Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống

Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ốngNghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ốngNghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ốngNghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ốngNghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ốngNghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ốngNghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ốngNghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ốngNghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG - HOÀNG NGỌC CƯƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP GÂY BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ MAI MỰC ỐNG Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 62540105 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HỊA - 2017 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Nha Trang Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRANG SĨ TRUNG Trường Đại học Nha Trang PGS.TS NGUYỄN ANH TUẤN Trường Đại học Nha Trang Phản biện 1: GS.TS TRẦN THỊ LUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh Phản biện 2: GS.TS NGUYỄN THỊ HIỀN Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Phản biện 3: PGS.TS NGUYỄN ANH DŨNG Trường Đại học Tây Nguyên Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án cấp trường họp Trường Đại học Nha Trang vào hồi ……… giờ, ngày …… tháng …… năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Trường Đại học Nha Trang DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LUẬN ÁN Hồng Ngọc Cương, Nguyễn Cơng Minh, Trang Sĩ Trung (2013) “Thu nhận chitosan từ xương mực phế liệu đánh giá khả kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn (soft rot) cà chua sau thu hoạch” Hội nghị khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2013 Hoang Ngoc Cuong, Nguyen Cong Minh, Nguyen Van Hoa, Trang Si Trung (2016) “Preparation and characterization of high purity β-chitin from squid pens (Loligo chenisis)” International Journal of Biological Macromolecules 93 (2016) 442– 447 Hoang Ngoc Cuong, Nguyen Cong Minh, Nguyen Van Hoa, Trang Si Trung (2016) “High purity and high molecular weight β-chitin from squid pens (Loligo chenisis)” 11th Asia pacific chitin and chitosan & 5th Indian chitin and chitosan society symposium, Kochi, Kerala, India, 28-30 September, 2016 Hoang Ngoc Cuong, Nguyen Cong Minh, Nguyen Van Hoa, Khong Trung Thang, Nguyen Anh Tuan, Trang Si Trung (2017) “Hight molecular weight and high degree of deacetylation of chitosan prepared from squid pens (Loligo chenisis)” Journal of Polymer Material, Vol 34, No 1, 103-114 Hoang Ngoc Cuong, Huynh Thanh Tung, Nguyen Cong Minh, Nguyen van Hoa, Pham Thi Dan Phuong, Trang Si Trung (2017) “Antibacterial activity of chitosan from squid pen (Loligo chenisis) against Erwinia carotovora from soft rot postharvest tomato fruit” Journal of Polymer Material, Vol 34, No 1, 319-330 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu thu nhận đánh giá khả kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn cà chua sau thu hoạch chitosan từ mai mực ống Ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số: 62540105 Nghiên cứu sinh: Hoàng Ngọc Cương Khóa: 2011 Người hướng dẫn: PGS.TS Trang Sĩ Trung PGS.TS Nguyễn Anh Tuấn Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: 1) Đã xác định thành phần thành phần hóa học nguồn phế liệu mai mực Loligo sp nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang, làm sở khoa học cho nghiên cứu 2) Đã xác định điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại Sản phẩm -chitin thu có khối lượng phân tử lớn nguồn nguyên liệu tiềm để sản xuất chitosan tinh khiết dùng lĩnh vực kỹ thuật cao Điều kiện thu nhận ứng dụng sản xuất qui mô lớn 3) Đã xác định điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao khối lượng phân tử lớn Sản phẩm chitosan thu nguồn nguyên liệu tiềm để sản xuất oligo chitosan chế phẩm từ chitosan ứng dụng lĩnh vực kỹ thuật cao y dược, y sinh công nghệ thực phẩm Điều kiện deacetyl ứng dụng sản xuất qui mô lớn 4) Đã đánh giá khả kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trái cà chua sau thu hoạch điều kiện in vitro in vivo sử dụng chitosan có khối lượng phân tử khác Kết nghiên cứu sở ứng dụng chitosan bảo quản nông sản sau thu hoạch sở khoa học cho nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn chitosan CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Hiện Việt Nam nước xuất thủy sản sang 156 thị trường giới với tổng kim ngạch đạt tỷ USD/năm đóng góp tích cực vào phát triển kinh tế nước Tuy nhiên thực trạng diễn lượng lớn phế liệu thủy sản (phế liệu cá, tôm, cua, ghẹ, mực,…) bị thải sau trình chế biến gây nhiễm nghiêm trọng đến mơi trường cân hệ sinh thái Do việc xử lý kịp thời hiệu lượng phế liệu khơng góp phần hạn chế nhiễm mơi trường mà nâng cao hiệu sản xuất kinh doanh hiệu sử dụng tài nguyên thông qua việc thu hồi hợp chất có hoạt tính sinh học Gần nguồn phế liệu mai mực giới khoa học quan tâm nghiên cứu nguồn nguyên liệu tốt để thu nhận -chitin chitosan có độ tinh khiết cao ứng dụng lĩnh vực y dược, y sinh, công nghệ thực phẩm bảo quản nông sản sau thu hoạch Tuy nhiên thông tin công bố điều kiện thu nhận tính chất β-chitin chitosan từ mai mực ống hạn chế, có khả kháng nấm kháng khuẩn chúng Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu thức quy trình thu nhận, đánh giá hoạt tính sinh học ứng dụng β-chitin chitosan thu từ β-chitin Đây rào cản tiếp cận với nguồn nguyên liệu mai mực ống Song song với phát triển ngành công nghiệp chế biến thủy sản, lĩnh vực xuất nơng nghiệp tích cực hội nhập, tính riêng kim ngạch xuất rau 2015 đạt 1,8 tỷ USD Tuy nhiên tổn thất nông sản sau thu hoạch nước ta cao, chiếm tới 20% tổng sản lượng gây tổn thất lớn cho kinh tế Trong đó, thối nhũn (soft rot) bệnh phổ biến gây tổn thất nghiêm trọng Trên thực tế việc sử dụng tràn lan thuốc hóa học, chất bảo quản khơng rõ nguồn gốc phòng trừ bệnh sau thu hoạch khiến sản phẩm nơng sản sau thu hoạch có giá trị kinh tế cao an toàn vệ sinh, giảm giá trị thương phẩm Do đó, việc sử dụng sản phẩm nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn phòng trừ bệnh thối nhũn rau cần thiết nhằm hạn chế tác hại dư lượng thuốc hóa học đến sức khỏe người Vì vậy, hướng nghiên cứu thu nhận polyme sinh học từ phế liệu thủy sản ứng dụng bảo quản nông sản sau thu hoạch nhà khoa học quan tâm Do vậy, luận án tiến hành "Nghiên cứu thu nhận đánh giá khả kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn cà chua sau thu hoạch chitosan từ mai mực ống" thực với mục đích thu nhận -chitin chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại từ nguồn phế liệu mai mực Loligo sp thải sau trình chế biến mực ống xuất Từ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn (soft rot) cà chua sau thu hoạch chitosan thu điều kiện in vitro in vivo, làm sở khoa học ứng dụng chitosan bảo quản nơng sản sau thu hoạch Mục đích Luận án Thu nhận -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại từ nguồn phế liệu mai mực Loligo sp thải sau trình chế biến mực ống xuất Sản xuất chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại từ -chitin thu nhận Đánh giá hiệu kháng khuẩn chitosan bệnh thối nhũn trái cà chua sau thu hoạch vi khuẩn Erwinia sp gây Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Phế liệu mai mực Loligo sp thu nhận nhà máy chế biến thủy sản thải sau trình chế biến mực ống xuất thuộc tỉnh Kiên Giang Mẫu thu nhận dạng tươi, có chiều dài từ 12-15 cm, rộng 1,0-1,5 cm độ dày trung bình 0,4 - 0,5 mm 3.2 Phạm vi nghiên cứu Xác định thành phần hóa học bản, acid amin thành phần khoáng nguồn phế liệu mại mực Loligo sp Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng yếu tố nồng độ NaOH, nồng độ HCl, nhiệt độ thời gian đến trình khử protein, khử khoáng để thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại hạn chế đến mức thấp trình cắt mạch -chitin trình thu nhận Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng yếu tố nồng độ NaOH, nhiệt độ thời gian đến trình deacetyl -chitin để thu nhận sản phẩm chitosan có độ deacetyl 90% đạt tiêu chuẩn thương mại hạn chế đến mức thấp trình cắt mạch chitosan trình deacetyl Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trái cà chua sau thu hoạch Sau đó, khảo sát đánh giá khả kháng khuẩn sản phẩm chitosan thu khối lượng phân tử khác vi khuẩn Erwinia sp điều kiện in vitro in vivo Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp phân tích đại: Xác định hàm lượng protein lại chitin (hàm lượng protein < 3%) phương pháp MicroBiuret mô tả Aye Stevens 2006; Xác định độ acetyl (DA) deacetyl (DD) chitin dựa vào đo độ hấp phụ quang học sau thủy phân mẫu với H3PO4 theo Hein cộng 2008; Phân tử lượng trung bình (Mw) chitin xác định thông qua độ nhớt nội tính theo cơng thức Mark– Houwink theo Einbu cộng 2007; Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) đo máy PANalytical, X’Pert-PRO –MPD, sử dụng tia chiếu xạ CuKα (λ = 1,54Å) với hiệu điện 40kV cường độ 40mA, góc quét 4o < 2θ < 44o, bước quét 0,05o, tốc độ quét 1o/min, nhiệt độ 25oC; Phổ hấp phụ hồng ngoại (FTIR) đo máy Nicolet iS10, Thermo Scientific, bước sóng từ 548– 4000cm-1; Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR đo 1H NMR (400 MHz, Bruker) sử dụng dung môi DCl D2O; Kính hiển vi điện tử SEM chụp máy Hitachi S-4800; Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM chụp máy H7600 (Hitachi, Tokyo, Japan) mức điện 100 kv; Độ hòa tan chitosan: phản ánh thơng qua mức độ hòa tan 1g mẫu 100ml dung dịch acid acetic 1% theo thủ tục Samar cộng 2013 ; Xác định độ rắn chitin, chitosan: xác định thông qua số kết tinh (CrI - Crystalline Index) theo phương pháp mô tả Pareek cộng 2013 mức độ kết tinh (χcr - Degree of Crystallinity) theo phương pháp Chebotok cộng 2007 Các kết thí nghiệm xử lý thống kê, kiểm định so sánh giá trị trung bình nhóm phần mềm SPSS, ANOVA T test Kết cấu Luận án Luận án gồm 127 trang nội dung, 138 tài liệu tham khảo 23 trang phụ lục Nội dung luận án trình bày chương với 25 bảng biểu 45 hình ảnh, đồ thị 18 sơ đồ, qui trình CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP ĐỂ THU NHẬN -CHITIN 1.1.1 Giới thiệu nguyên liệu mực ống Loligo sp phế liệu từ mực sau chế biến Mực ống Loligo sp sống độ sâu, tập trung nhiều vùng nước sâu khoảng 30-50 m Mùa vụ khai thác từ tháng đến tháng (vụ Nam) tháng 12 đến tháng năm sau (vụ Bắc) Trong chủ yếu có lồi đánh bắt với số lượng chiến 96% tổng sản lượng, bao gồm: Loligo japonica, Loligo chinensis, Loligo beka Todarodes pacificus Mai mực chiếm tỷ lệ khoảng 0,3-0,5% trọng lượng toàn thân mực ống nguyên liệu tươi 10-15% phế liệu nội tạng mực thải sau trình chế biến Theo số liệu thống kê của Công ty Việt Nam Food thuộc tỉnh Cà Mau, lượng phế liệu từ chế biến mực ống công ty thu mua tháng khoảng 130 Do đó, lượng mai mực thu ước đạt trung bình 10-15 tấn/tháng Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu chủ yếu phơi khô bán thô cho nhà máy chế biến làm thức ăn chăn nuôi bán trực tiếp với giá thành thấp cho thương lái sang thị trường Trung Quốc 1.1.2 Thành phần hóa học nguyên liệu qui trình thu nhận chitin, chitosan Các nghiên cứu cho thấy chitin tồn tự nhiên dạng tự mà liên kết với thành phần khác dạng phức hợp với protein, cacbonat canxi nhiều hợp chất hữu khác gây khó khăn cho việc tách chiết thu nhận chitin (Hình 1.1) Thành phần hóa học nguồn nguyên liệu xem yếu tố định đến việc lựa chọn qui trình tách chiết chất lượng sản phẩm chitin thu So với nguồn phế liệu vỏ tơm, cua ghẹ, phế liệu mai mực có hàm lượng chitin cao nhiều (khoảng 303 50%) hàm lượng khống lại thấp (dưới 2%) Hàm lượng lipid thấp không phát Do đó, tách chiết thu nhận chitin bỏ qua q trình khử khống khử lipid mà tập trung vào trình khử protein (Hình 1.2) O HOH 2C H H HO HO NH HH O Ester bond H3C O H C CH3 CH3 CH3 H HOH 2C R CH3 CH3 O H Imine bond H3C H3C HO O CH3 NHH H OH HO H Chitin CH3 O C O C H H O HO O HOH 2C H H NH H HO CH3 C H O NH O H3C CH3 n O H H HOH 2C C R Fatty acid O Ester bond Astaxanthin N Imine bond R CH C O NH Protein R CH C O n NH R CH2 Hình 1.1 Một kiểu mơ liên kết hóa học tạo astaxanthin với phân tử khác phế liệu tôm (Armenta Guerrero-Legarreta, 2009) Vỏ tôm, cua, ghẹ Mai mực Khử protein môi trường kiềm (NaOH, KOH) Khử protein mơi trường kiềm (NaOH, KOH) Khử khống môi trường acid (HCl, HNO3, ) Khử màu (H2O2, K2MnO4, NaOCl, ) Thu nhận chitin Thu nhận chitin Deacetyl môi trường kiềm (NaOH, KOH) Deacetyl môi trường kiềm (NaOH, KOH) Thu nhận chitosan Thu nhận chitosan Cắt mạch chitosan (H2O2, ) Cắt mạch chitosan (H2O2, ) Thu chitosan ứng dụng Thu chitosan ứng dụng Hình 1.2 Quy trình thu nhận chitin/chitosan từ nguồn nguyên liệu khác 1.2 TỔNG QUAN VỀ -CHITIN VÀ CHITOSAN 1.2.1 Cấu trúc hóa học tính chất chitin Mạch phân tử chitin cấu tạo monosaccharide liên kết với cầu nối –1,4–glucosid Công thức phân tử chung chitin (C8H13O5N)n Đặc biệt, liên kết hydro nội phân tử xảy nhóm nhóm hydroxyl acetamide Từ cấu trúc phân tử thấy chitin khó bị hòa tan dung môi khác Dựa vào cấu trúc hóa học, chitin chia thành ba dạng α-chitin, β-chitin γ-chitin Các dạng chitin tồn tự nhiên đối tượng khác Các cấu trúc khác dẫn đến tính chất khác Cụ thể, α-chitin có độ rắn tinh thể (CrI) cao nhất, β-chitin có độ rắn thấp Các nghiên cứu chứng minh độ rắn tinh thể của α-chitin (85%) từ vỏ tôm, cua ghẹ cao nhiều so với β-chitin (72%) từ mai mực 1.2.2 Cấu trúc hóa học tính chất chitosan Chitosan dẫn xuất chitin hình thành tách nhóm acetyl khỏi mạch chitin gọi q trình deacetyl hố, chitosan polyme chứa nhiều đơn vị Glucosamine nên có nhiều nhóm amin Chitosan tan tốt acid hữu thông thường acid formic, acid acetic, acid propionic, acid citric, acid lactic Hằng số phân li acid (pKa) chitosan có giá trị từ 6,2 đến 6,8 nên hồ tan mơi trường acid lỗng chitosan tạo thành dung dịch keo dương Chitosan tích điện dương có khả bám dính bề mặt ion tích điện âm có khả tạo phức với ion kim loại tương tác tốt với polyme tích điện âm Chitosan khơng hồ tan nước, kiềm cồn Chitosan có khả hút nước, khả hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm, mang DNA Các tính chất phụ thuộc lớn vào độ deacetyl hóa khối lượng phân tử Chitosan có độ deacetyl cao có khả hấp phụ chất màu, tạo phức với kim loại tốt Tương tự, khả kháng khuẩn, kháng nấm chitosan cao mẫu chitosan có độ deacetyl cao 1.2.3 Phương pháp thu nhận chitin chitosan Nói chung, q trình thu nhận chitin bao gồm ba bước: khử protein (deproteinizationDP), khử khoáng (deralization-DM) khử màu (decolorization-DC) Những trình thường sử dụng lượng lớn hóa chất nước, tạo lượng lớn chất thải hóa học độc hại Đồng thời, phần trình deacetyl (deacetylation-DA) chitin trình thủy phân polyme làm cắt mạch chitin xảy Điều ảnh hưởng đến tính chất hóa lý hoạt tính sinh học sản phẩm chitin thu 1.2.4 Điều kiện deacetyl thu nhận chitosan Chitosan thu trình deacetyl phân tử chitin Tác nhân deacetyl baz mạnh NaOH KOH enzyme chitinase Công đoạn deacetyl thực chế độ đa dạng, phong phú, tùy thuộc vào nguồn chitin yêu cầu tính chất sản phẩm chitosan Ngồi ra, người ta sử dụng acid đặc để thực trình deacetyl Tuy nhiên, việc xử lý acid đặc thường kèm theo trình cắt mạch polyme, thực deacetyl môi trường kiềm đặc phương pháp thường sử dụng 1.2.5 Đặc tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn chitosan Chitosan có khả ức chế nhiều chủng vi sinh vật vi khuẩn Gram âm, Gram dương vi nấm Khả ức chế vi sinh vật chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl (DD) phân tử lượng truung bình (Mw) Tính kháng khuẩn chitosan liên quan đến pH môi trường yếu tố khác môi trường, trước hết liên quan đến đặc tính chitosan độ deacetyl, chiều dài mạch (mức độ polyme hóa) Hiện số chế đề xuất để quan sát đặc tính kháng vi khuẩn chitosan dẫn xuất Cơ chế chấp nhận phổ biến giải thích vách tế bào vi khuẩn tích điện âm dễ dàng phản ứng với phân tử chitosan tích điện dương, làm biến đổi tính thấm tế bào, không cho chất vào tế bào làm cho thành phần cấu tạo tế bào ngồi, cuối dẫn đến chết vi sinh vật, tác động kháng khuẩn thường diễn nhanh (trong vài giờ) Thêm vào đó, chúng chất có khả phân giải sinh học khơng gây độc tế bào động vật hữu nhũ Tuy nhiên, cần ý khả bị hạn chế tính tan hạn chế chitosan (khơng tan mơi trường pH > 7,0) Bên cạnh đó, độ nhớt cao dung dịch chitosan trở ngại, gây kết tụ protein điều kiện pH sinh lý 1.3 BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH DO VI KHUẨN Bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại nông sản sau thu hoạch chủ yếu vi khuẩn Erwinia spp gây Chi Erwinia spp thuộc họ Enterobacteria dòng vi khuẩn kỵ khí tuỳ ý gây bệnh thối nhũn (soft rot) nhiều loại trồng rau, củ, khoai tây, cà chua, cải bắp, dứa, ớt, cà rốt, hành tây, súp lơ, hướng dương, xương rồng thuốc Như chi khác thuộc họ Enterobacteria, chi Erwinia spp dòng vi khuẩn gram âm, khơng sinh bào tử, hình que, di chuyển tiêm mao dạng vi khuẩn gây bệnh hội có phổ ký chủ rộng khả lây nhiễm mạnh môi trường cận nhiệt đới ôn đới Các nghiên cứu cho thấy chủng gây bệnh chủ yếu chi Erwinia carotovora ssp carotovora (Ecc), Erwinia carotovora ssp atroseptica (Eca) Erwinia chrysanthemi (Ech) Khả Erwinnia sp phá hủy thành tế bào thực vật, làm vết bệnh lan rộng, mềm phân rã tác động enzyme ngoại bào endo-β-1-4-arabinase endo-β-1-4xylanases Các enzyme khác bao gồm nhóm cellulase có pH tối ưu gần 7, phá hủy vách tế bào thực vật endohydrolysis liên kết 1,4-β-D-glucosidic cellulose, lichenin ngũ cốc Các enzyme pectinase lyases pectate (Pel), lyases pectin (PNL), polygalacturonases (Peh) methylesterases pectin (PME) Erwinia sp dòng vi khuẩn tuỳ ý yếm khí, tồn điều kiện môi trường khác Chúng khơng có khả tạo bào tử để tăng khả tồn gặp điều kiện sống không thuận lợi Tuy nhiên chúng thường tồn hạt giống, nguyên liệu nông sản bị nhiễm bệnh, trình canh tác, lưu trữ bảo quản đất nông nghiệp tự nhiên Vi khuẩn tìm thấy rễ số loại cỏ dại, trồng nước tưới Côn trùng gió tham gia vào lây lan Erwinia sp dụng vào sản xuất qui mô lớn nên tiến hành khảo sát chi tiết them khoảng ảnh hưởng nồng độ NaOH 3-6 %, nhiệt độ từ 70-90oC khoảng thời gian 4-14 với tỷ lệ nguyên liệu giữ cố định (1/10, w/v) Hình 3.1 Ảnh hưởng NaOH, nhiệt độ thời gian đến hiệu khử protein Mw β-chitin 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu khử protein khối lượng phân tử sản phẩm β-chitin Khi tăng nhiệt độ hiệu khử tăng trình cắt mạch chitin tăng Để đạt mục tiêu đặt hàm lượng protein lại cần tiến hành 80oC Ở nhiệt độ này, hàm lượng protein lại khối lượng phân tử trung bình chitin 0,7% 8330 kDa Do đó, chúng tơi chọn nhiệt độ 80oC cho thí nghiệm nghiên cứu 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu khử protein Kết phân tích cho thấy, điều kiện khảo sát hiệu khử tăng nhanh từ (4,35%) đến (1,85%) sau giảm dần đạt mục tiêu đặt sau 10 (0,9%) Trong đó, khối lượng phần tử trung bình chitin thu gần không giảm nhiều từ (8650 kDa) (8240 kDa) sau giảm dần đến 14 (5120 kDa) Như vậy, để đảm bảo hiệu cắt mạch tính chất mạch dài sản phẩm chitin nên chọn thời gian khử 10 Do đó, chúng tơi chọn thời gian khử 10 cho nghiệm sau 10 3.2.4 Ảnh hưởng nồng độ NaOH đến hiệu khử protein Kết phân tích cho thấy, điều kiện nhiệt độ khử 80oC sau thời gian khử 10 trình khử protein hiệu nồng độ NaOH từ 3,5% trở lên Cụ thể mức nồng độ NaOH 3,5; 4; 4,5 5% hàm lượng protein lại mẫu sau khử 0,93; 0,63; 0,33 0,23% Tuy nhiên, mức nồng độ NaOH tăng 4% trình cắt mạch chitin xảy đáng kể, khối lượng phân tử trung bình chitin Mw = 8545 kDa mức NaOH 4% bị phân cắt xuống 7940 kDa mức NaOH 4,5% 6320 kDa nồng độ NaOH tăng mức 5% Do đó, chúng tơi chọn nồng độ NaOH 4% nồng độ phù hợp để khử protein thu nhận chitin từ mai mực Tóm lại, tăng yếu tố thay đổi hàm lượng protein lại cắt mạch chitin trình khử Kết mạch chitin liên kết chặt chẽ với thành phân protein, khống thơng qua nhóm liên kết chính: liên kết sở Schiff, liên kết O-glycosidic, liên kết N-glycosidic (68-91%) liên kết cộng hóa trị khó bị phân cắt Trong mơi trường NaOH, mai mực bắt đầu trương nở cấu trúc tiếp xúc với NaOH cắt đứt liên kết protein phức protein chitin từ khử dần protein mai mực Tuy nhiên trình cần hỗ trợ yếu tố nhiệt độ thời gian để NaOH thấm sâu vào cấu trúc khử hồn tồn protein ngun liệu Mặt khác, q trình thấm sâu vào cấu trúc để khử protein đứt liên kết nội mạch chitin làm giảm khối lượng phân tử trung bình chitin Để đạt mục tiêu nghiên cứu sản phẩm chitin thu nhận có hàm lượng protein nhỏ 1%, đồng thời hạn chế trình cắt mạch sản phẩm chitin, đề xuất điều kiện khử protein nồng NaOH 4% nhiệt độ 80C thời gian 10 Sản phẩm -chitin thu có hàm lượng protein lại 0,63% với Mw 8545 kDa 3.2.5 Tính chất sản phẩm β-chitin từ mai mực ống 3.2.5.1 Thành phần tính chất sản phẩm -chitin Mai mực ống có màu vàng suốt sản phẩm -chitin dạng bột có màu trắng sáng Sản phẩm -chitin thu có hàm ẩm 10%, có hàm lượng kim loại nặng khơng phát hiện, hàm lượng protein lại thấp 0,63 %, khối lượng phân tử trung bình cao (Mw = 8545 kDa) có độ deacetyl (DD = 19,7%) Đáng ý, không qua giai đoạn khử khoáng acid HCl khử màu quy trình thu nhận chitin thơng thường sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại với độ tinh khiết cao 3.2.5.2 Cấu trúc bề mặt mai mực sản phẩm β-chitin Quan sát bề mặt bề mặt cắt nguyên liệu mai mực ống Loligo sp (Hình 3.1a) thấy rõ chitin xếp song song có định hướng liên kết chặt chẽ với thành phần khác protein, lipid khoáng tạo nên cấu trúc mai mực Sau trình khử, chitin bảo toàn độ dày chúng lại giảm đáng kể (Hình 3.1b) 11 Hình 3.2 Hình SEM chụp bề mặt cắt (a) mai mực ống (b) sản phẩm β-chitin 3.2.5.3 Độ kết tinh mai mực sản phẩm β-chitin Kết phân tích cho thấy, phổ mai mực chitin xuất peak góc 2θ = 8.1º peak đặc trưng cho tính chất vơ định hình chitin peak xuất góc 2θ = 19.6º peak đặc trưng cho tính chất kết tinh chitin Kết quả, CrI nguyên liệu mai mực sản phẩm β-chitin 52,5 62,1% Độ kết tinh sản phẩm chitin cao mai mực chứng tỏ hiệu trình khử protein Hình 3.3 Phổ XRD mai mực ống sản phẩm β-chitin thu từ mai mực 3.2.5.4 Độ tinh khiết cấu trúc hóa học sản phẩm -chitin Cấu trúc hóa học độ tinh khiết sản phẩm -chitin đánh giá dựa phổ FTIR NMR Kết phân tích phổ FTIR cho thấy, mẫu -chitin có xuất tất peak đặc trưng cho chitin bước sóng 3277 cm−1 (O-H), 2877 cm−1 (C-H), 1627 cm−1 (amide I), 1543 cm−1 (amide II), 1374 cm−1 (C-H) 950–1200 cm−1 (C-O-C and C-O) Không thấy xuất peak lạ, chứng tỏ sản phẩm chitin thu có độ tinh khiết cao 12 Hình 3.4 Phổ FTIR sản phẩm β-chitin mai mực ống Kết phổ H1-NMR β-chitin cho thấy peak độ chuyển dời hóa học 2,58 – 2,62 ppm tương ứng với protons nhóm N-acetyl glucosamine (GlcNAc-CH3), peak 3,33 – 3,44 ppm proton H-2 glucosamine (GlcN) peak 5,41 5,03 ppm dao động proton α-H-1-A β-H-1-A Các peak 5.02 4.87 ppm H1-D H-1-A Các proton lại thể peak 3.7-4.27 ppm Khơng có peak xuất khoảng 1-1,5 ppm Điều khẳng định độ tinh khiết sản phẩm chitin thu từ mai mực Loligo sp trình thu nhận Kết phù hợp với cơng bố trước Hình 3.5 Phổ NMR sản phẩm β-chitin 13 3.3 ĐIỀU KIỆN DEACETYL -CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN 3.3.1 Đánh giá sơ ảnh hưởng đến hiệu deacetyl -chitin Tương tự trình khử protein để thu nhận chitin từ mai mực Trước tiến hành q trình deacetyl, chúng tơi dựa cơng bố trước tính chất sản phẩm -chitin thu nghiên cứu để tiến hành khảo sát khoảng rộng ảnh hưởng thơng số q trình deacetyl Kết cho thấy, tăng nhiệt độ nồng độ NaOH trình deacetyl xảy nhanh hiệu deacetyl tăng Cụ thể, để đạt chitosan có độ deacetyl lớn 90% nhiệt độ trình phản ứng phải 60oC,nồng độ dung dịch NaOH cần dùng phải 40% Hình 3.6 Ảnh hưởng NaOH, nhiệt độ thời gian đến trình deacetyl β-chitin 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu deacetyl chitin cắt mạch chitosan Khi tăng nhiệt độ từ 50 lên 90oC DD sản phẩm chitosan tăng từ 60,2 lên 90,1% MW lại giảm từ 7784 xuống 5604 kDa Nhiệt độ khử tăng hiệu trình deacetyl tăng, kết DD sản phẩm chitosan đạt 87,9% khử 80C Do đó, chúng tơi lưa chọn nhiệt độ thích hợp cho q trình deacetyl 80C để làm khảo sát sau 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ NaOH đến hiệu deacetyl chitin cắt mạch chitosan 14 Kết cho thấy điều kiện nhiệt độ 80C thời gian khử 12 giờ, tăng nồng độ NaOH hiệu trình deacetyl tăng (Hình 3.2) Giá trị độ deacetyl sản phẩm chitosan 83,6% NaOH 50% đạt 85,7% NaOH 55% Do đó, để đạt mục tiêu nghiên cứu thu sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao hạn chế thấp trình cắt mạch chitosan trình khử nồng độ NaOH thích hợp cho q trình deacetyl 50% 3.3.4 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu deacetyl chitin cắt mạch chitosan Kết cho thấy điều kiện nhiệt độ 80C nồng độ NaOH 50% hiệu trình deacetyl đạt tốt khoảng khử ban đầu, kéo dài thời gian khử hiệu deacetyl có tăng khơng đáng kể (Hình 3.3) Tóm lại, kết đánh giá cho thấy điều kiện deacetyl thích hợp để sản phẩm chitosan thu có độ deacetyl cao hạn chế thấp cắt mạch chitosan trình khử nhiệt độ 80C, nồng độ NaOH 50% với thời gian Kết cho thấy tăng yếu tố làm trình cắt mạch chitosan xảy Tuy nhiên, sản phẩm chitosan thu đạt độ deacetyl đạt 84% có khối lượng phân tử trung bình 7567 kDa Để đạt mục tiêu nghiên cứu với chitosan thu có DD > 90% có cách: - Tăng yếu tố nhiệt độ nồng độ NaOH tăng hai yếu tố Tuy nhiên, q trình cắt mạch xảy mạnh - Giữ nguyên nhiệt độ nồng độ tiến hành tiến hành deacetyl nhiều lần Cách gây cắt mạch polymer dễ dàng thực sản xuất lớn 3.3.5 Điều kiện deacetyl lần Kết cho thấy, xử lý bước hiệu trình deacetyl xảy mạnh mẽ đạt DD = 91,3% sau khử DD = 94% sau 20 khử (Hình 3.4) Tuy nhiên trình cắt mạch xảy mạnh bước đặc biệt sau khử Mw = 7567 kDa giảm 6831 kDa 15 Hình 3.7 Ảnh hưởng trình deacetyl lần đến đến DD Mw chitosan Như vậy, để hạn chế cắt mạch trình deacetyl mức thấp sản phẩm chitosan thu có mức DD > 90% việc chọn phương án deacetyl lần cần thiết Điều kiện deacetyl lựa chọn là: - Bước 1: NaOH 50%, nhiệt độ 80oC, thời gian khử với tỷ lệ (1/10, w/v), sau mẫu rửa trung tính - Bước 2: NaOH 50%, nhiệt độ 80C, thời gian khử với tỷ lệ (1/5, w/v) Sản phẩm chitosan thu có DD = 91,3% Mw = 6831 kDa 3.3.6 Hiệu suất thu nhận tính chất sản phẩm chitosan 3.3.6.1 Hiệu suất thu nhận tính chất chitosan Kết cho thấy hàm lượng chitosan thu từ mai mực ống cao nhiều so với từ vỏ đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) vỏ tôm sú (Penaeus monodon) Như vậy, mai mực ống nguồn nguyên liệu tiềm để thu nhận chitin chitosan So với sản phẩm chitosan thương mại (Sigma), chitosan từ mai mực ống sau thu nhận có độ tinh khiết cao chứa hàm lượng khoáng protein lại nhỏ (khơng phát hiện) Sản phẩm -chitosan có màu trắng sáng với phân tử lượng trung bình Mw 6831 kDa độ deacetyl DD 91,3 % Độ tan -chitosan 99,7% dung dịch acid acetic 1% độ đục 9,5 NTU Đáng lưu ý, -chitosan thu có khối lượng phân tử cao, độ tinh khiết cao nên ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghệ cao tạo màng sinh học Đồng thời -chitosan dùng làm chitosan để cắt mạch tạo thành chitosan có phân tử khác tùy theo mục đích sử dụng 16 3.3.6.2 Thành phần khoáng acid amine Kết cho thấy hàm lượng acid amin lại chitosan thấp Sau trình deacetyl, hầu hết acid amin loại bỏ khỏi β-chitosan trừ lượng nhỏ lại histidine, alanine, valine serine Hàm lượng khống chứa β-chitin chitosan nhỏ (khơng phát hiện), đặc biệt kim loại nặng As, Hg, Pb khơng phát có mẫu β-chitin chitosan (số liệu hiện) Như vậy, sản phẩm -chitin chitosan từ mai mực ống có độ tinh khiết cao đáp ứng yêu cầu cho nghiên cứu ứng dụng lĩnh vực thực phẩm y sinh 3.3.6.3 Cấu trúc bề mặt chitin chitosan Sự khác tính chất bề mặt mai mực, β-chitin chitosan thể Hình 3.5 Bề mặt cắt mai mực có chitin xếp song song xen kẽ với thành phần khác protein, lipid khống (Hình 3.5a) Sau trình khử chitin bảo toàn độ dày chúng lại giảm đáng kể (Hình 3.5b) Điều giải thích thành phần khác như protein, lipit khoáng loại bỏ sau xử lý Trong bề mặt β-chitosan trở nên vơ định hình cấu trúc lớp song song bị phá hủy gần hồn tồn (Hình 3.5c) Hình 3.8 Hình SEM (a) mai mực ống, (b) β-chitin (c) chitosan 3.3.6.4 Độ rắn tinh thể (CrI) Kết cho thấy, tất mẫu xuất hai peak đặc trưng 2θ 7,90 19,60 (Hình 3.6) Tuy nhiên, mai mực có cường độ peak cao đến β-chitin chitosan, chứng tỏ mai mực β-chitin có độ kết tinh cao trình khử protein deacetyl làm giảm độ kết tinh vật liệu Cụ thể, độ kết tinh tương đối (CrI) của hai mẫu tính thương số diện tích peak 7,90 tổng diện tích peak Kết quả, CrI mai mực, β-chitin β-chitosan 72%, 62% 43% 17 Hình 3.9 Phổ XRD mai mực, β-chitin β-chitosan 3.3.6.5 Cấu trúc hóa học độ tinh khiết chitosan Các peak đặc trưng hai mẫu tương tự 3428 cm−1 (O-H), 2928-2872 cm−1 (C-H), 1655 cm−1 (amide I), 1593 cm−1 (amide II), 1318 cm−1 (amide III), 1028–1070 cm−1 (C-O-C C-O) (Hình 3.7) Điều khẳng định hiệu trình deacetyl βchitin, độ tinh khiết sản phẩm Hình 3.10 Phổ FTIR chitosan từ (a) β-chitin, (b) chitosan thương mại (c) β-chitin Độ tinh khiết sản phẩm chitosan khẳng định Phổ H1-NMR trình bày Hình 3.8 Các peak đặc trưng cho chitosan 5.10 ppm (H1), 3.2 ppm (H2), 3.5~3.9 ppm (H3, H4, H5, H6) 2.0 ppm (NHCOCH3) Khơng có xuất peak khoảng 1,0 2,0 ppm chứng tỏ tinh sản phẩm chitosan thu 18 Hình 3.11 Phổ H1-NMR β-chitosan 3.3.6.6 Độ phân tán polymer phân tử lượng trung bình chitosan Để đánh giá khối lượng phân tử phân tán khối lượng tử sản phẩm chitosan, tiến hành đo phổ đo tán xạ ánh sáng trung tâm (SEC-MALLS) Hình 3.9 trình bày phổ SEC-MALLS sản phẩm chitosan Kết đo xác định kích thước hạt chitosan dung dịch Mw = 6831 kDa Hình 3.12 Phổ SEC-MALLS chitosan 3.4 KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN 3.4.1 Phân lập, xác định chủng Erwinia sp gây bệnh thối nhũn cà chua Tiến hành xử lý mẫu phân lập mơi trường PDA điều kiện pH trung tính nhiệt độ từ 30C thu 37 dòng khuẩn lạc đặc trưng Khi nhuộm Gram 37 dòng vi khuẩn phân lập chọn 20 dòng vi khuẩn gram âm có hình que, hai đầu tròn, kích 19 thước tế bào vi khuẩn nằm khoảng (0,5-1,01,0-3,0m) có khả di động Từ 20 dòng vi khuẩn chọn, sau đánh giá đặt tính sinh hóa, sinh lý chọn dòng nằm nghi ngờ Erwinia sp.Từ chủng phân lập tiến hành chủng bệnh nhân tạo loại ký chủ: trái cà chua, khoai tây bắp cải Kết sau 72 chủng vi khuẩn, quan sát thấy có dòng vi khuẩn có khả gây bệnh mạnh, vết bệnh đặt trưng ký chủ Kết qủa phân tích trình tự gen 16S rRNA định danh dòng vi khuẩn chọn trình bày Hình 3.13 Theo đó, chủng EC24-NT có kết phù hợp 97% tương đồng trình tự đoạn gen chủng CP002038 Dickeya dadantii 3937 hay gọi Erwinia sp Kết thu nhận từ thông tin ngân hàng gen NCBI thơng qua chương trình BLAST SEARCH (Hình 3.14) Ngồi ra, dòng vi khuẩn sau định danh chụp kính hiển vi điện tử SEM cho kết hình que, hai đầu tròn, kích thước tế bào vi khuẩn nằm khoảng (0,5-1,01,0-3,0m) a c b Hình 3.13 Hình Erwinia sp.; a Khuẩn lạc Ecc; b Vi khuẩn Ecc; c SEM Ecc Hình 3.14 Trình tự đoạn gen 16S rRNA 3.4.2 Khả kháng khuẩn chitosan điều kiện in vitro Sản phẩm chitosan từ mai mực Loligo sp có độ deacetyl 91,3% khối lượng phân tử Mw 6338 kDa tiến hành cắt mạch H2O2 Kết quả, thu loại chitosan có khối lượng phân tử 6338, 1740, 655 138 kDa 20 Hình 3.15 (a) Khả kháng khuẩn S-655 (b) S-138 nồng độ khác C-120 chitosan thương mại với Mw là120 kDa Kết cho thấy β-chitosan có khả ức chế phát triển Ecc tăng lên có khối lượng phân tử (Mw) thấp nồng độ cao Hiệu ức chế 100% khả phát triển Ecc đạt chitosan có Mw khoảng 138-655 kDa nồng độ 1,25 1,5% So với mẫu chitosan thương mại hiệu kháng khuẩn Ecc đạt 100% nồng độ 1,25% (Hình 3.15) Hình 3.16 biểu diễn hình ảnh chụp kính hiển vi truyền qua TEM vi khuẩn Erwinia sp xử lý 1% chitosan (S-138) hòa tan CH3COOH 1% (w/v) thời gian 60 phút Kết cho thấy chitosan gắn lên bề mặt tế bào sau 15 phút (Hình 3.13b), sau màng tế bào bị phá vỡ, rò rỉ chất tế bào quan sát (Hình 3.13c) cuối cùng, bề mặt tế bào vi khuẩn Erwinia sp dần bị phá hủy hoàn toàn sau 60 phút tế bào trở nên mờ dung dịch chitosan sau 30 phút Hình 3.16 Hình TEM vi khuẩn Erwinia sp xử lý dung dịch β-chitosan 1% (S-138) 60 phút (a) Vi khuẩn Erwinia sp (b) xử lý sau 15 phút; (c) xư lý sau 30 phút; (d) kết sau 60 phút 21 3.4.3 Khả kháng khuẩn chitosan điều kiện in vivo Kết cho thấy khả kháng bệnh không hiệu tương tự với mẫu đối chứng sử dụng chitosan có Mw 1740 kDa để xử lý với nồng độ 0,2, 0,4 0,6 wt.% Tuy nhiên, sử dụng chitosan S-655 nồng độ 0,6% có khả hạn chế q trình phát triển bệnh, kích thước vết bệnh bên bên nhỏ so với mẫu đối chứng Khi sử dụng chitosan S-138 tất nồng độ 0,6; 1,5% có khả hạn chế q trình phát triển bệnh Khả kiểm soát bệnh thối nhũn chitosan từ mai mực có khối lượng phân tử 138 kDa (S-138) chitosan thương mại Sigma (C-120) có khả hạn chế tốt phát triển bệnh thối nhũn vi khuẩn Erwinia sp trái cà chua sau thu hoạch, kích thước vết bệnh nhỏ nhiều so với mẫu đối chứng tất nồng độ theo thời gian thử nghiệm Tuy nhiên, khác biệt lớn khả kháng bệnh loại chitosan 138 kDa chitosan thương mại Hình 3.17 Tổng hàm lượng phenol trái cà chua sau xử lý loại chitosan có phân tử lượng khác sau thời gian 24 72 Kết đánh giá tổng hàm lượng phenol trái cà chua sau xử lý loại chitosan có khối lượng phân tử khác theo thời gian 24 72 cho thấy trái cà chua sau thu hoạch sau xử lý chitosan có hàm lượng phenolic cao mẫu đối chứng mẫu chitosan có khối lượng thấp hàm lượng phenolic trái cà chua tăng (Hình 3.17) Kết nghiên cứu cho thấy chitosan việc tiếp xúc trực tiếp tiêu diệt vi khuẩn Erwina sp chitosan có khả kích kháng hệ thống đề kháng thân trái cà chua, gia tăng hàm lượng phenolic làm sở gia tăng đề kháng, gia cố vách tế bào để chống lại phá hoại vi khuẩn gây bệnh Kết phù hợp với số kết báo cáo cơng bố 22 3.4.4 Đề xuất quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch dung dịch chitosan từ mai mực Loligo sp Từ kết nghiên cứu mục 3.4.1; 3.4.2 3.4.3 cho phép đề xuất quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch dung dịch chitosan nhằm hạn chế bệnh thối nhũn vi khuẩn Erwinia sp mô tả Hình 3.33 Acid acetic 1% Cà chua sau thu hoạch rửa sạch, để Chitosan Pha dung dich chitosan 1-1,5% Phủ dung dịch chitosan xung quanh trái cà chua Để khô, tạo thành lớp màng chitosan Bảo quản Hình 3.33 Quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch chitosan - Chuẩn bị trái cà chua: Trái cà chua sau thu hoạch rửa sạch, để - Chuẩn bị dung dịch chitosan: Chitosan có khối lượng phân tử 138 kDa hòa tan dung dịch acid acetic 1% nồng độ 1-1,5%, sau dung dịch chitosan chuẩn pH 5-5,5 dung dịch NaOH 5% - Xử lý dung dịch chitosan lên trái cà chua: Trái cà chua sau xử lý phủ dung dịch chitosan cách cho trái cà chua lăn qua băng chuyền có chứa dung dịch chitosan thời gian từ đến 10 giây Sau đó, trái cà chua để nhiệt độ phòng - Sau xử lý chitosan, trái cà chua đưa bảo quản khác kho đóng thùng vận chuyển đến nơi tiêu thụ 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu cho phép rút số kết luận sau: Đã xác định thành phần hóa học nguồn phế liệu mai mực Loligo sp thải sau trình chế biến Trong đó, hàm lượng -chitin 35,8% so với hàm lượng mai mực khô tuyệt đối Đặc biệt, hàm lượng khống thấp (1,38%) khơng chứa kim loại nặng (Hg, Pb, As) Vì vậy, mai mực ống nguồn nguyên liệu tốt để thu nhận chitin có độ tinh khiết cao Đã đề xuất điều kiện thu nhận -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại từ mai mực ống Trong đó, mai mực xử lý dung dịch NaOH 4% nhiệt độ 80C thời gian 10 với tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1/10 (w/v), sản phẩm -chitin thu có hàm lượng protein lại < 1% hàm lượng khống khơng phát Qui trình thu nhận bỏ qua bước khử khoáng acid HCl Điều hạn chế trình cắt mạch chitin xảy xử lý với dung dịch acid Đã đề xuất điều kiện deacetyl thu nhận chitosan từ -chitin Trong đó, chitin xử lý lần dung dịch NaOH 50% nhiệt độ 80C thời gian với tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1/10 (w/v), sau mẫu rửa trung tính, mẫu tiếp tục xử lý lần môi trường NaOH 50% nhiệt độ 80C thời gian Sản phẩm chitosan thu đạt tiêu chuẩn thương mại với độ deacetyl 91,3% khối lượng phân tử 6831 kDa Đã đánh giá khả kháng khuẩn chitosan từ mai mực ống vi khuẩn Erwinia sp - Ở điều kiện in vitro, chitosan với độ deacetyl cao khối lượng phân tử thấp (< 655 kDa) có khả kháng khuẩn tốt Trong đó, chitosan có độ deacetyl 91,3% khối lượng phân tử 138 kDa nồng độ 1,25% dung dịch acid acetic 1% (w/v) cho kết kháng khuẩn tốt - Khi tiến hành khảo sát in vivo, chitosan có khối lượng phân tử 138 kDa với nồng độ 0,6% hạn chế hiệu phát triển bệnh thối nhũn trái cà chua KIẾN NGHỊ Trên sở nghiên cứu thực hiện, cần tiếp tục: Tiến hành đánh giá khả kháng khuẩn chitosan từ mai mực ống khối lượng phân tử nhỏ nhiều đối tượng vi khuẩn nấm gây hại rau sau thu hoạch Nghiên cứu chế tạo màng chitin chitosan từ sản phẩm ứng dụng bao gói thực phẩm Do chitosan thu có khối lượng phân tử lớn 24 ... nông sản sau thu hoạch nhà khoa học quan tâm Do vậy, luận án tiến hành "Nghiên cứu thu nhận đánh giá khả kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn cà chua sau thu hoạch chitosan từ mai mực ống" thực... luận án: Nghiên cứu thu nhận đánh giá khả kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn cà chua sau thu hoạch chitosan từ mai mực ống Ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số: 62540105 Nghiên cứu sinh:... pH sinh lý 1.3 BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH DO VI KHUẨN Bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại nông sản sau thu hoạch chủ yếu vi khuẩn Erwinia spp gây Chi Erwinia spp thu c họ Enterobacteria