Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)

Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN TẠO ĐỂ LÂY NHIỄM VIRUS GÂY BỆNH XOĂN VÀNG LÁ CÀ CHUA

Mã số: ĐH2013-TN06-08

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Hải Yến

Thái Nguyên, tháng 2/2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN TẠO ĐỂ LÂY NHIỄM VIRUS GÂY BỆNH XOĂN VÀNG LÁ CÀ CHUA

ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

1 TS Nguyễn Thị Hải Yến Trường Đại học Khoa học, Đại học

Nội dung phối hợp nghiên

cứu Họ và tên người đại diện Khoa Khoa học

Sự sống, Trường

Đại học Khoa học

Tiến hành các thí nghiệm về lây nhiễm thông qua bọ phấn và ghép ở trong vườn thí nghiệm

PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh

Chương 1 MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, CÁCH TIẾP CẬN

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3

1.4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu 7

1.4.2.3 Phương pháp lây nhiễm bằngAgroinoculation 10 1.4.2.4 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ biểu hiện bệnh 12 1.4.2.5 Phương pháp phân tích sự có mặt của TYLCV 13

2.1.1 Giới thiệu về cây cà chua và một số bệnh hại cà chua 14

2.1.2 Virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua 18

1.1.2.3 Đặc điểm hình thái và cấu tạo 19 1.1.2.4 Đặc điểm lây lan và môi giới truyền bệnh 20 1.1.2.5 Một số biện pháp phòng bệnh xoăn vàng lá cho cà chua 23 2.1.3 Các phương pháp lây nhiễm TYLCV trong thực nghiệm 23

2.3.1.1 Kết quả lây nhiễm virus trong vườn có nguồn bệnh 26 2.3.1.2 Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của virus trên cây bệnh 34 2.3.2 Kết quả lây nhiễm TYLCV cho cà chua bằng bọ phấn 37 2.3.3 Kết quả lây nhiễm TYLCV bằng phương pháp ghép cây lành với

Bảng Tên bảng Trang

1.1 Nồng độ các hoá chất trong dung dịch đệm tách DNA tổng số 24 1.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen từ mẫu DNA tổng số 26 2.1 Kết quả tạo nguồn bệnh trong vườn có áp lực bệnh cao 27

2.2 Kết quả theo dõi mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua

sau lây nhiễm qua bọ phấn

31

2.3 Kết quả theo dõi mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua

sau lây nhiễm bằng ghép áp

33

2.4 Kết quả giá trị OD ở bước sóng 660 nm của các chủng khuẩn sau

nuôi lắc phục vụ thí nghiệm lây nhiễm

35

2.5 Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh sau lây nhiễm TYLCV bằng

Agro- inoculation vào các giống cà chua

36

2.6 Tổng hợp kết quả theo dõi biểu hiện bệnh trung bình của thí

nghiệm lây nhiễm TYLCV vào cây cà chua bằng 3 phương pháp

38

Hình Tên hình Trang

1.2 Các mức độ biểu hiện bệnh xoăn vàng lá cà chua 24

2.2 Chu kỳ sinh trưởng của bọ phấn (Bemisia tabaci) 11 2.3 Hình ảnh cây cà chua bị bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV trồng

tại vườn có nguồn bệnh sau 50 ngày

2.6 Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV kiểm tra sự có mặt của

virus trong các dòng cây thí nghiệm sau lây nhiễm bằng bọ phấn

32

2.7 Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV kiểm tra sự có mặt của

virus trong các dòng cây thí nghiệm sau lây nhiễm bằng phương

pháp ghép

34

2.8 Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra TYLCV sau 10 ngày lây

nhiễm bằng Agro- inoculation

37

2.9 Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra TYLCV sau 50 ngày lây

nhiễm bằng Agro- inoculation

37

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh

DNA Axit Deoxyribonucleic Deoxyribonucleic Acid

Acid

ORF trình tự đọc mở Open reading frame

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction

SCR vùng vệ tinh Satelite Conserved Region

TYLCV Virus gây bệnh xoăn vàng lá

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Đơn vị: Trường Đại học Khoa học

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Thông tin chung

- Tên đề tài: “Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua”

- Mã số: ĐH2013-TN06-08

- Chủ nhiệm: TS Nguyễn Thị Hải Yến

- Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Khoa học

- Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2013-12/2014

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm được phương pháp lây nhiễm virus TYLCV phù hợp để lây bệnh cho cà chua nhằm tạo phương pháp chuẩn để đánh giá khả năng kháng virus này cho cà chua trong điều kiện nhà lưới và vườn thí nghiệm

3 Tính mới và sáng tạo:

(1) Đánh giá khả năng lây nhiễm TYLCV thông qua một số phương pháp như ghép áp, thông qua bọ phấn và thông qua vi khuẩn Đây là công trình đầu tiên đã thử nghiệm các phương pháp lây nhiễm virus nhân tạo để xác định phương thức lây nhiễm hiệu quả nhất

(2) Đề xuất được quy trình lây nhiễm TYLCV để đánh giá khả năng kháng virus cho cà chua

4 Kết quả nghiên cứu

(1) Thu thập giống cà chua phục vụ thí nghiệm:

+ Giống PT 18 do viện rau quả Việt Nam cung cấp Cà chua PT18 có chiều cao trung bình 80 – 100 cm, dạng cây gọn, màu lá xanh nhạt, phân cành ít, sinh trưởng hữu hạn PT18 là giống khá mẫn cảm với bệnh xoăn vàng lá do TYLCV

GM - 2008 có dạng tròn dẹt, chín có màu đỏ tươi, thịt dày, rắn chắc F1 GM -

2008 sinh trưởng hữu hạn, chịu lạnh và nóng rất tốt, giống F1 GM2008 được lai tạo theo hướng kháng bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV

+ Giống DV 2962 là giống lai F1 có nguồn gốc từ Ấn Độ DV 2962 có biên độ thích ứng rộng, sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ 17o

C – 32oC thuộc loại hình sinh trưởng bán hữu hạn, sinh trưởng khoẻ Cây cao trung bình từ 110 – 130 cm, nhiều hoa, sai quả, được chọn tạo theo hướng kháng virus TYLCV

+ Dòng cà chua PT18 chuyển gen kháng TYLCV được tạo ra từ đề tài luận án

TS “Nghiên cứu tạo cây cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá cà chua bằng kỹ thuật chuyển gen” của chủ nhiệm đề tài

(2) Tạo được 63 dòng cây bị bệnh trong tổng số 75 cây trồng trong vườn có áp lực bệnh cao Các dòng cây bệnh đã được kiểm tra sự có mặt của TYLCV bằng phương pháp PCR với cặp mồi pRV 324N/pRC889N

(3) Đã tiến hành lây nhiễm thành công virus TYLCV trên 3 giống cà chua PT18,

GM - 2008, DV - 2962 bằng 3 phương pháp : (i) phương pháp ghép áp giữa cây

lành với cây bệnh, (ii) phương pháp nuôi thả bọ phấn, (iii) Lây nhiễm bằng Agro

- inoculation

(4) Đã đề xuất 01 quy trình lây nhiễm nhân tạo virus TYLCV cho cà chua phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm là phương pháp ghép áp giữa cây lành với cây bệnh, có thể áp dụng trong thực nghiệm để đánh giá khả năng kháng virus TYLCV của các giống cà chua

5 Sản phẩm:

5 c

Nguyễn Thị Hải Yến, Nguyễn Văn Quang (2016), “Nghiên cứu một số phương

pháp lây nhiễm virux gây bệnh xoăn vàng lá cà chua”, Tạp chí Khoa học và

Công nghệ - ĐHTN, 149(4), 11-15

Đào tạo thạc sĩ:

Nguyễn Văn Quang (2015), Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây

nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua, Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh

học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên

Đào tạo cử nhân:

(1) Nguyễn Thị Bình (2014), Sử dụng phương pháp ghép áp để lây nhiễm virus

gây bệnh xoăn vàng lá cà chua, Đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học, Trường

Đại học Khoa học –Đại học Thái Nguyên

(2) Triệu Văn Huy (2014), Sử dụng phương pháp Agroinoculation để lây nhiễm

virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua, Khóa luận tốt nghiệp đại học, Trường Đại

học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

5.3 ứ g dụ g:

Đã đề xuất 01 quy trình lây nhiễm nhân tạo virus TYLCV cho cà chua phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm, có thể áp dụng trong thực nghiệm để đánh giá khả năng kháng virus TYLCV của các giống cà chua

6 Phương thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ích đem lại của kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu của đề tài là thông tin khoa học hữu ích cho sinh viên, học viên cao học học tập, nghiên cứu Là cơ sở cho các Viện nghiên cứu, trung tâm giống sử dụng để triển khai nghiên cứu đánh giá cây kháng virus được tạo ra trong các chương trình chọn giống Từ đó thúc đẩy hợp tác nghiên cứu khoa học với các cơ sở khác

1 General information:

- Project title: A number of method research to infect tomato yellow leaf curl virus

- Code number: DH2014-TN06-08

- Coordinator: Dr Nguyen Thi Hai Yen

- Implementing institution: College of sciences

- Duration: from January 2013 to December 2014

2 Objective:

Research the best methods to infect TYLCV for tomato plant Since then proposed standard method to assess the ability of this virus resistant tomatoes in a greenhouse and garden conditions experiments

3 Creativeness and innovativeness:

1) Assessment ability TYLCV infection through a number of methods such as grafting pressure, via whitefly and through bacteria This is the first project tested methods of artificial virus infection to determine the most effective method of infection;

2) Recommended by TYLCV infection process to evaluate viral resistance to tomato;

4 Research results:

(1) Tomato varieties collected for experiments:

- PT 18 varieties of vegetables by the Vietnam Institute offers PT18 is quite susceptible varieties curly gold leaf by TYLCV

- GM 2008 varieties was bred towards resistance to TYLCV

- DV 2962 varieties are F1 hybrids, which is bred in the direction of antiviral TYLCV

- Transgenic tomato lines PT18 TYLCV resistance generated from the thesis Dr Nguyen Thi Hai Yen

(2) Created 63 lines of 75 diseased plants in the garden have high disease pressure The tree line patients were examined in the presence of TYLCV by PCR with primers

PRV 324N / pRC889N

(3) Conducted a successful infection TYLCV virus on tomato varieties PT18, GM2008, DV2962 by three methods: (i) grafting pressure between wide type tomato with tomato carrying TYLCV, (ii) insect feeding method chalk, (iii) infection by Agro

- inoculation

laboratory conditions is grafting pressure between healthy trees with sick trees, can be applied in experiments to evaluate viral resistance TYLCV of tomatoes

5 Products:

5.1 Journal papers

Nguyen Thi Hai Yen, Nguyen Van Quang (2016), “A number of method research to

infect tomato yellow leaf curl virus”, Journal of Science and Technology, Thainguyen

University, VietNam 149(4), pp 11- 16

5.2 Education

Master education

Nguyen Van Quang (2015), Research a number of method research to infect tomato

yellow leaf curl virus, The Biotechnological master thesis, Thai Nguyen University of

Scienses

Graduate education

Nguyen Thi Binh (2014), Using grafting pressure infecting tomato yellow leaf curl

virus, The Research science students, Thai Nguyen University of Scienses

Trieu van Huy (2014), Using Agroinoculation infecting tomato yellow leaf curl virus,

The Biotechnological graduate thesis, Thai Nguyen University of Scienses

5.3 In terms of application

One procedures proposed artificial virus infects tomatoes suitable TYLCV in laboratory conditions is grafting pressure between wide type tomato with tomato carrying TYLCV, can be applied in experiments to evaluate viral resistance TYLCV of tomatoes

6 Transfer alternatives, application institutions, impacts and benefits of research results:

The results of this reference is good for students, graduate students study, study Recommend 01 processes infecting tomato yellow leaf curl virus Research results are the basis for the research institute, the center used to evaluate varieties resistant to the tomato virus Thereby encouraging scientific research cooperation with other institutions

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của vấn đề nghiên cứu

Cà chua (Lycopersicon esculentum) là loại rau quả được trồng phổ biến

hiện nay, quả cà chua chín giàu dinh dưỡng và vitamin, được con người sử dụng thường xuyên Cà chua dễ trồng, chi phí đầu tư ban đầu thấp, là loại cây thích ứng với nhiều điều kiện sinh thái khác nhau, thời gian từ khi trồng đến thu hoạch ngắn, do vậy có thể mở rộng sản xuất ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới

Cũng như các cây trồng khác, các giống cà chua đang trồng ở trên thế giới và Việt Nam bị tấn công bởi các loại sâu bệnh như nấm, côn trùng, vi khuẩn và đặc biệt là virus Trong số bệnh virus hại cà chua ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV gây nên được xem là bệnh gây hậu quả nghiêm trọng nhất [17], [21] Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá trên

cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có khi

tới 100% TYLCV là loài virus thuộc chi Begomovirus, họ Geminividae và

chúng chỉ truyền nhiễm vào cây thông qua vector truyền bệnh là bọ phấn

Bemisia tabaci một cách nhanh chóng và liên tục dẫn đến bùng phát thành

dịch bệnh [7], [9] Sự kiểm soát bệnh TYLCV ở các vùng trồng cà chua chú trọng chính vào sự kiểm soát bọ phấn bằng các loại thuốc hóa học tiêu diệt côn trùng hoặc các bẫy bắt, các rào cản vật lý như lưới chắn bọ phấn… Tuy nhiên, các phương pháp kiểm soát bệnh TYLCV vừa nêu gây tốn kém về kinh phí và sức lực con người trong sản xuất, hơn nữa còn gây ô nhiễm môi trường

và tích lũy độc tính trong quả [26]

Biện pháp hiệu quả nhất để phòng chống virus là sử dụng giống kháng Trong thực tế, các giống tự nhiên kháng virus rất hạn chế, vì vậy các nhà khoa học đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen để tạo các giống có khả năng kháng virus gây bệnh xoăn vàng lá để đưa vào sản xuất Trong quy trình tạo

giống kháng thì việc đánh giá khả năng kháng cho dòng, giống mới lai tạo là rất quan trọng TYLCV không lây lan qua va chạm cơ học mà chỉ lây lan thông qua môi giwois truyền bệnh là bọ phấn Dựa trên đặc điểm lan truyền của TYLCV, các nhà khoa học cũng đã áp dụng một số phương pháp để lây nhiễm TYLCV cho cà chua như lây nhiễm thông qua nuôi thả bọ phấn, tuy nhiên vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu một cách hệ thống

Xuất phát từ thực tiễn và cơ sở lý luận trên chúng tôi thực hiện nghiên

cứu đề tài là “Ng iê cứu ột số ươ g á â tạ để lây iễ virus gây bệ x ă và g lá cà c u ” Nhằm phục vụ trong nghiên cứu, đánh giá

khả năng kháng virus TYLCV ở cà chua

2 Những đóng góp khoa học của đề tài

Xác định được phương pháp lây nhiễm virus TYLCV cho cà chua trồng trong điều kiện nhà lưới và vườn thí nghiệm, nhằm tạo phương pháp chuẩn để đánh giá khả năng kháng virus này cho cà chua

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài là thông tin khoa học hữu ích cho sinh viên, học viên cao học học tập, nghiên cứu Là cơ sở cho các Viện nghiên cứu, trung tâm giống sử dụng để triển khai nghiên cứu đánh giá cây kháng virus được tạo ra trong các chương trình chọn giống Từ đó thúc đẩy hợp tác nghiên cứu khoa học với các cơ sở khác

Chương 1 MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, CÁCH TIẾP CẬN VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

(4) Đề xuất được ít nhất 01 quy trình lây nhiễm TYLCV cho cà chua có thể sử dụng

để đánh gái khả năng kháng virus cho các chương trình chọn giống cà chua kháng

1.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

1.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các dòng cà chua kháng và mẫm cảm với TYLCV, các dòng virus TYLCV trong tự nhiên và được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền

1.2.2 Vật liệu thực vật

(1) Giống cà chua PT18

Cà chua PT18 có chiều cao trung bình 80 - 100cm, dạng cây gọn, màu

lá xanh nhạt, phân cành ít, sinh trưởng hữu hạn (100 - 120 ngày), kháng bệnh khá, nhất là bệnh héo xanh vi khuẩn PT18 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong mùa khô dưới nhiệt độ 21 – 25oC Thời vụ gieo hạt thích hợp nhất là tháng 9 - 10 Cà chua PT18 trồng được cả 3 vụ (vụ sớm, vụ chính và vụ muộn) Đây là giống khá mẫn cảm với bệnh xoăn vàng lá do TYLCV

(2) Giống cà chua F1 GM – 2008

Giống cà chua F1 GM – 2008 là giống nhập nội có nguồn gốc từ Pháp

Quả của F1 GM – 2008 có dạng tròn dẹt, chín có màu đỏ tươi, thịt dày, rắn

chắc F1GM 2008 sinh trưởng hữu hạn, chịu lạnh và nóng rất tốt, có thể trồng

sớm ngay từ tháng 7, nhanh thu hoạch Đây là giống lai tạo theo hướng kháng

bệnh héo xanh và xoăn lá

(3) Giống cà chua DV 2962

DV 2962 là giống cà chua lai F1 có nguồn gốc từ Ấn Độ DV 2962 là

giống cà chua có biên độ thích ứng rộng, sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ

17 – 32oC, thích hợp cho ăn tươi và chế biến công nghiệp Giống thuộc loại hình

sinh trưởng bán hữu hạn, sinh trưởng khoẻ Cây cao trung bình từ 110 - 130 cm,

nhiều hoa, sai quả DV 2962 có khả năng chống chịu tốt một số bệnh nguy

hiểm như héo xanh, mốc sương, xoăn lá do virus

(4) Cà chua dại mang virus TYLCV thu thập ở vườn có áp lực bệnh cao Sử

dụng trong lây nhiễm bằng bọ phấn và ghép áp để lây nhiễm TYLCV

1.2.3 Chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA404 mang vector

PCAMBIA 2300 chứa genome TYLCV do bộ môn bệnh cây nhiệt đới,

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp gồm 2 dòng: A tumefaciens

LBA404/2300/TY (chứa đầy đủ vòng DNA – A của TYLCV) và A

tumefaciens LBA404/2300/β (chứa vòng DNA vệ tinh β của TYLCV) Chủng

vi khuẩn này có đặc tính kháng rifamycin và kanamycin

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 PGV2260 do Phòng

Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm khoa

học và Công nghệ Việt Nam cung cấp

1.2.4 Hoá chất, thiết bị máy móc

(1) Hoá chất

Sodium chloride (NaCl), Tris – HCl, EDTA, CTAB, sorbitol, sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4), chloroform (CHCl3), isoamyl alcohol ((CH3)2CHCH2CH2OH), ethanol (C2H5OH) Taq polymerase, dNTPs (dATP,

dCTP, dGTP, dTTP), buffer PCR, MgCl2, mồi xuôi (Forward primer), mồi

ngược (Reverse primer), agarose, TAE, glycerol, bromophenol blue, thang

DNA chuẩn (Fermentas) – DNA marker, ethydium bromide (EtBr), glucose, Tris – base, NaOH, SDS, CH3COOK, MES, AS, bacto – tryptone, yeast extract, bacto – agar, kanamycin, rifamycin, cồn 90o

(2) Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

Các thiết bị, dụng cụ thuộc phòng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sống

trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên gồm: máy ly tâm lạnh (Hettich -

Germany), box cấy (Nuaire - USA), máy lắc (Korea), máy soi gel (Wealtec - USA), bộ điện di (USA), máy vortex (CLP - USA), máy đo quang phổ, máy PCR (Applied Biosystems), máy đo pH (Martini - Rumani), tủ lạnh - 20 – 4o

C (Fiochetti - Italy), cân điện tử (Sartorius), lò vi sóng (Sharp - Japan), bể ồn nhiệt (Joiotech), nồi hấp vô trùng, máy cất nước, pipetman (Hettich - Germany), đầu côn các loại, ống Eppendorf, ống fancol, cối chày sứ, bơm kim tiêm y tế, bình tam giác (loại 100, 250, 500 ml), cốc đong, ống đong, gang tay cao su, đũa thủy tinh

Ngoài ra trong đề tài còn sử dụng các dụng cụ, thiết bị khác như lọ penicilin, bông, kéo, găng tay y tế, xi lanh tiêm, lồng lưới, chậu trồng cây, dao

lam, băng dính y tế, giấy bạc, đũa inox, bình xịt thuốc sâu

1.3 PHẠM VI VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

bệnh và (3) lây nhiễm bằng Agro-inoculation So sánh, phân tích để tìm ra phương pháp phù hợp để đề xuất quy trình lây nhiễm TYLCV chủng Việt Nam cho cà chua

1.3.2 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm phân lập gen được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học, Khoa Khoa học Sư sống, Trường Đại học Khoa học và tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gen, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

1.4 CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.4.1 Cách tiếp cận nghiên cứu

Nghiên cứu phương pháp lây nhiễm TYLCV nhân tạo cho cà chua được thực hiện theo các cách tiếp cận sau: (1) Phương pháp lây nhiễm thông qua môi giới trung gian là bọ phấn và ghép cây bệnh được tiếp cận dựa theo đặc điểm sinh trưởng, đặc tính lây nhiễm của virus TYLCV trong cây chủ (2) Phương pháp Agro-inoculation được tiếp cận theo hướng sinh học phân tử

1.4.2 Phương pháp nghiên cứu

THU THẬP GIỐNG

TẠO NGUỒN BỆNH

LÂY NHIỄM VIRUS

KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ

ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH LÂY NHIỄM

Phương pháp ghép Phương pháp Agroinoculation

PCR nhân gen virus

Phương pháp nuôi thả bọ phấn

Theo dõi biểu hiện

Hình 1.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

1.4 2 P ươ g á lây iễ bằ g b ấ

Gieo hạt và cách li cây sau nảy mầm, sau đó tiến hành lây nhiễm bọ phấn, tiến hành thả 10 -20 cá thể bọ phấn cùng với cây bệnh trong lồng cách li Nuôi cộng sinh trong 48 giờ, tiến hành phun thuốc diệt côn trùng để diệt bọ phấn Sau lây nhiễm 10 ngày, tiến hành thu lá để tách DNA kiểm tra gen virus trong các dòng lây nhiễm bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu Theo dõi biểu hiện bệnh sau

50 ngày sau nuôi thả bọ phấn, tiến hành thu lá tách DNA kiểm tra gen virus

1.4.2.2 P ươ g á lây iễ bằ g g é á

Phương pháp ghép áp cây cà chua bình thường với cây cà chua đã biểu hiện bệnh gồm các bước như sau:

Bước 1: Chuẩn bị cây bệnh ở mức độ 3 hoặc 4 Trồng cây ở vườn có áp lực bệnh cao có nguồn bọ phấn trắng để tạo cây bệnh

Bước 2: Gieo hạt cà chua thí nghiệm và cách ly cây sau nảy mầm để tạo nguồn cây sạch bệnh phục vụ thí nghiệm

Bước 3: Tiến hành ghép áp: sau khi cây con cao khoảng 15 cm khỏe mạnh tiến hành ghép áp với cây bệnh và cách li trong lồng cách li

Phương pháp ghép: Tiến hành trồng các cây cà chua bình thường vào chậu thí nghiệm Sau khi cây đạt chiều cao khoảng 30 - 35 cm thì mang đi ghép với cây bệnh đã được chuẩn bị trước Dùng dao lam sắc cắt vát 1 miếng nhỏ (dài 1,5 - 2 cm rộng 0,4- 0,5cm) vừa chạm vào lớp gỗ của cây ở vị trí gần ngọn chỗ cành non của cây Sau đó, dùng băng dính y tế buộc chặt hai mặt cắt của 2 cây sao cho hai mặt cắt của thân cây áp vào nhau là được Khi ghép xong phun sương lên toàn bộ cây và chụp lồng cách li

Bước 4: Theo dõi biểu hiện bệnh sau 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ngày Bước 5: Sau 50 ngày theo dõi tiến hành thu lá tách DNA kiểm tra gen virus

1.4 2 3 P ươ g á lây iễm bằng Agro - inoculation

(1) Gieo hạt và trồng cây thí nghiệm

(2) Cách ly cây sau nảy mầm bằng lồng cách ly

(3) Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: nuôi lắc các dòng khuẩn lây nhiễm C58/PC2300/TY (PCAMBIA 2300 mang vòng DNA – A genome TYLCV)

và C58/PC2300/β (PCAMBIA 2300 mang vòng DNAβ vệ tinh của TYLCV) riêng biệt trên môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin và rifamycin, sau đó ly tâm thu cặn tế bào vi khuẩn và hòa từng dòng khuẩn vào dung dịch lây nhiễm (MgCl2 10 mM, MES 10 mM, AS 100 µM, H2O), cuối cùng trộn hai dòng khuẩn này lại với nhau với tỷ lệ 1 : 1, để ở nhiệt độ phòng

1 – 2 giờ rồi tiến hành tiêm cho các cây cà chua thí nghiệm

(4) Tiến hành lây nhiễm bằng tiêm: Sau khi cây con cao khoảng 10 cm khỏe mạnh, tiến hành tiêm khoảng 5 ml/cây (OD dịch khuẩn 0,5 – 1) Lặp lại thí nghiệm 3 lần, mỗi lần cách nhau 10 ngày

Phương pháp quang phổ hấp thụ (đo quang phổ - đo OD)

Dung dịch tế bào vi khuẩn được đo OD bằng máy quang phổ ở bước sóng 660 nm (OD660) Khi độ OD660 = 0,5 – 1 thì dịch khuẩn có thể dùng cho thí nghiệm lây nhiễm ở trên (mục 2.2.3)

DNA được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm Nồng độ DNA được tính theo công thức:

Nồng độ DNA (ng/µl) = OD260 × 50 × hệ số pha loãng

Độ sạch DNA = OD260/OD280

Trong đó: OD260 là chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm, OD280 là chỉ số

đo được ở bước sóng 280 nm

Nếu tỷ lệ OD260/OD280 = 1,8 – 2,0 thì DNA đó là tinh sạch

1.4.2.4 Các c ỉ tiêu đá giá ức độ biểu iệ bệ

Để xác định các mức độ biểu hiện bệnh chúng tôi căn cứ theo tiêu chí Lapidot và Friedman đƣa ra năm 2002 Theo tác giả, biểu hiện bệnh xoăn vàng

có biểu hiện vàng nhẹ ở mép lá

2: Lá vàng và xoăn nhẹ ở mép lá

3: Lá vàng, xoăn và cụp xuống đồng thời kích thước bị thu nhỏ lại

4: Lá xoăn, kích thước lá thu nhỏ nhiều, cây cằn cỗi và ngừng sinh trưởng

Hình 1.2 Các mức độ biểu hiện bệnh xoăn vàng lá cà chua

1.4.2.5 P ươ g á â tíc sự có ặt củ virus TYLCV

Thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số

a, Thu thập và bảo quản mẫu

Dùng găng tay và kéo đã khử trùng bằng cồn, cắt lấy những lá non của các cây thí nghiệm nghi nhiễm bệnh xoăn vàng do TYLCV (thu mẫu vào thời điểm khô ráo) Các mẫu lá sau khi thu đƣợc bảo quản trong bình thuỷ tinh có chứa các hạt silica gel hút ẩm và bảo quản nơi khô ráo trong điều kiện nhiệt độ phòng

b, Tách chiết DNA tổng số các mẫu lá

Bảng 1.1 Nồng độ các hoá chất trong dung dịch đệm tách DNA tổng số

Để tách chiết DNA tổng số của các mẫu cà chua chúng tôi tiến hành pha dung dịch đệm tách với nồng độ các chất theo công thức (Bảng 1.1)

Tách DNA của mẫu cà chua nghi nhiễm TYLCV sử dụng phương pháp dùng CTAB với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [12]

Các bước tiến hành

(1) Nghiền 0.5g mẫu lá trong nitơ lỏng trong ống eppendorf 2 ml thành dạng bột mịn sau đó bố sung nhanh vào mỗi ống 600 µl dung dịch đệm tách (Bảng 2.1), đảo đều ủ ở 65 oC trong 1 giờ 45 phút

(2) Thêm hỗn hợp cloroform : isoamylalcohol (24 : 1) với tỷ lệ tương đương về thể tích với mẫu, trộn đều 10 phút đến khi dung dịch màu sữa Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 oC, thu dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml vô trùng

(3) Thêm isopropannol với tỷ lệ tương đương về thể tích với mẫu, trộn nhẹ, để tủ lạnh -20oC khoảng 30 phút

(4) Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ dịch, úp ống eppendorf xuống giấy cho khô, thu tủa DNA sau đó rửa DNA bằng cồn 70o

(5) Rửa tủa DNA bằng cách bổ sung 300 µl cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ cồn (bước này lặp lại 2 lần)

(6) Làm khô DNA bằng cách để trong box bật quạt

(7) Hòa tan DNA trong 50 µl nước khử ion, vô trùng

(8) Kiểm tra DNA tổng số bằng phương pháp điện di hoặc đo quang phổ

Phương pháp điện di trên gel agarose

(1) Chuẩn bị gel agarose 0,8%: Hòa 0,8g agarose trong 100ml dung dịch đệm TAE 1X, đun sôi cho agarose tan hoàn toàn bằng lò vi sóng Để nhiệt độ hạ xuống còn khoảng 50 – 60o C, đổ dung dịch agarose vào khuôn điện di đã gài sẵn răng lược thích hợp Sau 30 – 60 phút, khi gel đã đông, đặt gel vào hộp điện

di Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel 1 – 2 mm

(2) Tra mẫu: trộn một lượng mẫu DNA thích hợp với khoảng 1,5 – 3 µl đệm tra mẫu (20% Glyxerol; 100 mM Tris – HCl, pH = 8,0; 10 mM EDTA, pH

= 8; 0,25% Bromophenol blue) Tra vào các giếng nhỏ trên gel

(3) Tiến hành điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 80 – 120 V với thời gian từ 20 – 30 phút DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương, quan sát sự di chuyển bằng màu xanh của bromophenol blue

(4) Nhuộm gel bằng EtBr: bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,1 µl/ml trong 10 phút, sau đó rửa sạch gel bằng nước

(5) Quan sát và chụp ảnh: gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm trên máy soi DNA Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng Ảnh điện di được chụp bằng máy chụp ảnh

Phương pháp PCR nhân gen của TYLCV

Để phân lập gen CP và vòng DNA-A của TYLCV, chúng tôi sử dụng cặp mồi đa dụng pRV 324N/pRC889N [37] và sử dụng thành phần của phản ứng PCR như bảng 2.2

Bảng 1.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen TYLCV từ mẫu DNA tổng số

ứng PCR nhân đoạn DNAβ vệ tinh là: 94o

C – 3 phút; [94oC – 1 phút, 52oC – 1 phút, 72oC – 1 phút 30 giây]30 chu kỳ; 72oC – 10 phút, 4oC –  Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8 %, nhuộm bản gel trong ethidium bromide Sau

đó soi và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím của máy soi gel

Chương 2 NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

2.1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

2.1.1 Giới thiệu về cây cà chua và một số bệnh hại cà chua

2.1.1.1 Nguồ gốc và p â l ại

Cà chua (Lycopersicon esculentum L.) có bộ nhiễm sắc thể 2n = 24 và đa

số chúng là cây tự thụ phấn Cà chua có nguồn gốc từ Nam mỹ (Bolivia, Chile, Colombia, Peru) [19] Những loài cà chua hoang dại gần gũi với loài cà chua trồng hiện nay vẫn tìm thấy ở dọc dãy núi Andes (Peru), đảo Galapagos (Ecuado) và Bolivia Từ thế kỷ 16 cà chua đã được trồng ở Châu Âu, sau đó lan sang các vùng khác như Trung Quốc và Đông Nam Á (thế kỷ 17), Nhật Bản (thế kỷ 18) Đến thế kỷ 18, nhiều vùng trên thế giới trồng cà chua làm thực phẩm và giống cà chua đã trở nên phong phú và đa dạng Vào đầu thế kỷ 19, quả cà chua đã trở thành loại thực phẩm phổ biến và quen thuộc của con người Đến cuối thế kỷ 19 cà chua được đưa vào trồng ở nước ta ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và một số tỉnh vùng cao

Cà chua thuộc họ cà (Solanaceae), bộ cà (Solanales), phân lớp cúc (Asteridae), lớp ngọc lan (Magnoliosida) [40], [31] Từ lâu đã có nhiều tác giả nghiên cứu về phân loại cà chua và thành lập hệ thống phân loại theo quan điểm của riêng mình Theo hệ thống phân loại của Muller (1940) thì cà

chua trồng hiện nay thuộc chi phụ Eulycopersion C.H.Muller Tác giả phân loại chi phụ thành 7 loài, loài trồng hiện nay (Lycopersicon esculentum) thuộc loài thứ nhất Theo Nonnecke(1989) thì L esculentum là loài cà chua trồng có 4 chủng chính (1) L esculentum var Commune bao gồm hầu hết

những giống cà chua hiện nay với đặc điểm là lá rậm, quả có khối lượng

trung bình lớn; (2) L esculentum var Grandiolium có đặc điểm lá rộng và láng bóng, số lá trên cây ít; (3) L esculentum var Validium là cà chua anh

đào với thân đứng mập và (4) L esculentum var Pyriforme là cà chua quả

lê

2.1 2 Đặc điể si c

Bộ rễ cà chua là rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng phát triển rễ phụ rất lớn Trong điều kiện thuận lợi nhất những giống tăng trưởng mạnh có rễ ăn sâu 100 - 150 cm và rộng 150 - 250 cm Vì vậy cà chua chịu hạn tốt Bộ rễ ăn sâu, mạnh hay yếu đều có liên quan đến mức độ phân cành

và phát triển của bộ phận trên mặt đất, do đó khi trồng cà chua tỉa cành, bấm ngọn, bộ rễ thường ăn nông và hẹp hơn so với điều kiện trồng tự nhiên

Cây cà chua có thân tròn, thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lông, khi cây lớn gốc thân dần dần hóa gỗ Thân mang lá và phát hoa ở nách lá là chồi nách Chồi nách ở các vị trí khác nhau có tốc độ sinh trưởng và phát dục khác nhau, thường chồi nách ở ngay dưới chùm hoa thứ nhất, có khả năng tăng trưởng mạnh và phát dục sớm so với các chồi nách gần gốc Tùy khả năng sinh trưởng và phân nhánh mà các giống cà chua được chia làm 4 dạng là: (1)

Dạng sinh trưởng hữu hạn (determinate) (2 ) Dạng sinh trưởng vô hạn (indeterminate) (3) Dạng sinh trưởng bán hữu hạn (semideterminate) (4) Dạng lùn (dwart)

Lá thuộc lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3 - 4 đôi lá chét, rìa lá chét đều

có răng cưa nông hay sâu tùy giống Phiến lá thường phủ lông tơ Đặc tính lá của giống thường thể hiện đầy đủ sau khi cây có chùm hoa đầu tiên

Hoa mọc thành chùm, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính Sự thụ phấn chéo

ở cà chua khó xảy ra vì hoa cà chua tiết nhiều tiết tố chứa các alkaloid độc nên không hấp dẫn côn trùng và hạt phấn nặng không bay xa được Số lượng hoa trên chùm thay đổi tùy giống và thời tiết, thường từ 5 - 20 hoa

Quả cà chua thuộc loại mọng nước, có hình dạng thay đổi từ tròn, bầu dục đến dài Vỏ quả có thể nhẵn hay có khía Màu sắc của quả thay đổi tùy

giống và điều kiện thời tiết Thường màu sắc quả là màu phối hợp giữa màu

vỏ và thịt quả

Cà chua là loại cây thân thảo, ngắn ngày sinh trưởng hàng năm, ưa khí hậu ấm áp và ánh sáng đầy đủ Đủ ánh sáng cây mới sinh trưởng phát triển tốt nhất Cà chua sinh trưởng, phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ trung bình từ 22oC – 26oC Nếu nhiệt độ trên 35oC cây ngừng sinh trưởng, khi nhiệt

- Bệnh mốc sương (Phytophtaora infestans)

Bệnh mốc sương gây ra do một loại nấm có tên là Phytophtaora

infestans Đây là loài nấm ký sinh chuyên tính có khả năng hình thành nhiều

chủng khác nhau Nấm gồm 16 chủng trong đó có cả các chủng đơn và chủng hỗn hợp tuy nhiên số lượng chủng nấm thay đổi tuỳ khu vực sinh thái trồng trọt hoặc ở từng nước khác nhau Bệnh mốc sương thường phát triển trong điều kiện nhiệt độ từ 15 - 22oC, thích hợp nhất là 18 - 20o

C và độ ẩm không khí cao Độ ẩm thấp nhất cho nấm phát triển là 76%, có ý kiến cho là 65%, độ

ẩm càng cao bệnh lây lan và gây hại càng mạnh Trong điều kiện thiếu ánh sáng, trời âm u, mưa phùn càng tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển Bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở mép chóp lá tạo vết xám xanh nhạt sau đó lan rộng vào phiến lá Phần giữa vết bệnh chuyển màu đen và xung quanh vết bệnh thường có cành bào tử màu trắng xốp bao phủ giống một lớp mốc trắng như sương muối làm cho lá chết lụi nhanh chóng, bệnh cũng xuất hiện ở cuống lá, cành và thân [38]

- Bệnh héo xanh vi khuẩn (Pseudomonas solanacearum Smith)

Bệnh gây hại nghiêm trọng đối với cây cà chua ở các vùng trồng cà chua ở Việt Nam, các vùng nhiệt đới, bán nhiệt đới và những vùng trên thế giới có khí hậu ấm áp Bệnh phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 26o

C - 30oC, bệnh thích nghi độ pH trong phạm vi tương đối rộng, độ pH thích hợp cho bệnh phát triển từ 6,8 - 7,2, bệnh phát triển mạnh ở những chân đất cao, đất vàn, trên những chân ruộng luân canh với cây trồng cạn, đặc biệt là cây họ cà Bệnh héo xanh thường thể hiện triệu chứng ngay sau khi vi khuẩn xâm nhập vào rễ hoặc phần thân sát mặt đất Vi khuẩn gây bệnh héo xanh là loài đa thực

có phổ ký chủ rộng, có thể xâm nhiễm, ký sinh gây hại trên nhiều họ cây trồng khác nhau, đặc biệt trên các cây trồng thuộc họ cà, họ đậu, họ bầu bí Vi khuẩn có thể sống trong đất từ 5 - 6 năm, trên các bộ phận của cây vi khuẩn này có thể tồn tại từ 6 - 7 tháng còn nếu bám dính trên bề mặt hạt chỉ tồn tại 2 ngày Vi khuẩn xâm nhiễm qua những vết thương trên cây, lan truyền nhờ nước và côn trùng Vi khuẩn gây hại ở tất cả các thời kỳ sinh trưởng phát triển

của cây, nhưng nghiêm trọng nhất là thời kỳ hoa và đậu quả

Hiện nay, chưa có loại thuốc đặc hiệu để phòng trừ loại bệnh này, nên khi bệnh hại xâm nhiễm đã gây ra tổn thất lớn cho sản xuất Biện pháp phòng

trừ chủ yếu là thông qua biện pháp canh tác

- Bệnh đốm nâu (Alternaria solani)

Bệnh do nấm gây hại ở hầu hết các vùng trồng cà chua có khí hậu nhiệt đới Nấm phá hại thân, lá, hoa, quả Triệu chứng bệnh là những đốm nâu, gồm những vòng tròn đồng tâm trên những lá già và những vết lõm màu nâu tối ở trên thân, khi cây bị bệnh hại nặng thì quả cũng bị hại Bệnh phát triển nhanh trong điều kiện thời tiết nóng ẩm Nếu phòng trừ không kịp thời, toàn bộ cây

sẽ bị khô chết như bị đốt cháy Phòng trừ bằng kỹ thuật canh tác tổng hợp

Khi cây bị bệnh cần tăng cường chăm sóc, bón thúc Thực hiện luân canh, vệ

sinh đồng ruộng

- Bệnh héo vàng (Fusarium oxysporiumf sp Lyco-perisici)

Nguồn bệnh cư trú trong đất, xâm nhập vào cây qua bộ rễ Bệnh phát triển mạnh ở nhiệt độ cao 28oC Triệu chứng của bệnh đầu là những lá ở dưới thấp bị vàng, héo, sau đó lây lan sang lá non và hoa Toàn bộ bó mạch ở hệ rễ

bị biến đổi thành màu nâu và cây bị chết Có thể phòng bệnh bằng cách coi trọng công tác vệ sinh đồng ruộng, luân canh triệt để, xử lý đất Khi bệnh phát triển mạnh có thể dùng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây Khi dùng thuốc

phải tuân thủ sự hướng dẫn của ngành bảo vệ thực vật

- Bệnh xoăn lá do virus

Bệnh do virus gây hại cà chua và gồm rất nhiều loại, thuộc nhóm

Germinivirus Bệnh có triệu chứng xoăn ngọn lá, những cây bị bệnh hại sinh

trưởng, phát triển kém, thường không cho quả Vì vậy gây tổn thất nghiêm trọng đến năng suất, có khi không cho thu hoạch Đặc biệt từ sau khi trồng đến thời kỳ ra hoa, cây bị hại sẽ làm giảm khối lượng quả rất lớn Ở Việt Nam, bệnh xoăn lá cà chua phát triển mạnh trong vụ cà chua sớm và vụ xuân

hè khi nhiệt độ không khí từ 25 - 30oC, độ ẩm trên 70%

2.1.2 Virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua

2.1.2.1 Triệu c ứ g biểu iệ bệ

Bệnh do virus thuộc nhóm Geminivirus gây hại cà chua ở những vùng

nhiệt đới Virus thường gây ra triệu trứng xoăn lá, nhất là ngọn xoăn rất mạnh Lá có dạng xoắn vào trong, cây lùn thấp, mặt lá thường bị khảm đốm vàng Những cây bị bệnh, sinh trưởng phát triển kém, thường không cho quả

Bệnh xoăn lá do virus có thể gây nhầm lẫn với một số tình trạng bệnh

cà chua khác như: bệnh nụ hoa cà chua lớn, vàng đầu cà chua, bệnh xoăn lá sinh lý, thiếu phosphate và magie Bệnh nụ hoa cà chua lớn có thể phân biệt được vì nó làm cho hoa có màu xanh lá cây Bệnh vàng đầu cà chua có biểu hiện là chỗ lá non có kích thước nhỏ và tròn, mép lá cong lên hoặc cong

xuống Bệnh xoăn lá sinh lý do áp lực nước làm cây còi cọc và mô lá non phát triển mềm chứ không cứng Thiếu phosphate làm cho cây cứng, nhuộm màu hơi tím và các bộ phận của cây nhỏ lại Thiếu magie làm vàng những gân lá ở giữa và dưới thân cây [27]

Biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu là thực hiện nghiêm ngặt chế độ luân canh, không trồng cà chua trên ruộng mà vụ trước đã trồng cây họ cà Vệ sinh đồng ruộng kỹ trước khi làm đất, gieo trồng Khi phát hiện cây bị bệnh phải nhổ bỏ Khi chăm sóc chú ý tránh tác động mạnh làm lây lan bệnh Khi trồng vụ sớm nên chọn các giống có đặc tính kháng bệnh cao Ngoài ra, cần

thiết phải diệt bọ phấn truyền virus [9]

2.1.2.2 P â l ại virus gây bệ x ă và g lá cây cà c u

Theo hệ thống phân loại virus quốc tế (ICTV) năm 2013, TYLCV

thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae Họ này có 7 chi bao gồm

Begomovirus (288 loài), Curtovirus (3 loài), Eragrovirus (1 loài), Mastrevirus

(29 loài), Topocuvirus (1 loài), Turncurtovirus (1 loài) và Becurtovirus (2

loài) Geminiviridae là họ virus gây bệnh thực vật lớn thứ hai với 325 loài

Begomovirus là chi lớn nhất trong họ chủ yếu được lan truyền thông qua

vector truyền bệnh là loài bọ phấn Bemisia tabaci [15], [29]

2.1.2.3.Đặc điể ì t ái và cấu tạ

TYLCV có dạng hình chày, hạt virion ở dạng cầu ghép đôi với kích thước trung bình xấp xỉ 20 × 30 nm Lớp vỏ protein có trọng lượng khoảng

28 – 34 × 103 đvC gồm 22 capsome giống nhau, mỗi capsome gồm có 5 phân

tử protein [18], [38] Những loài TYLCV phát hiện trước đây có hệ gen gồm các gen trùm nằm trên cùng một vòng DNA – A sợi đơn kích thước khoảng 2,8 kb (thể monopartite) Sau đó, người ta phát hiện nhiều chủng virus có hệ gen gồm hai vòng DNA sợi đơn tách biệt với kích thước xấp xỉ nhau khoảng 2,5 – 3,0 kb là DNA – A và DNA – B (thể bipartite) Gần đây, người ta còn

phát hiện một số loài thuộc nhóm một vòng gen ngoài vòng DNA – A còn có một hoặc hai vòng DNA vệ tinh (DNAβ và DNAα) với kích thước xấp xỉ một nửa DNA – A có tác dụng tăng cường tái bản hệ gen virus và biểu hiện triệu chứng bệnh trên cây chủ [6], [10], [15], [23]

Hệ gen của TYLCV gồm 6 gen chức năng đó là gen CP (V1), prepCP (V1), C1, C2, C3, C4 Các gen trong hệ gen của TYLCV có thể nằm trên cùng một vòng DNA – A hoặc hai vòng DNA – A và DNA – B riêng biệt ngăn cách với nhau bởi một vùng liên gen (IR – intergenic region) có độ dài khoảng 200 nucleotide Trên vùng IR đó có chứa điểm khởi đầu sao chép và vùng điều khiển cho sự tái bản vòng gen virus theo cả hai hướng Dạng trình

tự điển hình nhất trong vùng IR là hai trình tự bảo thủ lặp lại đảo ngược của TAATATT/AC được định vị trên một cấu trúc vòng (stem – loop) có liên quan tới việc tái bản sợi DNA mới và một trình tự lặp lại cần thiết cho việc nhận biết và bám vào của protein Rep (Replication) trong quá trình phiên mã [18], [25]

Các chủng Begomovirus monopartite ngoài vòng DNA – A có thể có

một hoặc hai vòng DNA sợi đơn với kích thước xấp xỉ một nửa DNA – A được gọi là DNA vệ tinh (gồm DNAβ và DNAα) DNA vệ tinh được phát hiện lần đầu tiên trong chủng virus gây bệnh xoăn lá cà chua (TLCV) phân lập từ phía bắc Australia vào năm 1997 với kích thước khoảng 682 nucleotide

đó là ToLCV – sat [20]

Vòng DNAβ có kích thước xấp xỉ khoảng 1360 nucleotide, trình tự nucleotide khá bảo thủ Trên đó bao gồm một vùng giàu adenin (A – rich region), một vùng vệ tinh (SCR – Satelite conserved region) và một trình tự đọc mở (ORF) trên sợi bổ sung mã hóa cho protein βC1 Vùng SCR chứa cấu trúc vòng (stem – loop) mang đoạn trình tự khởi đầu tái bản TAATATT/AC giống như vùng liên gen (IR) của DNA – A Chức năng của vòng DNAβ được

cho là góp phần làm tăng cường biểu hiện triệu chứng bệnh bằng cách làm bất hoạt gen của cây chủ hoặc thuận lợi cho việc mở rộng phạm vi lây nhiễm DNAα cũng giống như DNAβ có trình tự rất bảo thủ trong đó có chứa một khung đọc mở mã hóa cho protein tái bản (Rep), một trình tự giàu Adenin và một điểm khởi đầu tái bản nằm trên cấu trúc vòng (stem – loop) chứa trình tự bảo thủ TAATATT/AC giống như những nanovirus khác DNAα có khả năng tự tái bản nhưng cần sự trợ giúp của virus trong quá trình biểu hiện và vận chuyển trong cây chủ DNAα hiện chưa xác định là có ảnh hưởng lên sự biểu hiện bệnh ở cây chủ [16]

2.1.2.4 Đặc điể lây l và ôi giới truyề bệ

Các virus này lây truyền từ cây này qua cây khác trong tự nhiên nhờ một loại môi giới

nay đã biết được khoảng hơn 1000 loài [3], [5], [28], [39]

Bọ phấn trắng có chu kỳ để sinh trưởng phát triển từ trứng thành con trưởng thành khoảng 18 – 28 ngày trong điều kiện thời tiết ấm áp và khoảng

30 – 40 ngày trong mùa đông Chu kỳ sống gồm những giai đoạn sau: (1) trứng nở trong khoảng 7 đến 10 ngày; (2) giai đoạn bò kéo dài khoảng 3 – 4

Hình 2.1 Chu kỳ sinh trưởng của bọ phấn (Bemisia

tabaci)

ngày; (3) Giai đoạn thiếu trùng kéo dài khoảng 6 – 12 ngày; (4) giai đoạn nhộng kéo dài khoảng 4 – 6 ngày; (5) con trưởng thành sống trong khoảng thời gian 6 – 16 ngày và có thể sống đến 50 ngày (Hình 1.2)

Bọ phấn trắng hút nhựa cây bằng cách dùng miệng chích và hút làm cho cây phát triển còi cọc, lá vàng và trái chín không đều Trong khi hút nhựa cây, bọ phấn trắng tiết ra dịch ngọt mà từ đó mốc đen phát triển rất nhanh làm đen lá và đen bề mặt quả Trong điều kiện tự nhiên bọ phấn trắng có thể di chuyển xa tới 2 km và làm lây lan bệnh rất nhanh [4]

Năm 1966, Cohen và Nitzany đã tiến hành những thử nghiệm đầu tiên nhằm kiểm soát dịch bệnh TYLCV Trước hết là tìm hiểu mối quan hệ giữa virus – vector bằng cách kiểm tra hiệu quả truyền TYLCV bởi bọ phấn trắng Sau 48 giờ nuôi cộng sinh bọ phấn trắng với cây WT (wild type – dạng dại) nhận thấy chỉ có 5% ruồi đực truyền virus, tuy nhiên hiệu quả truyền virus ruồi trắng cái tới 32% gấp 6 lần ruồi đực Tiến hành thử nghiệm với các số lượng 1, 3, 5, 10 và 15 bọ phấn cái/1 cây WT thì hiệu quả nhiễm bệnh tương ứng là 32%, 83%, 84%, 86% và 100% [8] Những virus này được duy trì liên tục trong cơ thể côn trùng Khi bọ phấn tiêm chích lên cây chủ, virus sẽ được truyền sang và lây lan Các ngưỡng thu nhận và truyền tải đã được tìm thấy là khoảng 15 đến 30 phút Tuy nhiên, để có tỷ lệ lây nhiễm cao cần ít nhất 4 giờ Giai đoạn tiềm ẩn khoảng từ 21 – 24 giờ Thử nghiệm với những bọ phấn cái

có thời gian sống khoảng 20 – 50 ngày cho thấy, sau 48 giờ lây nhiễm, chỉ có

2 trong 28 con cái là giữ lại các virus tới 20 ngày Thời gian cộng sinh ngắn dẫn đến khoảng thời gian lưu giữ virus cũng ngắn hơn

Hiệu quả lây nhiễm TYLCV qua bọ phấn giảm theo thời gian, hầu hết những con cái có thể truyền virus trong khoảng 10 ngày sau khi mang nguồn bệnh Bên cạnh nguồn bệnh từ những con trưởng thành, các virus còn được tìm thấy trong cơ thể bọ phấn ở các giai đoạn phát triển khác Khi cộng sinh