi tương tác của nhiều liên kết hydro liên quan đến hydroxyl, amin và nhóm cacbonyl dẫn đến việc của mình hình thành các sợi nhỏ [32] Nó là một polysaccharide cấu trúc trong một

acetamit-2-deoxi-D-số loại nấm, động vật chân đốt và tuyến trùng nơi mà có một loại vật liệu bảo vệ cho các sinh vật Chitin thường xảy ra liên kết với protein, polysaccharides khác, các hợp chất khoáng sản, thường là canxi và magie cacbonat, và sắc tố tỷ lệ khác nhau tùy thuộc vào các con vật [47] Ba đa hình khác nhau của chitin được tìm thấy trong tự nhiên, α-chitin là cấu trúc phổ biến nhất và tương ứng với một tế bào đầm chặt thoi hình thành xen kẽ bởi các chuỗi song song và phản song song [39] β-chitin thông qua một tế bào đơn tà thống nhất nơi các chuỗi polysaccharide được xử

lý song song [21] và mặc dù cấu trúc của γ-chitin đã không được xác định hoàn toàn, một sự sắp xếp của hai song song và một tấm phản song song đã được đề xuất [49] Tuy nhiên, nó cũng đã được gợi ý rằng γ-chitin có thể được giải thích hơn là một biến dạng đơn giản của α và β các cấu trúc hơn là đa hình khác nhau [47] Chitin và các dẫn xuất của nó, chủ yếu là chitosan, đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu và các ngành công nghiệp trong 30 năm qua để sở hữu vật lý-hóa học của nó Các polyme hiển thị hoạt động kháng khuẩn biocompatibility, phân hủy sinh học và nó cũng tương tác mạnh với thuốc trừ sâu và các ion kim loại trong dung dịch nước Solu chức [31], [42] Do đó, họ có tiềm năng hữu ích cho các ứng dụng trong y học, dược phẩm và nông nghiệp, và cũng như các tài liệu sinh học hấp thụ cho sự hấp thu của các ion kim loại trong nước thải cũng như cho các ứng dụng phân tích [16], [45]

Phế thải của ngành công nghiệp hải sản, chủ yếu là vỏ cua và tôm, là nguyên liệu quan trọng nhất để tách chitin Thật vậy, một lượng lớn vỏ cua và tôm được cấp

từ các ngành công nghiệp thủy sản và chúng được sử dụng để trích xuất các chitin, các đa hình phổ biến nhất của chitin thương mại Tuy nhiên, do cấu trúc nhỏ gọn của nó, α- chitin là không hòa tan trong hầu hết các dung môi và nó chỉ hạn chế lên trong các giải pháp độc hại có tính kiềm [47] Do đó, thay đổi hóa học của

α-chitin, bao gồm deacetyl xảy ra của nó để sản xuất chitosan, phải được thực hiện trong các hệ thống không đồng nhất mang đến cho các phản ứng không đầy đủ và sản phẩm không đồng nhất Mặt khác, β-chitin trình bày một cấu trúc mở hơn và nó gần đây đã thu hút được sự quan tâm ngày càng tăng về việc cho phép một khả năng tiếp cận tốt hơn với thuốc thử [18], [31] Do đó, β-chitin là nhiều hơn phản ứng và thuận lợi như một nguyên liệu ban đầu để chuẩn bị chitin thay thế hoàn toàn một cách đơn giản [32] Xương mực là những nguồn giàu nhất nguồn gốc của β-chitin, nhưng hiện tại họ đang được coi là một từ chối không hấp dẫn từ việc xử lý mực trong các ngành công nghiệp thủy sản

1.1.2 Chitosan

Chitosan được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1859 bởi Rouget [56]

1.1.2.1 Cấu trúc phân tử của chitosan

Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl ra khỏi chitin nên chitosan chứa nhiều nhóm amino trong phân tử

Hình 1.2 Công thức cấu tạo Chitosan [56]

1.1.2.2 Tính chất của chitosan

+ Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ ở dạng bột có màu trắng ngà, ở dạng vảy

có màu trắng trong hay màu hơi vàng Chitosan thương mại ít nhất phải có mức DD (degree of deacetylation) hơn 70% và trọng lượng phân tử gần 100.000 – 1200.000 Dalton

+ Chitosan có tính kiềm nhẹ, không hòa tan trong nước, trong dung dịch kiềm nhưng hòa tan trong dung dịch acid actic loãng sẽ tạo thành dung dịch keo dương, nhờ đó mà keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như: 3

Pb, Hg,…

+ Chitosan phản ứng với hỗn hợp hai acid đậm đặc là chlosylfomic và sunfuric theo tỷ lệ 2:1 ở 20-40ºC trong 2 giờ tạo muối chitosan-6- sunfate khó tan Đặc biệt chất này không tan trong eteretylic

+ Chitosan tác dụng với iot trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan

+ Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một polycationic (pH<6,5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, aminopoly saccharide ( alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (-NH2)

+ Chitosan có tính kháng nấm, kháng khuẩn cao [7], [12], [26]

+ Trên mỗi mắt xích của phân tử chitosan có ba nhóm chức, các nhóm chức này có khả năng kết hợp với chất khác tạo ra các dẫn xuất có lợi khác nhau của chitosan (O-acetylchitosan, N- acetylchitosan, N-phatylchitosan)

+ Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể [2], [12]

1.1.2.3 Đặc tính và cơ chế kháng khuẩn của chitosan

 Đặc tính kháng khuẩn của chitosan

Sau khi Allan, Kendra và Uchida phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của Chitosan và muối của nó, nhiều nhà nghiên cứu đã tiếp tục đi sâu vào khía cạnh này Nhiều công trình đã được công bố và đã tạo ra nhiều cơ sở cho nhiều ứng dụng trong y học và nhiều lĩnh vực khác Tại Việt Nam, hiện nay chưa có nghiên cứu chính thức nào hoặc có rất ít các công trình đề cập đến vấn đề này Chitosan có khả năng ức chế nhiều loại vi sinh vật khác nhau Tùy vào đặc tính của chitosan, loại vi khuẩn và điều kiện nghiên cứu khác nhau, các tác giả đã cho những kết luận khác nhau:

Nghiên cứu của Wang (1992), dung dịch Chitosan (pH 5,5 và ) ở nồng độ

1-1,5% thì ức chế hoàn toàn S.aureus sau hai ngày Chang cũng nhận thấy rằng nồng

độ lớn hơn 0,005% có khả năng ức chế hoàn toàn S.aureus Điều này cũng phù hợp

với kết quả có được của Darmadji và Izumimoto trong nghiên cứu về tác dụng của chitosan trong bảo quản thịt Nhiều nghiên cứu trên một số chủng vi khuẩn khác

cũng cho kết quả tương tự Simpson và cộng sự cho rằng Bacillus cereus bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ 0,02% trong khi Escherichia coli và roteus vulgaris phát triển

yếu ở nồng độ 0,005% và bị ứ chế hoàn toàn ở nồng độ lớn hơn bằng 0,0075%

nhưng Chang lại cho rằng Bacillus cereus chỉ cần 0,005% là có thể bị ức chế hoàn

toàn trong khi Darmadji và Izumimoto lại kết luận nồng độ lớn hơn bằng 0,1% cho

sự ức chế E.coli Một nghiên cứu khác tại trường Đại học Thủy sản Nha Trang (2005) cho thấy ở các nồng độ từ 0,8-2,4% hiệu quả ức chế E.coli khá cao (≥ 90%)

và chỉ cần chitosan nồng độ 0,08% là ức chế hoàn toàn V.parahaemolyticus sau 60

phút còn ở nồng độ 0,8% thì chỉ cần 5 phút Bên cạnh đó, các dẫn xuất của chitosan

cũng đã được đề cập đến nhiều trong nghiên cứu Sự phát triển của Aspergillus niger bị ức chế bởi Chitosan nồng độ 0,1-5mg/ml ở pH =5,4 nhưng nồng độ nhỏ

hơn 2mg/ml lại không hiệu quả với sự phát triển của mốc và sự sản sinh aflatoxin

và Aspergillus parasiticus Trong nghiên cứu khác, Cuera phát hiện ra cacboxymethyl Chitosan có khả năng giảm sự sản sinh aflatoxin của Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus đến 90% trong khi sự phát triển của nấm mốc

N-giảm hơn 50% Bảo quản táo bằng cách nhúng trong chitosan, Sarage đã kết luận rằng chitosan có vai trò lớn trong việc giảm sự tác động của nấm mốc và kéo dài thời gian bảo quản táo khoảng 12 tuần Nghiên cứu của Byung và cộng sự cho thấy

Cadida albicans bị ức chế lần lượt là 85, 82, 95 và 75% bởi chitosan (D70 và D90)

và các dẫn xuất là mono (2-methacryloyl) oxyethyl axit phosphat MAP) và muối vinylsulphuric axit sodium (Chitosan-g-VSS), còn đối với

(Chitosan-g-Trychophyton violeum lần lượt la 55%, 70% và 90% (nghiên cứu được thực hiện ở

chitosan môi trường pH =5,75) Như vậy, dù có khác nhau giữa kết quả nghiên cứu

của các tác giả nhưng nhìn chung các thí nghiệm đều cho thấy chitosan và dẫn xuất của nó thể hiện đặc tính kháng khuẩn khá cao đối với vi khuẩn và nấm mốc [7], [9]

 Cơ chế kháng khuẩn của chitosan

Khả năng kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nó đã được nghiên cứu bởi một số tác giả, trong đó cơ chế kháng khuẩn Mặc dù chưa có một giải thích đầy

đủ về khả năng kháng khuẩn đối với tất cả các đối tượng vi sinh vật, nhưng hầu hết đều cho rằng khả năng kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ chitosan trên bề mặt tế bào Trong đó, chitosan hấp phụ lên bề mặt vi khuẩn Gram (–) tốt hơn vi khuẩn Gram (+) Một số cơ chế đã được giải thích như sau:

- Nhờ tác dụng của những nhóm NH3trong chitosan lên các vị trí mang điện

âm ở trên màng tế bào vi sinh vật, dẫn tới sự thay đổi tính thấm của màng tế bào Quá trình trao đổi chất qua màng tế bào bị ảnh hưởng Lúc này, vi sinh vật không thể nhận các chất dinh dưỡng cơ bản như glucose cho sự phát triển bình thường dẫn đến mất cân bằng giữa bên trong và bên ngoài màng tế bào Cuối cùng dẫn đến sự chết của tế bào Theo giải thích của một số tác giả thì chính sự tác động giữa polycation chitosan sẽ liên kết với polyme mang tính axit (polyanion) trên bề mặt tế bào vi sinh vật tạo nên polyelectrolic đã gây khó khăn trong quá trình trao đổi chất

- Chitosan có thể cản trở và làm mất cân bằng sự phát triển của vi sinh vật do

có khả năng lấy đi các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong thành phần enzyme như 2

Cu , 2

Co , 2

Cd … của tế bào vi sinh vật do sự tạo phức với nhóm

NH2 có trong phân tử chitosan đồng thời các nhóm này có thể tác dụng với các nhóm anion bề mặt thành tế bào Như vậy vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển do sự mất cân bằng liên quan đến các ion quan trọng

- Ở nồng độ cao trên bề mặt vi khuẩn có thể bị bao vây gây nên sự bất động các tế bào và giảm sự phát triển của chúng Chitosan mạch ngắn hoặc chitosan oligome xâm nhập vào nội bào gây cản trở quá trình tổng hợp protein và các hợp chất nội bào khác

- Điện tích dương của những nhóm 3

NH của glucosamine monomer ở pH < 6,3 tác động lên các điện tích âm ở thành tế bào của vi khuẩn, dẫn đến sự rò rỉ các

phần tử ở bên trong màng tế bào Đồng thời gây ra sự tương tác giữa sản phẩm của quá trình thủy phân có khả năng khuếch tán bên trong tế bào vi sinh vật gây ức chế mARN và sự tổng hợp protein tế bào

- Chitosan có khả năng phá hủy màng tế bào thông qua tương tác của nhóm

3

NH với những nhóm phosphoryl của thành phần phospholipid của màng tế bào vi

khuẩn Quan sát dưới kính hiển vi sự phá hủy tế bào S.aureus, sự phân chia của tế

bào bị rối loạn, sự tạo thành tế bào không theo quy luật: Tế bào tạo thành không có màng hoặc màng tế bào tạo thành rất mỏng gây nên sự rò rỉ các hợp chất nội bào [5], [6], [7]

1.1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng khuẩn của chitosan

Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào một vài yếu tố như loại chitosan sử dụng (độ deacetyl, khối lượng phân tử ), pH môi trường, nhiệt độ, sự có mặt của một số thành phần thực phẩm

 Ảnh hưởng của pH môi trường:

pH có ảnh hưởng đến sự ion hóa của nhóm –NH2 trên mạch phân tử chitosan

pH càng cao mức độ ion hóa của nhóm –NH2 càng thấp làm giảm khả năng kháng khuẩn của chitosan Nghiên cứu của Byung và cộng sự trên hai loại chitosan và hai dẫn xuất

cho thấy Cadida albicans càng ít bị ức chế khi môi trường pH trở nên kiềm tính,

hiệu quả ức khuẩn cao nhất trong khoảng pH= (5-5,57)

 Ảnh hưởng bởi các loại vi khuẩn:

Joen (2001) cho rằng khả năng ức khuẩn của chitosan 0,1% đối với Gram(+) hiệu quả hơn so với Gram(–) Một vài tác giả khác cho rằng chitosan hấp phụ lên bề mặt vi khuẩn Gram(–) tốt hơn vi khuẩn Gram(+), điều này có thể phù hợp với

nghiên cứu của Lê Văn Khẩn trên Escherichia coli và V.parahaemolyticus Theo

Chen và cộng sự (2001), nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan (DD69) và các dẫn xuất đối với một số vi khuẩn như sau [7], [9]:

Bảng 1.1 MIC của Chitosan và dẫn xuất đối với một số vi khuẩn

MIC (ppm)

 Ảnh hưởng bởi trọng lượng phân tử hay độ nhớt của chitosan

Thí nghiệm kiểm tra khả năng kháng khuẩn của 6 loại chitosan và 6 loại chitosan oligme với Mw khác nhau đã được thực hiện trên 4 loại vi khuẩn Gram(–)

và 7 loại Gram (+) cho thấy chitosan thể hiện đặc tính kháng khuẩn hiệu quả hơn chitosan oligome Cho và cộng sự (1998) cho rằng khả năng kháng khuẩn của

chitosan đối với Escherichia coli và Bacillus spp tăng cùng với sự giảm độ nhớt

chitosan từ 1000 đến 10 cp Một nghiên cứu khác đã kết luận sự phát triển của

Escherichia coli và Bacillus spp bị ức chế hiệu quả bởi chitosan (Mw 746 và 470kDa) hơn loại chitosan (Mw 1671 hay 1106 kDa) Tuy nhiên sự giảm trọng lượng hơn nữa lại giảm hoạt tính kháng khuẩn của chitosan đối với 2 loại vi khuẩn

này Đối với S.typhimurium, Wang (1992) kết luận chitosan với Mw 1106 và 224

kDa thể hiện yếu hoặc không thể hiện tính kháng khuẩn (Mw 28kDa) ở nồng độ 0,5% [7]

Chitosan oligome cũng như chitosan thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của nhiều nấm mốc và vi khuẩn và đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh Hinaro và Nagao

đã nghiên cứu về mối quan hệ giữa mức độ polyme hóa (DP) của chitosan với hiệu quả kháng khuẩn của chitosan Nghiên cứu kết luận rằng chitosan oligome (DP 2-8), như chitosan trọng lượng phân tử thấp, thể hiện khả năng ức chế hiệu quả hơn

chitosan phân tử lượng cao đối với hầu hết vi khuẩn gây bệnh như fusarium oxyporum, Phomopsis fukusi, Alternaria alternata và nhiều chủng khác Kendra

cũng đã giải thích rằng sự hiện diện của một số chitosan oligome có hoạt tính sinh học trên đậu Hà Lan đã hạn chế sự phát triển của nấm mốc [7]

Trong một nghiên cứu khác về ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến độ nhớt

và khả năng kháng khuẩn của chitosan trên một số chủng vi khuẩn, kết quả cho thấy

độ nhớt càng giảm thì hoạt tính kháng Listeria monocytogenes và Salmonella entreritidis càng cao nhưng với E.coli và S.aureus thì ngược lại

 Ảnh hưởng bởi độ deacetyl của chitosan:

DD của chitosan thể hiện hàm lượng –NH2 trong phân tử chitosan Các thí nghiệm đếu chứng tỏ chitosan với độ deacetyl cao thể diện tính kháng khuẩn và khả năng làm sạch nước càng hiệu quả Điều này có thể giải thích là do sự tăng lên về khả năng ion hóa tạo phức của chitosan

Liu, 2001 nghiên cứu ảnh hưởng của DD (74 – 96)% đến khả năng kháng khuẩn Ông cũng cho rằng DD tăng thì khả năng kháng khuẩn tăng Do mật độ nhóm –NH2 tăng sẽ làm tăng nồng độ nhóm -NH3, các nhóm -NH3 liên kết với các nhóm chức mang điện tích âm trên bề mặt tế bào vi sinh vật, từ đó ức chế khả năng phát triển của vi sinh vật [54]

 Ảnh hưởng bởi nồng độ chitosan:

Nồng độ chitosan càng cao khả năng ức khuẩn sẽ tăng Tuy nhiên nồng độ chitosan hợp lý sẽ nâng cao hiệu quả sử dụng chitosan

 Ảnh hưởng bởi các tác nhân khác:

Dung môi hòa tan chitosan và các hợp chất bổ sung có thể tăng cường hiệu quả

ức khuẩn của chitosan Thí nghiệm của Uchida (1989) cho thấy heptose tăng cường, trong khi triose có liên quan đến sự mất hoạt tính kháng khuẩn của chitosan Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy làm tăng kháng khuẩn của dung dịch của chitosan nếu dùng các dung môi là acid citric, lactic và acetic Nghiên cứu của Matsuhashi

và Kume cho thấy chitosan chiếu xạ có khả năng ức chế cao nhất đối với sự phát

triển của E.coli

Một số nghiên cứu khác đã chứng tỏ khả năng kháng vi sinh vật tăng lên khi

sử dụng thêm phụ liệu tạo dẻo cho màng chitosan là Sorbitol trong bao gói thịt bò

Tỷ lệ vi sinh vật tổng số giảm so với mẫu đối chứng là 73,86%, so với mẫu ban đầu

là 77% trong khi đó khả năng làm giảm vi sinh vật tổng số lại giảm đi cùng phụ liệu tạo dẻo là glycerin Ngoài ra hiệu quả kháng khuẩn của chitosan còn phụ thuộc vào

số lượng vi sinh vật trong thực phẩm và thời kì sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật [6], [7], [10]

1.1.2.5 Ứng dụng của chitosan

Do tính chất không tan trong nước mà chitin ít được sử dụng trực tiếp Nhưng

từ nó trải qua nhiều giai đoạn xử lý hóa chất có thể điều chế dẫn xuất như Glucosamine, Chitosan… thì nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực

 Trong nông nghiệp

Chitosan được sử dụng để bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng tăng cường khả năng nảy mầm của hạt Ngoài ra chitosan còn được dùng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống bệnh đạ ôn, khô vằn cho lúa

Ngày nay, Chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cua, cá để kích thích sinh trưởng và làm thức ăn tăng trưởng cho gà, không độc hại Người ta ít sử dụng Chitin làm phụ gia thực phẩm vì Chitin không hòa tan trong nước, các dung dịch acid loãng hay kiềm Hơn nữa Chitin có tác dụng kháng khuẩn

yếu hơn Chitosan, nó không có tác dụng kháng nấm như Chitosan (Chitosan có cấu trúc giống như polyamin, đó là các polymer có tính kháng nấm đặc hiệu) [12]

 Trong y học

Đây là những ứng dụng quan trọng nhất, mang lại hiệu quả kinh tế cao của chitosan, đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm Do khả năng kháng khuẩn và tạo màng nên chitosan được ứng dụng phối hợp với một số thành phần phụ liệu khác để tạo ra da nhân tạo, màng sinh học, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép chống nhiễm khuẩn và cầm máu

Chitosan dùng làm hoạt chất chính để chữa bệnh ung thư: thuốc điều trị liền vết thương, vết phỏng, vết mổ vô trùng, thuốc bổ dưỡng cơ thể: Hạ lipid và cholesterol trong máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, tiểu đường, xưng khớp, viêm khớp, viêm xương, loãng xương, chống đông tụ máu, kháng nấm, kháng khuẩn, điều trị suy giảm miễn dịch, có khả năng hạn chế sự phát triển của tế bào u, tế bào ung thư và chống HIV

Ngoài ra, chitosan còn được dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm: Tá dược độn, tá dược dính, tá dược dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang mềm, nang cứng… dùng làm chất mang sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polymer có tác dụng chậm kéo dài [10]

 Trong công nghiệp

Các kỹ nghệ làm giấy, chế biến gỗ, điện tử, mực in, phim ảnh: Chitosan làm phụ gia để tăng cường chất lượng sản phẩm

Trong công nghiệp giấy, do cấu trúc tương tự cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy Chitosan làm tăng độ bền, dai của giấy, đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn [12]

Trong công nghiệp dệt, dung dịch chitosan có thể thay hồ tinh bột để hồ vải

Nó có tác dụng làm sợi tơ bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được acid và kiềm nhẹ Chitosan có thể kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm, sản xuất vải cold [12]

Trong hóa mỹ phẩm: Chitosan được sử dụng để sản xuất kem giữ ẩm chống khô da, làm mềm da do tính chất của chitosan là có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm NH4 Các nhóm này liên kết với tế bào sừng hóa của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng

da ngăn ngừa tia cực tím [12]

Trong công nghiệp xử lý nước, nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng kết dính tốt với các ion kim loại như: 2

Pb , Hg,…

do đó chitosan được sử dụng để tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm [12]

Trong công nghiệp thực phẩm:

Do bản chất là một hợp chất polymer tự nhiên không độc và rất an toàn đối với thực phẩm với những tính chất khá đặc trưng như khả năng kháng khuẩn, chống ẩm, tạo màng, có khả năng hấp phụ màu mà không hấp phụ mùi, hấp phụ một số kim loại nặng,… nên chitosan được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực công nghệ sản xuất

và bảo quản thực phẩm [11] Trong đó, nhiều kết quả đã được công bố trên thế giới

về khả năng kết hợp của chitosan với các loại vật liệu tạo màng khác nhau để tạo ra các màng bao cũng như khả năng kéo dài thời gian bảo quản của nhiều đối tượng rau quả, thịt, nước quả Chitosan được dùng để lọc các loại nước quả ép, bia rượu vang, nước giải khát…

Ở Việt Nam chitosan đã được sử dụng thay hàn the trong sản xuất chả giò, bánh cuốn, bánh su sê… với vai trò như một chất phụ gia thực phẩm

Là một polymer dùng an toàn cho người lại có hoạt tính sinh học đa dạng nên chitosan được đưa vào ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm

 Trong công nghệ sinh học:

Dùng để cố định enzym và các tế bào vi sinh vật, làm chất mang sử dụng trong sắc kí chọn lọc [12]

1.1.2.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitosan

Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa và ứng dụng của chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX Những nước đã thành

công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn

Độ, Pháp Nhật Bản là nước đầu tiên trên thế giới năm 1973 sản xuất 20 tấn/năm

Và đến nay đã lên tới 700 tấn/năm, Mỹ sản xuất trên 300 tấn/năm Theo Know năm

1991 thì thị trường có nhiều triển vọng của chitin, chitosan là Nhật Bản, Mỹ, Anh, Đức Nhật được coi là nước dẫn đầu về công nghệ sản xuất và buôn bán chitin, chitosan Người ta ước tính sản lượng chitosan sẽ đạt tới 118 tấn/năm, trong đó Nhật, Mỹ là nước sản xuất chính

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sản xuất chitin, chitosan và ứng dụng của chúng trong sản xuất phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mẻ Vào những năm 1978-1980, trường Đại Học Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitosan của tác giả Đỗ Minh Phụng mở đầu bước ngoặt quan trọng trong việc nghiên cứu, tuy nhiên chưa có ứng dụng nào thực tế trong sản xuất

Hiện nay nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitosan như: Trường Đại Học Nha Trang, Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm nghiên cứu polymer – Viện khoa học Việt Nam, Viện hóa thuộc Viện khoa học Việt Nam tại Thành Phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ và sinh học Thủy sản

- Viện nghiên cứu môi trường thủy sản 2,…Trong đó, các kết quả công bố gần đây của các nhà khoa học thuộc trường Đại Học Nha Trang đã đi sâu nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất ở bước cao hơn theo hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý, ứng dụng công nghệ enzyme

Đáng kể nhất là các công trình nghiên cứu của Trần Thị Luyến và các cộng sự

đã sử dụng enzym papain, chitinase và vi khuẩn Lactic trong công nghệ sản xuất chitosan Những kết quả đó đã góp phần đáp ứng những yêu cầu cấp bách xử lý phế liệu tôm đông lạnh và trước những yêu cầu khắt khe hơn về chất lượng chitin, chitosan trên thị trường đầy tiềm năng hiện nay

Chitosan đang được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm nghiên cứu để nâng cao và mở rộng khả năng ứng dụng của nó

Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công nghệ Quốc Gia, Học viện Quân y – Bộ Quốc phòng và Khoa hóa, Đại học

Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp cùng nghiên cứu tác dụng

hạ cholesterol trong máu của N,N,N-Trimethylchitosan (TMC) Theo tác giả tác dụng hạ cholesterol của TMC là do trong phân tử của nó có chứa nhóm –N(CH3 3) , các nhóm này có khả năng kết hợp với Cl của acid béo có trong muối mật và được đào thải ra khỏi cơ thể [6], [7]

Tác giả Lê Văn Thảo và các cộng sự thuộc bệnh viện U Bướu Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu sử dụng chế phẩm chitosan mang thuốc điều trị trên 60 bệnh nhân mắc nhiều loại ung thư Kết quả tất cả 60 bệnh nhân đều có thể trạng chung tốt, ăn được ngủ ngon, trọng lượng cơ thể không thay đổi trước và sau điều trị Đặc biệt giá trị bạch cầu có giảm nhưng trong giới hạn cho phép còn hồng cầu và tiểu cầu không

có sự thay đổi Đồng thời nhóm nghiên cứu cũng đã ghi nhận sự giảm cholesterol trong máu những bệnh nhân nói trên

Hóa trị và xạ trị là hai trong số các phương pháp quan trọng nhất trong điều trị ung thư Tuy nhiên, nhược điểm của các liệu pháp này là làm giảm lượng hồng cầu, bạch cầu trong cơ thể dẫn tới suy sụp thể trạng của bệnh nhân Các bác sĩ bệnh viện

U Bướu Hà Nội vừa cho biết, chế phẩm chitosan có thể giảm thiểu tối đa các dụng phụ này Và đưa ra kiến nghị sử dụng nó để hỗ trợ điều trị bệnh ung thư bằng hóa trị, xạ trị [6], [7]

Chitosan cũng được ứng dụng trong việc điều trị viêm loét dạ dày, năm 1983, Marshall và Warren phát hiện ra một loại vi khuẩn hiện diện trong niêm mạc dạ dày

có tên là Helicobacter pylori có mối liên hệ với bệnh viêm loét dạ dày – tá tràng Vì vậy mà vấn đề diệt trừ H.pylori là một liệu pháp quan trọng trong việc điều trị viêm

loét Tuy số lượng thuốc dùng trong điều trị có khá nhiều, đa dạng và có nhiều tiến

bộ trong điều trị nhưng việc nghiên cứu tìm ra thuốc mới, dặc biệt từ các hợp chất thiên nhiên nhằm khắc phục các tác dụng phụ do thuốc là hóa chất tổng hợp vẫn được đặt ra Chitosan là hợp chất được điều chế từ nguồn thiên nhiên, chúng được ghi nhận có tính bảo vệ niêm mạc Đặc biệt ở nước ta chitosan cũng đã được nghiên

cứu về tác dụng kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn H.pylori với kết quả khả quan

Các nhà khoa học Nguyễn Thị Ngọc Tú – Viện Hóa học, Trung tâm khoa học

và Công nghệ Quốc gia và Lê Hải Yến, Trần Bình Nguyên – Công ty Dược liệu Trung Ương I hợp tác nghiên cứu tạo ra thuốc polymer có tác dụng chẩm kéo dài Các nhà khoa học thuộc khoa Dược – Dại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh nghiên cứu một dẫn xuất của chitosan ứng dụng trong kĩ thuật bao phim thuốc Hiện nay, nước ta cũng đã chế tạo được màng chữa tổn thương về da có tên là Vinachitin do các ngành khoa học thuộc Viện Hóa học - Trung tâm khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia cùng các bác sĩ Trường Đại học Y khoa Hà Nội – Bộ

y tế phối hợp nghiên cứu Màng vinachitin được dùng để chữa các viết thương ở diện rộng và tương đối sâu Chúng có khả năng hòa hợp sinh học rất cao và thúc đẩy việc gắn liền vết thương, chúng bị phân hủy sau hai tuần Nó có tác dụng bảo

vệ, chống nhiễm trùng, chống mất nước, tăng khả năng tái tạo da và đặc biệt khi vết thương lành không để lại sẹo

Qua nghiên cứu của Châu Văn Minh và cộng sự thuộc Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia đã điều chế được chế phẩm BQ-1 với nguyên liệu chính là chitosan có tác dụng bảo quản quả tươi (cà chua, nho, vải…) rất tốt Chế phẩm này có tác dụng chống mốc, chống sự phá hủy của một số nấm men, vi sinh vật Gram (–) trên các loại hoa quả Từ kết quả nhận được, Châu Văn Minh tiếp tục khả năng bảo quản thực phẩm tươi sống của BQ-1 đã kéo dài được thời gian sử dụng của sản phẩm trong một thời gian nhất định

Ở Việt Nam, chitosan cũng đã được sử dụng thay hàn the trong sản xuất chả giò, bánh cuốn, banh su sê… với vai trò như một chất phụ gia thực phẩm Sở thương mại Hà Nội, Viện dinh dưỡng, Viện Hóa học và Hội khoa học Kỹ thuật an toàn thực phẩm hợp tác nghiên cứu và sản xuất phụ gia chitosan – PDP (có polyphosphate) dạng bột hoàn toàn thay thế hàn the – một chất tạo độ dẻo dai, giòn chắc cho thực phẩm xay nghiền đã bị cấm sử dụng do gây ung thư

Các nhà khoa học Bùi Văn Miên và Nguyễn Anh Trinh thuộc Khoa Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông lâm đã nghiên cứu dùng chitosan để bảo quản các

thực phẩm tươi sông giàu đạm, dễ hư hỏng như cá, thịt… Nhờ khả năng hạn chế nước đi qua của lớp màng mỏng chitosan nên đã chống lại được sự mất nước trong quá trình bảo quản lạnh và lạnh đông thực phẩm Kết quả nhận được sau khi kết đông, rã đông thì sự mất nước hao hụt trọng lượng của cá giảm hơn trường hợp sử dụng chitosan, đồng thời không làm mất màu, mùi vị của sản phẩm

Nói về khả năng chống mất nước của chitosan, một bài báo ở Cần Thơ đã đưa

ra cách giải bài toán bảo quản bằng trái cây nói chung và trái xoài nói riêng bằng cách: Các trái xoài đều đạt tiêu chuẩn được ngâm trong nước nóng 55ºC trong 5-10 phút, phối hợp với chất benomyl (diệt nấm), chitosan giúp trái cây không bị mất nước

Mới đây nhất, tại Đại học Nha Trang, các kết quả nghiên cứu của Trần Thị Luyến, Nguyễn Trọng Bách cho thấy chitosan có thể kết hợp với các phụ liệu tinh bột hồ hóa, sorbitol và polyvinyl acetate để tạo màng bao có đặc tính cơ lý khá tốt (mềm dẻo và độ bền đứt cao) có khả năng đáp ứng yêu cầu bao gói thực phẩm Đồng thời khi sử dụng màng bao chitosan tạo thành để bao gói thịt bò tươi, kết quả cũng cho thấy màng bao chitosan đã làm giảm đáng kể nồng độ vi sinh vật tổng số trên bề mặt thịt bó khi bảo quản ở nhiệt độ 0-5ºC

Bên cạnh đó, những ứng dụng của các dẫn xuất chitosan cũng được các nhà nghiên cứu quan tâm Tác giả Trần Thị Luyến và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng olygoglucosamin, một dẫn xuất của chitosan, thay thế NaN03 trong bảo quản xúc xích gà surimi Kết quả cho thấy, với hàm lượng 0,4% olygoglucosamin bổ sung vào thành phần phối trộn sản xuất xúc xích gà surimi, sản phẩm vẫn đáp ứng tốt về chất lượng cảm quan đòng thời đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng [4], [6], [7]

1.2 Tổng quan về cà chua, bệnh thối ướt ở cà chua

1.2.1 Giới thiệu về cà chua

Cà chua đem lại cho con người một nguồn dồi dào các vitamin như vitamin C, vitamin A, vitamin K, vitamin B cùng một số chất khoáng như K, Mg, Cr, Cu, Fe,

protein và chất xơ Đặc biệt trong cà chua có 4 loại caroten là α-caroten, β-caroten, lutein, lycopen Phân tử lycopen trong cà chua có tính chống oxy hóa cao, đây là thành phần có lợi cho sức khỏe con người

Cà chua là loại rau ăn quả thuộc họ cà Solanaceae, có nguồn gốc từ Nam Mỹ Cà

chua có tên tiếng anh là tomato và tên khoa học là Lycopersincon esculetum [48]

1.2.2 Thành phần hóa học của cà chua

Cenlulose: có nhiều trong quả xanh, càng chín, hàm lượng càng giảm dần

1.2.2.2 Độ acid

Độ acid chung của cà chua khoảng 0,4% (theo acid malic) Độ acid hoạt động trong khoảng pH =3,1-4,1 Ngoài ra còn có acid citric và lượng nhỏ acid tatric Khi còn xanh, acid ở dạng tự do Khi chín có dạng muối acid

1.2.2.3 Nitơ

Nitơ trong cà chua khoảng 1% Lúc còn xanh, nitơ ở dạng tự do, khi chín nó

bị phân hủy thành axit amin

1.2.2.4 Chất khoáng

Chất khoáng trong cà chua chiếm khoảng 0,4%, gồm một số chất khoáng như canxi, photpho, sắt

1.2.2.5 Glucozit

Cà chua thường có vị hăng là do chứa glucozit solanin

- Cà chua xanh có hàm lượng solanin khoảng 8%

- Cà chua ửng có hàm lượng solanin khoảng 8%

- Cà chua chín có hàm lượng solanin khoảng 8%

1.2.2.6 Sắc tố

Trong cà chua có nhóm sắc tố thuộc nhóm carotenoid như: carotene, lycopen, xantophyl Ở quả cà chua xanh còn có chlorophyll Tùy theo mức độ chín mà sắc tố tăng dần nên màu của quả đậm hơn

1.2.2.7 Vitamin

Trong cà chua chứa nhiều vitamin, gồm có:

- Vitamin C chiếm khoảng 20 – 40 (mg%)

- Vitamin B1 chiếm khoảng 0,08 – 0,15 (mg%)

- Vitamin B2 chiếm khoảng 0,05 – 0,07 (mg%)

- Vitamin PP chiếm khoảng 0,5 – 16,5 (mg%)

- Vitamin K chiếm khoảng 50 (mg%)

- Carotin chiếm khoảng 1,2 – 1,6 (mg%)

1.2.3 Vai trò của cà chua

Trong cà chua có sắc tố lycopen cùng với caroten vừa ngăn chặn tế bào ung thư vừa chống sự hình thành các cục máu đông trong thành mạch nên giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, chống lại các bệnh thoái hóa thần kinh và bệnh liên quan đến tiểu đường loại Lycopen được xem là chất chống oxy hóa mạnh, có khả năng hóa giải các gốc tự do, ngăn chặn tế bào ung thư vì các gốc tự do có trong cơ thể là nguyên nhân chính dẫn đến việc hình thành các tế bào ung thư Các gốc tự do nội sinh và ngoại sinh trong cơ thể sẽ phá hủy các DNA và RNA, tạo nên đột biến gen gây ung thư, đồng thời phá hủy tế bào dẫn đến bệnh tật, tử vong

Cà chua chứa vitamin C, B1, B6, PP, lycopen, β-caroten, hàm lượng đạm, đường, chất béo có rất ít nên cà chua được xem là một loại thực phẩm nghèo năng lượng dành cho người béo phì Ngoài ra, cà chua có tính bình, vị chua, hơi ngọt, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, chống khát nước, giúp thông tiểu tiện và tiêu hóa tốt

Cà chua còn là loại rau ăn quả thường được sử dụng để tạo vị ngon và màu sắc hấp dẫn cho món ăn, thức uống

1.2.4 Bệnh thối ướt ở cà chua

Cà chua chứa nhiều vi sinh vật có nguồn gốc từ đất, nước, không khí và các môi trường khác có thể chứa một số tác nhân gây bệnh ở thực vật Các vi sinh vật này sinh trưởng rất nhanh trong các quả cà chua bị trầy xước, dập nát và gây ra

bệnh thối ướt Một số vi sinh vật thường gây bệnh thối ướt ở cà chua như Rhizopus nigricans, Fusarium, Aspergillus niger, Clostridium, Pseudomonas, Erwinia Cà

chua khi bị bệnh thối ướt sẽ mất giá trị dinh dưỡng và mùi vị đặc trưng, giảm chất lượng nhanh chóng

Bệnh thối ướt do vi khuẩn Erwinia sp gây hại với các triệu chứng như thối

nhũn một phần hoặc cả quả cà chua, có mùi thối, màu sắc biến đổi, vỏ nhăn Các triệu chứng trên sẽ phát triển nhanh chóng khi nhiệt độ và độ ẩm cao Đây là loại bệnh phổ biến và gây thiệt nghiêm trọng đối với cà chua trong quá trình bảo quản, cất giữ, chuyên chở và xuất nhập khẩu Nếu không phát hiện và cách ly kịp thời những quả bị hỏng thì dễ làm lây nhiễm sang các quả nguyên vẹn khác, gây tổn thất

cả lô hàng Vi khuẩn gây bệnh là loài đa thực, ký sinh và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau Vi khuẩn xâm nhập chủ yếu qua vết thương, vết dập nát

Bệnh thối ướt có thể phát sinh ngay từ khi cà chua mới thu hoạch và kéo dài trong thời gian bảo quản Bệnh xuất hiện với tỷ lệ thấp ở tháng 1 đến tháng 3 bởi vì giai đoạn này nhiệt độ thấp không thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhiễm gây bệnh Bệnh thối ướt quả cà chua phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ cao và ẩm độ cao Trong những tháng mùa hè bệnh thối ướt phát triển mạnh nhất, cao điểm của bệnh vào các tháng 6, 7, 8 Bệnh tiếp tục phát sinh gây hại và mức độ bệnh giảm dần khi điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi cho vi khuẩn gây thối ướt (tháng 10 - 12)

Trong quá trình bảo quản trong kho, bệnh thối ướt có thể phát sinh nhưng mức

độ bị bệnh nặng hay nhẹ phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó yếu tố nhiệt độ, độ

ẩm và chất lượng cà chua giữ vai trò quyết định Khi bề mặt quả bị ẩm, không khí trong kho lưu thông kém hoặc bề mặt quả bị tổn thương thì vi khuẩn sẽ xâm nhập

và gây hư hỏng

1.3 Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia sp

1.3.1 Phân loại:

Theo Winslow cà cộng tác viên (1920), loài Erwinia thuộc:

Giới (Kingdom) : Bacteria

Ngành (Phylum) : Proteobacteria

Lớp (Class) : γ –Proteobacteria

Bộ (Order) : Enterobacteriales

Họ (Family) : Enterobacteriaceae

Giống (Genus) : Erwinia

Loài Erwinia là một thành viên của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae được chia

thành 2 nhóm: nhóm gây thối mềm (soft rot) hay “carotovora” và nhóm gây bệnh héo hoặc tàn rụi cây trồng “non – soft rot” hay “amylovora” [55]

1.3.2 Đặc điểm

Erwinia là loài vi khuẩn có họ hàng với Enterobacteriaceae, được chia thành

hai nhóm: nhóm gây bệnh thối mềm và nhóm gây bệnh héo ở cây trồng (Hà, 2006)

Chi Erwinia bao gồm chủ yếu là các loài vi khuẩn gây bệnh thực vật, được gọi tên

theo nhà vi khuẩn thực vật học đầu tiên là Erwin Frink Smith Vi khuẩn gây ra bệnh

thối ướt gồm có một số loài, trong đó có 3 loài chính là Ewwinia carotovora spp carotovora, Ewwinia carotovora spp atroseptica, Ewwinia chrysanthemi [24], [48] Đây là chi vi khuẩn Gram âm có quan hệ gần với Escherichia coli, Shigella, Salmonella và Yersinia [48]

Vi khuẩn Erwinia sp phân bố rộng khắp cả vùng nhiệt đới lẫn ôn đới [47] Vi

khuẩn được tìm thấy trong đất, nước, trên bề mặt cây [24] Chúng gây bệnh ở nhiều loại cây khác nhau như khoai tây, bắp cải, hành, tiêu, dưa leo [20], [23], do có khả năng sản xuất ra các enzyme làm phá vỡ các thành tế bào thực vật Thành tế bào bị

hư cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn Một số emzyme được vi khuẩn Erwinia

tạo ra như:

Vi khuẩn thường xâm nhập vào thực vật thông qua lỗ tự nhiên như khí khổng,

lỗ vỏ, thân, rễ hoặc qua các vết thương do xây xước, côn trùng [20] Khả năng gây

bệnh của vi khuẩn Erwinia spp phụ thuộc 3 yếu tố: độc lực, số lượng vi khuẩn và

đường xâm nhập Độc lực của vi khuẩn là năng lực gây bệnh của vi khuẩn Số lượng vi khuẩn ban đầu phải đủ lớn thì mới có khả năng gây bệnh Cuối cùng, vi khuẩn phải xâm nhập đúng con đường và đường xâm nhập phải thích hợp như vết thương, chỗ dập nát trên quả

Vi khuẩn Erwinia sp hình gậy (1-2 micromet) đứng thành cặp hoặc chuỗi

ngắn, hai đầu hơi tròn, có 2 - 8 lông roi bao quanh mình, di động, kỵ khí không bắt buộc, không sinh bào tử, sinh trưởng tối ưu ở 30oC Nuôi cấy trên môi trường pepton saccarose, khoai tây - agar khuẩn lạc có màu trắng xám, hình tròn hoặc hình bầu dục không đều, bề mặt khuẩn lạc ướt Vi khuẩn không có vỏ nhờn, nhuộm Gram âm, háo khí, dịch hoá gelatin, tạo H2S, thuỷ phân tinh bột, không tạo NH3

Trên môi trường có TZC khuẩn lạc của vi khuẩn Erwinia sp có màu đỏ ở giữa, rìa

ngoài màu trắng Vi khuẩn phát triển thuận lợi trong phạm vi nhiệt độ khá rộng từ

20oC –38oC [15], nhiệt độ thích hợp nhất là 27oC –32oC, nhiệt độ tới hạn chết là

50oC; phạm vi pH cũng khá rộng từ pH = 5,3 - 9,2, thích hợp nhất là pH = 7,2 Vi khuẩn có thể bị chết trong điều kiện khô và dưới ánh nắng

Vi khuẩn Erwinia sp bắt đầu gây bệnh thối ướt thì sẽ làm pH tăng nhẹ, tạo điều kiện thuận cho một số vi khuẩn gây bệnh thực phẩm hoạt động như Salmonela, Shigella [28] Vì vậy, để đảm bảo an toàn thực phẩm thì cần loại bỏ những quả đã

hư, mềm nhũn, chảy dịch nhằm tránh lây lan bệnh thối ướt và ngăn chặn khả năng mắc bệnh từ thực phẩm

1.3.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn Erwinia sp

Trên thế giới: có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Erwinia sp và bệnh

thối ướt trên các loài thực vật khác nhau

Một nhóm các nhà nghiên cứu Thái Lan đã phát hiện và phân loại vi khuẩn

gây bệnh thối mềm Erwinia trên thực vật ở Thái Lan

Fiori và Schiaffino (2003) nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối mềm thân cây hồ

tiêu (Capsicum annuum L.): Erwinia carotovora subsp carotovora tại các nhà kính

ở Sardinia, Italia

Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp quốc gia ở Venezuela đã nghiên cứu bệnh

thối quả của xoài do Erwinia carotovora và Erwinia herbicola vào năm 1986 Alpheus đã phát hiện vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối ướt trên khoai tây Amodu (2006) nghiên cứu về bệnh thối củ gây ra bởi vi khuẩn Erwinia sp [14] Jennifer (2005) nghiên cứu về sự có mặt của Salmonella và Shigella trên cà chua bị bệnh thối ướt gây ra bởi vi khuẩn Erwinia carotovora [28]

Perobelon (2002) đã nghiên cứu về bệnh ở khoai tây gây ra bởi vi khuẩn

Erwinia sp [44]

Tại Việt Nam: Nguyễn Thị Thanh Hà (2006) phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora trên cây địa lan (Cympidium) bằng phương pháp

PCR [3]

1.3.4 Ứng dụng của chitosan trong bảo quản cà chua

Yêu cầu cơ bản nhất trong bảo quản rau quả là tránh được tổn thất về khối lượng và giữ được trạng thái tươi cho rau quả, ngoài ra biện pháp bảo quản phải đơn giản và chi phí đầu tư thấp Vì thế bảo quản bằng màng bao mang lại nhiều hiệu quả trên Cà chua là một loại quả được trồng phổ biến, có giá trị dinh dưỡng nhưng là một loại quả có tuổi thọ kém, hô hấp đột biến Chitosan là một polyme động vật được thu từ phế thải của ngành thuỷ sản, mang nhiều đặc tính phù hợp để bảo quản rau quả Nghiên cứu này đã dụng chitosan làm màng bao để bảo quản cà chua Nghiên cứu đã chỉ ra rằng màng bao chitosan có nồng độ 2% là thích hợp nhất cho việc bảo quản cà chua ở cả điều kiện thường cũng như điều kiện nhiệt độ lạnh

Ở nồng độ này màng chitosan có khả năng hạn chế hô hấp của quả tốt nhất, lượng CO2 thoát ra ít nhất và quả sau khi bảo quản có trạng thái cảm quan tốt nhất Độ chín cà chua thích hợp nhất để bảo quản là độ chín vàng (Breaker), số lần nhúng cà chua vào dung dịch chitosan để tạo màng tốt nhất là hai lần [57]

Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh cơ sở phía Bắc chi nhánh Thái Bình đã nghiên cứu đề tài: "nghiên cứu sử dụng màng Chitosan bảo quản quả cà chua tại vùng nông thôn Thái Bình"

Đề tài được xây dựng dựa trên quá trình nghiên cứu lấy mẫu cà chua tại xã Vũ Chính - Tp Thái Bình Từ kết quả nghiên cứu tại phòng thí nghiệm đã đề xuất được quy trình bảo quản cà chua ở nhiệt độ thường bằng màng chitosan có bổ sung phụ liệu có tính khả thi cao, phù hợp với điều kiện sản xuất quy mô vùng nông thôn, việc sử dụng màng chitosan đã mang lại nhiều ưu điểm như thời gian bảo quản kéo dài từ 28-35 ngày mà vẫn đạt chất lượng của quả Bên cạnh đó, các nguồn phụ phẩm như vỏ tôm, ghẹ là các loại phụ phẩm sẵn có đã được tận dụng mang lại hiệu quả kinh tế [58]

1.3.5 Một số nghiên cứu của chitosan đối với vi khuẩn Erwinia sp

( Bautista-Banos, 2006) cho thấy sử dụng chitosan kháng vi khuẩn Erwinia sp

hại rau quả [16]

(Jia Liu, 2007) nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan trên kiểm soát các bệnh sau thu hoạch và tiềm năng của các polymer sinh học chitosan có phân tử lượng khác nhau để kiểm soát nấm mốc màu xám sau thu hoạch quả cà chua [29]

(Mohamed E.I Badawy, 2009) đã nghiên cứu chỉ ra chitosans hóa học thay đổi như các tác nhân kháng khuẩn chống lại một số vi khuẩn gây bệnh thực vật và nấm trên cà chua [40]

(Rabea E.I., Steurbaut W 2010) nghiên cứu khả năng kháng khuẩn, nấm của chitosan tác dụng trên Rot blackmold và yếu tố gây bệnh được sản xuất bởi Alternaria alternata trong nghệ sau thu hoạch cà chua [46]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh trên cà chua sau thu hoạch thu nhận từ phòng

thí nghiệm Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha Trang

Erwinia sp là vi khuẩn gram âm, thuộc họ Enterobacteriacea

Vi khuẩn Erwinia sp Có khuẩn lạc màu trắng đuc, bờ tròn đều, tế bào có hình

que, đầu tròn, có 2 -8 lông roi, các tế bào dính chùm từ 2 – 3 tế bào

Hình 2.2 Vi khuẩn Erwinia sp

2.1.3 Môi trường nuôi cấy PGA

- Khoai tây : 200 gam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Vi khuẩn Erwinia sp được chuẩn bị ở dạng dung dịch bằng cách: Cấy chủng

vi khuẩn vào môi trường TSB đã được khử trùng Ủ ở 37ºC trong 24h để chủng vi khuẩn hoạt hóa và tăng sinh

Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường PGA, thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chitosan theo phương pháp đục lỗ thạch [35] Quá trình nuôi cấy phải được thực hiện trong tủ cấy, phải đảm bảo các quy tắc vô trùng Sau khi nuôi cấy xong, ủ các đĩa petri ở 37ºC, sau 24h đem ra đọc kết quả

Hòa tan chitosan ở các nồng độ 0%; 0,3%; 0,4%, 0,5%; 0,6% trong

CH3COOH 1% (pH = 5,5 – 6)

Dịch vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường TSB

Cấy trên môi trường PGA bằng phương pháp đục lỗ thạch và ủ ở

37ºC trong 24h

Đo đường kính kháng khuẩn

Chitosan