NGHIÊN cứu THU NHẬN và ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP gây BỆNH THỐI NHŨN TRÊN cà CHUA SAU THU HOẠCH của CHITOSAN từ MAI mực ỐNG

Sản phẩm -chitin thu được có khối lượng phân tử trung bình lớn Mw và là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao.. Trong số nhiều

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HOÀNG NGỌC CƯƠNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG

KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP GÂY BỆNH THỐI NHŨN

TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ

MAI MỰC ỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

KHÁNH HÒA - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HOÀNG NGỌC CƯƠNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG

KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP GÂY BỆNH THỐI NHŨN

TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ

MAI MỰC ỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

NGÀNH ĐÀO TẠO : CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS TRANG SĨ TRUNG PGS.TS NGUYỄN ANH TUẤN

KHÁNH HÒA - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình do chính tôi thực hiện Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan của mình

Tác giả luận án

Hoàng Ngọc Cương

TS Huỳnh Thanh Tùng, PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, TS Khổng Trung Thắng

đã giúp đỡ, chia sẻ nhiều kinh nghiệm quí báu

Các cán bộ kỹ thuật của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trung tâm Thí nghiệm Thực hành - Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện trong quá trình tiến hành nghiên cứu

Cuối cùng, xin gửi tấm lòng ân tình tới gia đình, những người thân yêu luôn là nguồn động viên và chia sẻ mọi khó khăn để luận án được hoàn thành

Nha Trang, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Hoàng Ngọc Cương

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xii

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP ĐỂ THU NHẬN -CHITIN 5

1.1.1 Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp và phế liệu từ mực sau chế biến 5

1.1.2 Cấu trúc và thành phần hóa học của mai mực ống Loligo sp 6

1.2 TỔNG QUAN VỀ β-CHITIN VÀ CHITOSAN 15

1.2.1 Cấu trúc hóa học, nguồn gốc tự nhiên và tính chất của các dạng chitin 15

1.2.2 Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan 19

1.2.3 Phương pháp thu nhận chitin và chitosan 22

1.2.4 Đặc tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn của chitosan 34

1.3 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH 37

1.3.1 Giới thiệu chung về nguồn nguyên liệu cà chua sau thu hoạch 37

1.3.2 Tổng quan về bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại cà chua sau thu hoạch 39

1.3.3 Giới thiệu về chủng vi khuẩn Erwinia spp gây bệnh thối nhũn 40

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43

2.1 VẬT LIỆU 43

2.1.1 Mai mực ống Loligo sp 43

2.1.2 Trái cà chua Lycopersicon esculetum 43

2.1.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 44

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 44

2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thu nhận β-chitin 47

2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện deacetyl β-chitin thu nhận chitosan 53

2.2.4 Bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn 60

2.2.5 Bố trí thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch của β-chitosan ở điều kiện in vitro và in vivo 62

2.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU 69

2.3.1 Phương pháp xác định các thành phần hóa học cơ bản 69

2.3.2 Phương pháp xác định thành phần acid amin và thành phần khoáng 69

2.3.3 Phương pháp xác định tính chất của -chitin và chitosan 69

2.3.4 Phương pháp cắt mạch chitosan 70

2.3.5 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn 71

2.3.6 Phương pháp chuẩn bị mẫu dịch vi khuẩn Erwinia carotovora 72

2.3.7 Phương pháp gây bệnh nhân tạo 73

2.3.8 Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro 73

2.3.9 Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo 73

2.3.10 Phương pháp xác định tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua 74

2.3.11 Phương pháp xử lý số liệu 74

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 75

3.1 Thành phần hóa học của mai mực LOLIGO SP 75

3.1.1 Thành phần hóa học cơ bản 75

3.1.2 Thành phần khoáng 77

3.1.3 Thành phần acid amin 78

3.2 XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT -CHITIN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP 80

3.2.1 Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến quá

trình khử protein trong mai mực Loligo sp 80

3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng các yếu tố nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và sự cắt mạch của sản phẩm β-chitin 82

3.2.3 Tính chất của sản phẩm β-chitin từ mai mực ống 90

3.3 ĐIỀU KIỆN DEACETYL -CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP 99

3.3.1 Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của 3 yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl -chitin 99

3.3.2 Ảnh hưởng chi tiết của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan 102

3.3.3 Điều kiện deacetyl lần 2 108

3.3.4 Hiệu suất thu nhận và tính chất của sản phẩm chitosan 109

3.3.5 Đề xuất quy trình thu nhận chitin, chitosan từ mai mực ống Loligo sp 116

3.4 KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN 117

3.4.1 Nghiên cứu phân lập, xác định chủng Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch 117

3.4.2 Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro 124

3.4.3 Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo 128

3.4.4 Đề xuất quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng dung dịch chitosan từ mai mực Loligo sp 136

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 138

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 140

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 141 PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

AAS Atomic absorption

spectrophotometric

Phổ hấp thu nguyên tử

AOAC Association of Official Analytical

Chemists

Hiệp hội các nhà hoá phân tích

ANOVA Analysis of Variance Phân tích phương sai

-chitosan Chitosan from β-chitin Chitosan từ β-chitin

χcr Degree of crystallinity Độ kết tinh

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Ethylenediaminetetraacetic axit FTIR Fourier Transform Infrared Quang phổ hấp thụ hồng ngoại

GlcNAc N-acetyl glucosamine N-acetyl glucosamine

Mark-Houwink-Mw The average molecular weight Khối lượng phân tử trung bình

Nd Not detected Không phát hiện

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Pme Pectin methylesterases Enzyme phân giải pectin

PCR Polymerase chain reaction Phương pháp khuếch đại gen PDA Potato dextrose agar Môi trường thạch khoai tây

SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét

SEC-MALLS Size-exclusion

chromatography-Multi-angle static light scattering

Phương pháp sắc ký loại trừ kết hợp với phân tán ánh sáng tĩnh

đa góc

SPSS Statistical Package for the Social

Sciences

Phần mềm thống kê

TEM Transmission Electron

Microscope

Kính hiển vi điện tử truyền qua

VASEP Vietnam Association of Seafood

Exporters and Producers

Hiệp hội chế biến và xuất khẩu Thuỷ sản Việt Nam

XRD X-ray powder diffraction Phổ nhiễu xạ tia X

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong nguyên liệu của một số loại phế liệu thủy sản

thông dụng để sản xuất chitin 7

Bảng 1.2 Thành phần hóa học trong một số mai mực 8

Bảng 1.3 Thành phần khoáng của nguyên liệu mai mực 8

Bảng 1.4 Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan 20

Bảng 1.5 Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl 21

Bảng 1.6 Thành phần và tính chất của một số loại chitosan thương mại 21

Bảng 1.7 Điều kiện khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguyên liệu khác nhau 28

Bảng 1.8 Nguồn nguyên liệu thủy sản, điều kiện xử lý và loại chitin 30

Bảng 1.9 Điều kiện deacetyl thu nhận chitosan từ các nguồn chitin khác nhau 32

Bảng 1.10 Khối lượng phân tử trung bình (Mw) của chitosan ở các điều kiện deacetyl khác nhau 34

Bảng 1.11 Bảng tổng hợp các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn (soft rot) 41

Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của mai mực ống Loligo sp 75

Bảng 3.2 Thành phần khoáng trong mai mực Loligo sp., các loại mực khác và vỏ tôm 77

Bảng 3.3 So sánh thành phần acid amin trong mai mực ống Loligo sp và kết quả tham khảo 79

Bảng 3.4 Tính chất của mai mực ống và sản phẩm β-chitin 92

Bảng 3.5 Thành phần khoáng trong mai mực và sản phẩm β-chitin 93

Bảng 3.6 Hàm lượng acid amin trong mai mực và sản phẩm β-chitin 93

Bảng 3.7 Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 25oC của β-chitin 98

Bảng 3.8 Hiệu suất thu hồi chitin và chitosan 110

Bảng 3.9 So sánh chất lượng của thương mại chitosan và β-chitosan 110

Bảng 3.10 Hàm lượng acid amin còn lại trong β-chitin và β-chitosan 111

Bảng 3.11 Thành phần khoáng và kim loại trong mai mực, β-chitin và β-chitosan 113

Bảng 3.12 Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 70oC của β-chitosan 115

Bảng 3.13 Mẫu cà chua thu nhận từ các chợ nông sản 118

Bảng 3.14 Kết quả đánh giá đặc tính sinh hóa sinh lý của các dòng vi khuẩn 120

Bảng 3.15 Khả năng kháng khuẩn Erwinia carotovora của chitosan với khối lượng phân tử khác nhau và chitosan thương mại (C-120) 125

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Thống kê giá trị xuất khẩu mực, bạch tuộc; (a) Mực ống Loligo sp (b) Mai mực 5

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc chitin trong mai mực nguyên liệu 9

Hình 1.3 Một kiểu mô phỏng những liên kết hóa học có thể tạo ra giữa chitin với astaxanthin và các phân tử khác trong nguyên liệu 10

Hình 1.4 Mô hình cấu trúc lớp vỏ tôm 10

Hình 1.5 Ảnh quét kính hiển vi điện tử SEM của mai mực ống 11

Hình 1.6 Quy trình thu nhận chitin/chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác nhau 12

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học phân tử chitin 16

Hình 1.8 Sự sắp xếp của chuỗi chitin: (a) α-chitin, (b) β-chitin, (c) γ-chitin 16

Hình 1.9 Cấu trúc phân tử (a) α-chitin (b) β-chitin 17

Hình 1.10 Cấu trúc α-chitin và -chitin 18

Hình 1.11 Phổ XRD của α-chitin và β-chitin 18

Hình 1.12 Cấu trúc hóa học của chitosan 19

Hình 1.13 Sơ đồ quá trình sản xuất chitin/chitosan từ phế liệu thủy sản 22

Hình 1.14 Phản ứng deacetyl chitin thu chitosan 31

Hình 1.15 Cà chua bị bệnh thối nhũn (soft rot) 39

Hình 2.1 Nguyên liệu mai mực ống Loligo sp 43

Hình 2.2 Nguyên liệu cà chua Lycopersicon esculentum 44

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 45

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến khả năng khử protein trong mai mực ống nguyên liệu 47

Hình 2.5 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình khử protein mai mực ống 49

Hình 2.6 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của thời gian 51

Hình 2.7 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến quá trình khử protein 52

Hình 2.8 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến quá trình deacetyl -chitin 54

Hình 2.9 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình deacetyl

-chitin 55

Hình 2.10 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến quá trình deacetyl -chitin 57

Hình 2.11 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến quá trình deacetyl -chitin 58

Hình 2.12 Sơ đồ thí nghiệm deacetyl lần 2 59

Hình 2.13 Sơ đồ phân lập vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch 61

Hình 2.14 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan 62

Hình 2.15 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp của chitosan ở điều kiện in vitro 64

Hình 2.16 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh thối nhũn của chitosan ở điều kiện in vivo 65

Hình 2.17 Sơ đồ thí nghiệm so sánh khả năng kháng bệnh thối nhũn của chitosan từ mai mực ống và chitosan thương mại 67

Hình 3.1 Hàm lượng protein còn lại sau quá trình khử protein dưới tác động của 3 yếu tố (nhiệt độ, nồng độ NaOH, thời gian) 81

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và sự cắt mạch β-chitin 84

Hình 3.3 (a) Ảnh của mực ống, (b) mai mực ống và (c) sản phẩm β-chitin 90

Hình 3.4 Hình SEM chụp bề mặt cắt của (a) mai mực ống và (b) sản phẩm β-chitin 95

Hình 3.5 Phổ XRD của mai mực ống và sản phẩm β-chitin thu được từ mai mực 96

Hình 3.6 Phổ FTIR của nguyên liệu mai mực ống và sản phẩm β-chitin 97

Hình 3.7 Phổ H1 NMR của β-chitin 98

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả deacetyl 101

Hình 3.9 Ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến DD và Mw của chitosan 104

Hình 3.10 Ảnh hưởng của quá trình deacetyl lần 2 đến DD và Mw của chitosan 108

Hình 3.11 Sản phẩm -chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp 109

Hình 3.12 Hình SEM của (a) mai mực ống, (b) β-chitin và (c) chitosan 112

Hình 3.13 Phổ XRD của mai mực, β-chitin và β-chitosan 113

Hình 3.14 Phổ FTIR sản phẩm chitosan từ (a) β-chitosan, (b) α-chitosan thương mại và (c) β-chitin 114

Hình 3.15 Phổ H1-NMR của β-chitosan 114

Hình 3.16 Phổ SEC-MALLS của β-chitosan 115

Hình 3.17 Quy trình thu nhận β-chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp 116

Hình 3.18 Mẫu trái cà chua bệnh thối nhũn thu nhận từ chợ nông sản 118

Hình 3.19 (a) Mẫu khuẩn lạc được chọn; (b) Mẫu vi khuẩn nhuộm Gram 119

Hình 3.20 Trình tự một đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn Erwinia carotovora 121

Hình 3.21 Hình SEM chủng vi khuẩn Erwinia carotovora 122

Hình 3.22 Vết bệnh thối nhũn trên trái cà chua 122

Hình 3.23 Sơ đồ phát triển bệnh thối nhũn trên cà chua 123

Hình 3.24 (a) Khả năng kháng khuẩn của S-655 và (b) của S-138 ở các nồng độ khác nhau C-120 là chitosan thương mại với Mw là120 kDa 126

Hình 3.25 Hình TEM của vi khuẩn Erwinia sp được xử lý trong dung dịch β-chitosan 1% (S-138) trong 60 phút (a) Vi khuẩn Erwinia carotovora; (b) xử lý sau 15 phút; (c) xư lý sau 30 phút; (d) kết quả sau 60 phút 127

Hình 3.26 Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-1740 ở điều kiện in vivo 129

Hình 3.27 Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-655 ở điều kiện in vivo 130

Hình 3.28 Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-138 ở điều kiện in vivo 131

Hình 3.29 Kích thước vết bệnh bên trong được xử lý S-138 trong (a) 24 giờ , (b) 36 giờ 132

Hình 3.30 So sánh khả năng kháng bệnh thối nhũn ở điều kiện In vivo của S-138 và chitosan thương mại C-120 (a) kích thước vết bệnh bên ngoài và (b) kích thước vết bệnh bên trong 133

Hình 3.31 Kích thước vết bệnh bên trong và bên ngoài khi xử lý chitosan S-138 và chitosan thương mại C-120 sau 36 giờ 134

Hình 3.32 Tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua sau khi được xử lý các loại chitosan có phân tử lượng khác nhau sau thời gian 24 và 72 giờ 135

Hình 3.33 Quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng chitosan 136

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia

sp gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan

Người hướng dẫn: PGS.TS Trang Sĩ Trung

PGS.TS Nguyễn Anh Tuấn

Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang

Nội dung:

1 Đã xác định được thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai mực Loligo sp

thải ra sau quá trình chế biến tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo

2 Đã xác định được điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại Sản phẩm -chitin thu được có khối lượng phân tử trung bình lớn (Mw) và

là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực

kỹ thuật cao Điều kiện thu nhận có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn

3 Đã xác định được điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và khối lượng phân tử lớn Sản phẩm chitosan thu được là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các oligo chitosan và các chế phẩm từ chitosan có thể ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao như y dược, y sinh và công nghệ thực phẩm Điều kiện deacetyl có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn

4 Đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái

cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng chitosan có khối

lượng phân tử khác nhau Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong bảo quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan

NGHIÊN CỨU SINH Hoàng Ngọc Cương

KEY FINDINGS Thesis title: Preparation of chitosan from squid pens and its antibacterial activity

against Erwinia sp caused soft rot on tomato fruits

Speciality : Aquatic Products Technology

Code : 62540105

Ph.D Student : Hoang Ngoc Cuong

Course : 2011

Supervisors : 1 Assoc Prof PhD TRANG SI TRUNG

2 Assoc Prof PhD NGUYEN ANH TUAN

Intitution : Nha Trang University

Key findings:

- The chemical composition of the Loligo sp squid pens from seafood

processing companies in Kien Giang province was reported that can be used for futher various studies

- The extraction conditions of -chitin with a commercial standard from squid pens was reported The obtained -chitin with a high molecular weight can be used to prepare chitosan with a high purity and high molecular weight for various applications Those extraction conditions can be applied in large-scale production

- The deacetylation conditions of -chitin for production of chitosan with a commercial standard (Mw >6338 kDa, DD>90%) was reported The obtained chitosan can be used for medicine, pharmacy, food and agriculture applications Those deacetylation conditions can be applied in large-scale production

- The antibacterial activity of chitosan against Erwinia carotovora caused soft rot on tomato fruits in vitro and in vivo was reported The lower moleculer weight of

chitosan is used, the higher activity is observed

Ph.D Student

Hoang Ngoc Cuong

PHẦN MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển nhanh chóng về số lượng và chất lượng của ngành công nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy sản, hằng năm Việt Nam đã thải ra hàng chục ngàn tấn phế liệu sau chế biến Hầu hết các phế liệu thủy sản chỉ được bán thô hoặc chế biến

để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế thấp, trong khi đây là nguồn nguyên liệu có thể sản xuất ra các sản phẩm có giá trị gia tăng và chất lượng cao Vì vậy, hướng nghiên cứu thu nhận và ứng dụng các polyme sinh học từ nguồn phế liệu thủy sản đang được của các nhà quản lý, nhà khoa học và doanh nghiệp quan tâm

Trong số nhiều sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu thủy sản, chitin và chitosan (sản phẩm của quá trình deacetyl chitin) là 2 polyme sinh học có nhiều tính chất đặc biệt như khả năng tương thích sinh học cao, khả năng tạo màng, tạo gel, phân giải chậm, kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn Do đó, chitin và chitosan đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y dược, sinh học, công nghệ thực phẩm, xử lý môi trường, dệt nhuộm, Ước tính mỗi năm có khoảng 10.000 tấn chitin và chitosan đã được sản xuất, sử dụng trên toàn thế giới nhưng hầu hết được thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ Tuy nhiên, α-chitin/chitosan thường có độ rắn cao, khối lượng phân tử thấp và độ tinh sạch chưa cao vì bản chất của nguồn nguyên liệu thu nhận là vỏ giáp xác có chức năng bảo vệ cơ thể sinh vật bên trong nên được cấu tạo rất phức tạp và rắn chắc Hơn nữa trong nguyên liệu vỏ giáp xác ngoài thành phần chitin còn chứa nhiều khoáng, protein và chất màu nên quá trình sản xuất phải qua nhiều công đoạn tách chiết, sử dụng nhiều hoá chất gây ô nhiễm

Mai mực ống có chứa hàm lượng khoáng thấp, lượng β-chitin khá cao (> 35%), chitin này có khối lượng phân tử lớn gấp 3 lần α-chitin và hầu như không chứa các kim loại nặng như Pb, Hg, As nên có độ tinh khiết cao [36, 79, 95] Do đó, đây là nguồn nguyên liệu cần thiết để sản xuất ra loại β-chitin/chitosan có khối lượng phân tử lớn và độ tinh khiết cao để ứng dụng trong lĩnh vực như tạo gel trong mỹ phẩm, màng kháng viêm, màng phân giải thuốc, chỉ khâu cấy ghép trong phẫu thuật, kỹ thuật mô cấy ghép da nhân tạo [54, 89, 151] Ngoài ra, β-chitin/chitosan đã được chứng minh có

độ rắn thấp, độ xốp cao nên dễ dàng deacetyl và được ứng dụng trong nuôi cấy mô, cố định tế bào và enzyme, phân giải thuốc chậm mà các tính chất này vượt trội so với α-chitin/chitosan Tại Việt Nam, nguồn phế liệu mai mực thải ra sau quá trình chế biến

ước tính đạt khoảng 10-15 tấn/tháng [58, 8] Tuy nhiên, nguồn phế liệu này chủ yếu là phơi khô, bán thô với giá thành thấp, do đó gây lãnh phí tài nguyên Trong khi, đây là nguồn nguyên liệu tốt để thu nhận β-chitin/chitosan chất lượng cao Hơn nữa theo chúng tôi tìm hiểu thì chưa có một nghiên cứu chính thức và có hệ thống đầy đủ nào được công

bố tại Việt Nam về quy trình thu nhận, đánh giá tính chất và ứng dụng β-chitin/chitosan tách chiết từ mai mực ống

Xuất khẩu nông sản Việt Nam giai đoạn 2012-2016 ước đạt 15 tỷ USD/năm, góp phần đáng kể phát triển nền kinh tế Tuy nhiên, công nghệ sau thu hoạch chưa được áp dụng hiệu quả nên chất lượng nông sản còn thấp, hạn chế khả năng xuất khẩu,

tỷ lệ thất thoát sau thu hoạch ở mức cao Trong đó, bệnh thối nhũn trên trái cà chua do

vi khuẩn Erwinia sp đã và đang gây thiệt hại 10-30% tổng sản lượng sau thu hoạch

[25, 77, 9] Các hóa chất thường dùng để kháng bệnh này là thủy ngân clorua, dung dịch formaldehyde, dung dịch natri hypocloric 12%, hydroxymercurinitrophenol 12% và hydromercurichloride phenol 2% [24, 25, 9] Đây là các hóa chất độc hại đối với người nông dân và người tiêu dùng nếu không được kiểm soát chặt chẽ Ngoài ra, một số kỹ thuật di truyền để kiểm soát bệnh trước và sau thu hoạch cũng được áp dụng Tuy nhiên, các kỹ thuật này có giá thành cao và khó triển khai thực tế ở qui mô lớn Do đó, phương pháp sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và an toàn như chitosan là rất cần thiết Thực tế, chitosan điều chế từ α-chitin đã được nghiên cứu và sử dụng để kháng khuẩn và kháng nấm có hiệu quả trong quá trình bảo quản sau thu hoạch trên nhiều đối tượng như bơ, xoài, nho và ớt [25, 9] Các kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan thu được từ β-chitin có tính kháng khuẩn và kháng nấm cao hơn so với thu được từ α-chitin [79, 134] Do đó, chitosan này được kỳ vọng sẽ có hiệu quả kháng

khuẩn cao đối với vi khuẩn Erwinia sp gây ra bệnh thúi nhũn trên trái cà chua

Từ những vấn đề thực tế được nêu, luận án này tiến hành nội dung “Nghiên cứu

thu nhận và đ nh gi hả n ng h ng huẩn Erwinia sp g ệnh thối nh n tr n cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống” Đây là cơ sở khoa học cần thiết để

thu nhận các sản phẩm β-chitin và chitosan có giá trị cao từ mai mực ống ở Việt Nam và nâng cao giá trị kinh tế của nguồn phế liệu mực ống Đồng thời, chứng minh và bổ sung đầy đủ hơn về khả năng kháng khuẩn của chitosan từ -chitin làm đa dạng hóa các ứng dụng của chitosan trong sản xuất nông nghiệp bền vững

Mục ti u nghi n cứu:

1 Thu nhận -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại từ nguồn phế liệu mai mực

Loligo sp thải ra sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu

2 Sản xuất chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại từ -chitin thu nhận ở trên

3 Đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của chitosan đối với bệnh thối nhũn trên trái

cà chua sau thu hoạch do vi khuẩn Erwinia sp gây ra

Đối tượng nghi n cứu: Luận án nghiên cứu trên đối tượng phế liệu mai mực Loligo

sp được thu nhận tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang thải ra sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu ở dạng tươi, có chiều dài từ 12-15 cm, rộng 1,0-1,5 cm và độ dày trung bình 0,4 - 0,5 mm

Phạm vi và nội dung nghi n cứu: Để đạt được 3 mục tiêu nghiên cứu, luận án tập

trung nghiên cứu, đánh giá làm rõ 4 nội dung:

1 Xác định thành phần hóa học cơ bản, các acid amin và kim loại của nguồn phế

liệu mai mực Loligo sp

2 Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nồng độ HCl, nhiệt độ và thời gian đến quá trình khử protein, khử khoáng để thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch -chitin trong quá trình thu nhận

3 Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến quá trình deacetyl -chitin để thu nhận sản phẩm chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch chitosan trong quá trình deacetyl

4 Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà

chua sau thu hoạch tại các chợ đầu mối nông sản Khảo sát, đánh giá khả năng kháng khuẩn của -chitosan với khối lượng phân tử khác nhau đối với vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua ở điều kiện in vitro và in vivo

Ý nghĩa hoa học và thực tiễn của Luận án:

1 Luận án đã xác định được thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai mực Loligo sp tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo

2 Luận án đã xác định được điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại Sản phẩm -chitin thu được có khối lượng phân tử lớn và là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao Điều kiện thu nhận có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn

3 Luận án đã xác định được điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và khối lượng phân tử lớn Sản phẩm chitosan thu được là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các oligo chitosan và các chế phẩm từ chitosan có thể ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao như y dược, y sinh và công nghệ thực phẩm Điều kiện deacetyl có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn

4 Luận án đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng -chitosan có khối lượng phân tử khác nhau Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong bảo quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP ĐỂ THU

NHẬN -CHITIN

1.1.1 Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp và phế liệu từ mực sau chế biến

Ở Việt Nam, hiện có khoảng 25 loài mực ống thuộc bộ Teuthida, tập trung

nhiều nhất ở vùng nước sâu khoảng 30-50 m Mùa vụ khai thác từ tháng 6 đến tháng 9 (vụ Nam) và tháng 12 đến tháng 4 năm sau (vụ Bắc), trong đó chủ yếu có 4 loài được

đánh bắt với số lượng chiếm trên 96% tổng sản lượng, bao gồm: Loligo japonica,

Loligo chinensis, Loligo beka và Todarodes pacificus

Mực ống Loligo sp (Hình 1.1a) được phân loại [58]:

Mực ống Loligo sp có giá trị xuất khẩu cao với sản lượng khai thác trên toàn

vùng biển Việt Nam vào khoảng 24.000 tấn/năm Theo số liệu thống kê của Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), hiện nay các mặt hàng từ mực, bạch tuộc của Việt Nam đang được xuất khẩu sang 25 thị trường trong đó có các thị trường khó tính như Nhật Bản, Hoa Kỳ, Châu Âu với tổng kim ngạch đạt 390-460 triệu USD/năm, trong đó giá trị xuất khẩu từ mực chiếm 55-65%, ước đạt 165 triệu USD [1, 8] Kết quả khảo sát cho thấy cứ sản xuất được 1 tấn mực thành phẩm sẽ thải

ra 0,45 tấn phế liệu, tỷ lệ này phụ thuộc vào loài, kích thước mực nguyên liệu Hiện nay, hầu hết các phế liệu này được thu gom và tận dụng để sản xuất các sản phẩm phụ dùng trong thức ăn chăn nuôi

Mai mực chiếm tỷ lệ khoảng 0,4-0,5% trọng lượng của toàn thân mực ống nguyên liệu tươi hoặc 10-15% phế liệu nội tạng mực thải ra sau quá trình chế biến (Hình 1.1b) Theo số liệu thống kê của Công ty Việt Nam Food thuộc tỉnh Cà Mau (VNF), lượng phế liệu từ chế biến mực ống được công ty thu mua mỗi tháng khoảng 130 tấn Do đó, lượng mai mực thu được ước đạt trung bình khoảng 10-15 tấn/tháng Hiện nay nguồn nguyên liệu này chủ yếu được phơi khô và bán thô cho các nhà máy chế biến làm thức ăn chăn nuôi hoặc bán trực tiếp cho các thương lái Trung Quốc với giá trị thấp

1.1.2 Cấu trúc và thành phần hóa học của mai mực ống Loligo sp

Nguồn nguyên liệu khác nhau dẫn đến qui trình chiết chitin khác nhau, tùy thuộc vào hàm lượng khoáng và protein có trong phế liệu Do đó thành phần hóa học của nguồn nguyên liệu được xem là yếu tố quyết định đến việc chọn qui trình tách chiết và chất lượng của sản phẩm chitin thu được Kết quả tổng hợp về thành phần hóa học một

số nguồn phế liệu thủy sản thông dụng để sản xuất chitin hiện nay được trình bày trong Bảng 1.1 So sánh các thành phần cho thấy, vỏ cua có hàm lượng khoáng cao nhất (56%), trong khi hàm lượng chitin lại thấp nhất (chỉ có 12,9%) Do đó, việc thu nhận chitin từ vỏ cua gặp nhiều khó khăn trong quá trình loại khoáng và hiệu quả thu nhận chitin thấp

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong ngu n liệu của một số loại phế liệu thủ sản thông dụng để sản xuất chitin

Nguồn phế liệu

Thành phần hóa học (%)

TLTK

Độ ẩm Protein Khoáng Lipid α-Chitin

Tôm sú (Penaeus monodon)

Phế liệu vỏ đầu tôm

Phế liệu vỏ tôm

9,1 9,7

26,8 42,8

29,3 20,8

0,5 1,2

34,9 36,5

[2]

[3]

Ghẹ chấm (Portunus trituberculatus) 12,9 10,3 57,9 0,3 17,1

Vỏ tôm có hàm lượng lipid tương đối cao, như vỏ tôm Pandalus borealis

(10,2%) do đó cần phải lưu ý công đoạn xử lý lipid Tuy nhiên, thông thường lượng lipid này có thể được loại bỏ trong công đoạn khử protein trong môi trường kiềm Như vậy, để thu nhận chitin từ vỏ tôm, vỏ cua và vỏ ghẹ thì bắt buộc phải tiến hành quá trình khử khoáng và khử protein

Thành phần hóa học có trong mai của một loài mực đã được công bố trong các nghiên cứu trước đây được tổng hợp ở Bảng 1.2 So với các nguồn phế liệu vỏ tôm, cua và ghẹ, phế liệu mai mực có hàm lượng chitin cao hơn nhiều (khoảng 31-42%) trong khi đó hàm lượng khoáng lại rất thấp (dưới 2%) Hàm lượng lipid cũng rất thấp

hoặc không phát hiện Do đó, khi tách chiết thu nhận chitin có thể bỏ qua quá trình

khử khoáng và khử lipid mà chỉ tập trung vào quá trình khử protein

Bảng 1.2 Thành phần hóa học trong một số mai mực

Nguyên liệu β-chitin

(%)

Protein (%)

Lipid (%)

CaCO 3

(%)

Khoáng (%)

Thành phần khoáng trong mai mực và trong vỏ tôm thẻ Penaeus vanamei (Bảng

1.3) cho thấy hàm lƣợng các nguyên tố Ca, Fe, K, Mg, Na và Zn trong mai mực thấp

hơn rất nhiều so với trong vỏ tôm Ví dụ, hàm lƣợng Ca trong mai mực Loligo

lessoniana là 17,74 ppm trong khi trong vỏ tôm là 4856 pmm, cao gấp 250 lần Hơn

nữa, đáng chú ý là các kết quả công bố đều cho thấy mai mực không chứa các kim loại

nặng nhƣ Hg, Pb và As Như vậy, phế liệu mai mực ống là nguồn nguyên liệu tiềm

năng để thu nhận -chitin có độ tinh khiết cao

Bảng 1.3 Thành phần ho ng của ngu n liệu mai mực

Nguyên liệu Khoáng

(%)

TLTK (ppm)

Illex argentinus 1,00 170 - 210 100 450 - [47]

Loligo lessoniana; Loligo

formosana 0,04 17,74 7,73 - 3,30 - - [36] Loligo sp 2,4 1025 30 255 1220 8540 200 [38]

Loligo plei; Loligo

sanpaulensis 1,9 94,5 3,5 - 11,7 - - [95]

Vỏ tôm thẻ (Penaeus vanamei) 26,6 4856 15,67 2437 - 1594 11,8 [2]

Trong nguyên liệu, chitin tồn tại dưới dạng liên kết với các thành phần như protein, chất khoáng, chất màu, lipid và các hợp chất khác với hàm lượng biến đổi tùy theo loại nguyên liệu Vì vậy, nên trong quá trình tách chiết, thu nhận chitin cần phải khử các hợp chất phi chitin này Có nhiều nghiên cứu công bố về sự tồn tại các liên kết này, trong đó các nghiên cứu của Rinaudo (2006) và Lavall (2007) cho thấy chitin tồn tại dưới dạng liên kết với các thành phần khác như protein, cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác dưới dạng phức hợp gây khó khăn cho việc tách chiết và thu nhận chitin [95, 134]

Hình 1.2 Mô hình cấu tr c chitin trong mai mực ngu n liệu [112, 170]

Tương tự, Armenta (2009) và Nikolov (2010) đã đưa ra mô hình mô tả chitin trong nguyên liệu được bao bọc bởi các sợi xoắn protein tạo nên cấu trúc vững chắc bảo

vệ cơ thể sinh vật (Hình 1.2 và Hình 1.3) [16, 112], nghiên cứu cho thấy cấu trúc chitin trong lớp biểu bì có các thuộc tính bất đẳng hướng, các mô khoáng liên kết chặt chẽ với các sợi chitin-protein tạo nên cấu trúc dạng tấm và được vôi hóa bằng các muối cacbonat canxi làm cho lớp vỏ có độ cứng chắc bảo vệ cơ thể sinh vật mềm yếu bên trong

O H HOH2C

O

NH O

H

O HOH2C

OH

HOH2C C

CH2R

O

O R

H

H H

n

Hình 1.3 Một iểu mô phỏng những li n ết hóa học có thể tạo ra giữa chitin với

astaxanthin và c c ph n tử h c trong ngu n liệu [16]

Các kết quả nghiên cứu Kristbergsson, Einrsson và Peter năm 2003 cũng cho thấy chitin trong cấu trúc nguyên liệu có các liên kết rất chặt chẽ với các thành phần khác nhƣ protein, cacbonat canxi, lipid, chất màu, khoáng chất và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc nghiên cứu tách chiết và thu nhận chitin (Hình 1.4)

Hình 1.4 Mô hình cấu tr c lớp vỏ tôm [88]

Mai mực ống là thành phần xương sụn bên trong các loài mực ống bao gồm

Loligo lessonicana, Loligo formosana, Loligo vulgaris, Ommasterphes bartrami, và Illex argentines Hiện nay, đây là nguồn duy nhất để thu nhận β-chitin [79] Kết quả

ảnh quét điện tử (SEM) bề mặt mai mực ống nguyên liệu (Hình 1.5) cho thấy các lớp chitin và protein được phân bố đan xen tạo nên cấu trúc sụn mềm của mai mực ống

Hình 1.5 Ảnh quét kính hiển vi điện tử SEM của mai mực ống [95]

Như vậy, do hàm lượng các thành phần khoáng và màu trong mai mực rất thấp so với trong vỏ tôm, cua và ghẹ nên qui trình thu nhận chitin/chitosan từ mai mực có thể

bỏ qua 2 công đoạn khử khoáng và khử màu So sánh các công đoạn thu nhận chitin từ các nguồn khác nhau được trình bày trong Hình 1.6

Qui trình sản xuất chitin thông thường gồm các công đoạn tách protein, tách khoáng và tẩy màu Đối với công đoạn tẩy màu ở các nước nhiệt đới như Việt Nam thường thực hiện kết hợp với quá trình phơi khô trực tiếp sản phẩm chitin dưới ánh nắng mặt trời Sau đó quá trình deacetyl chitin được thực hiện nhằm tách nhóm acetyl thu nhận sản phẩm chitosan (deacetylation) Hiện nay, tất cả các công đoạn trên có thể thực hiện thông qua 3 phương pháp: Phương pháp hóa học, phương pháp sinh học và phương pháp kết hợp hóa học và sinh học tùy theo loại nguyên liệu, công nghệ và yêu cầu về chất lượng sản phẩm chitin và chitosan mà các điều kiện xử lý sẽ khác nhau

Khử protein trong môi trường kiềm (NaOH, KOH)

Khử khoáng trong môi trường acid (HCl, HNO3, )

Khử màu (H2O2, KMnO4, NaOCl, )

Thu nhận chitin

Deacetyl trong môi trường kiềm (NaOH, KOH)

Thu nhận chitosan

Cắt mạch chitosan (H2O2, enzyme)

Khử protein trong môi trường kiềm (NaOH, KOH)

Thu nhận chitin

Deacetyl trong môi trường kiềm (NaOH, KOH)

Thu nhận chitosan

Cắt mạch chitosan (H2O2, enzyme)

Tolaimate và cộng sự (2000) đã sử dụng mai mực ống Loligo vulgaris để xử lý

thu nhận -chitin Trong quá trình xử lý, mai mực được loại khoáng trước trong dung

dịch acid HCl 0,55M, tỷ lệ 1/10 (w/v) ở nhiệt độ phòng, quá trình này được lập lại 2 lần, mỗi lần 2 giờ, sau đó tiếp tục khử protein trong dung dịch NaOH 0,3M, tỷ lệ 1/10 (w/v) ở nhiệt độ 80-85C, quá trình này cũng được lập lại 2 lần, mỗi lần 1 giờ Mục đích của việc xử lý nhiều lần trong thời gian ngắn là để hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch chitin trong khi xử lý Tuy nhiên, quá trình khử khoáng cũng dẫn đến sự cắt mạch của chitin Đồng thời, việc xử lý nước thải của quá trình khử khoáng cũng dẫn đến tăng chi phí sản xuất và đặc biệt khi áp dụng ở quy mô công nghiệp

Pawadee Methacanon và cộng sự (2003) thu nhận chitin và chitosan từ loài mực

ống Loligo formosana Sasaki, Thái Lan Quá trình thu nhận chitin được tiến hành theo

2 bước: khử khoáng được thực hiện trong HCl 0,1M, tỷ lệ 1/10 (w/v) trong 12 giờ ở nhiệt độ 30oC và khử protein ở NaOH 3M, tỷ lệ 1/10 trong 3 giờ ở 80-85oC Sau đó, chitin được tiến hành deacetyl thu nhận chitosan trong điều kiện: NaOH 60%, nhiệt độ

80C và thời gian 2 giờ Chitosan thu được có DD > 90% Mặc dù các điều kiện xử lý khá phù hợp nếu đưa vào sản xuất ở qui mô lớn Tuy nhiên, quá trình khử khoáng cũng dẫn đến sự cắt mạch của chitin và cần tiến hành bước xử lý nước thải của quá trình này

Chaussard và Alain Domard (2004) đã nghiên cứu thu nhận β-chitin từ mai mực

ống (loligo) đánh bắt tại biển Ả-rập Chitin thu nhận được từ mai mực thông qua khử

khoáng (HCl 1M, 24 giờ, nhiệt độ phòng) và khử protein (NaOH 1M, 24 giờ, nhiệt độ phòng) Sản phẩm chitin chứa hàm lượng protein (1,9  1 wt.%) và khoáng (0,1 wt.%) Mặc dù kết quả phân tích ICP cho thấy hàm lượng khoáng trong mai mực nhỏ (2,4 wt.%) nhưng các tác giả vẫn tiến hành bước khử khoáng Điều này cũng có thể dẫn đến sự cắt mạch chitin và tăng chi phí sản xuất, xử lý nước thải

Chandumpai và cộng sự (2004) đã tách chiết và đánh giá tính chất β-chitin thu

được từ mai của mực Loligo lessoniana và Loligo formosana Qui trình thu nhận bỏ

qua bước khử khoáng Quá trình khử protein (NaOH 1M, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch 1:13 (w/v), 50oC, 5 giờ) Sản phẩm chitin có hàm lượng khoáng không phát hiện với hiệu suất thu hồi chitin là 35 – 38% Quy trình thu nhận đã bỏ qua bước khử khoảng bằng dung dịch HCl sẽ giảm sự cắt mạch của chitin, giảm chi phí sản xuất

Quá trình deacetyl tiến hành trong dung dịch NaOH 50% (w/v), tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch 1:15 (w/v), 100oC và 8 giờ Sản phẩm chitosan có khối lượng phân tử

9,50  0,12 x 106 Da (Loligo lessoniana) 9,69  0,10 x 106 Da (Loligo formosana) và

độ deacetyl là gần 90% đối với cả 2 loài sau thời gian 8 giờ Mặc dù sản phẩm thu được có khối lượng phân tử và độ deacetyl cao nhưng việc xử lý ở nhiệt độ cao có thể gây cắt mạch chitosan và tăng chi phí sản xuất

Rodrigo L Lavall và cộng sự (2007) đã nghiên cứu thu nhận chitin trên mai

mực của 2 loài Loligo plei và Loligo sanpaulensis thu nhận ở Brazil Kết quả nghiên

cứu cho thấy hàm lượng chitin trong mai mực chiếm 40-42% tổng trọng lượng khô tuyệt đối, do hàm lượng khoáng trong mai mực nguyên liệu thấp nên chỉ cần xử lý kiềm 2 lần là đủ điều kiện hàm lượng khoáng còn lại trong chitin nhỏ hơn 1% Tuy nhiên, tác giả mới dừng lại ở việc thu nhận chitin, đánh giá tính chất hóa lý của sản phẩm thu được mà chưa có nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện thu nhận đối với sự cắt mạch của chitin, quá trình deacetyl thu nhận chitosan, tính chất sinh học của các sản phẩm

Barwin Vino và cộng sự (2011) đã công bố kết quả điều kiện thu nhận -chitin

và chitosan từ mai mực ống Doryteuthis sibogae tại Ấn Độ Mai mực sau khi rửa sạch,

sấy khô, cắt nhỏ và khử khoáng trước ở điều kiện dung dịch HCl 2N ở nhiệt độ phòng, thời gian 24 giờ với tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch HCl là 1/5 Sau quá trình khử khoáng mai mực được rửa sạch đến trung tính và tiếp tục được xử lý khử protein trong điều kiện NaOH 1N ở nhiệt độ phòng, trong thời gian 24 giờ với tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch là 1/5 Kết quả đánh giá cho thấy hàm lượng -chitin đạt 33% và hàm lượng protein từ 60-65% tổng trọng lượng khô tuyệt đối mai mực nguyên liệu, và có DD > 45% Hàm lượng khoáng còn lại rất thấp, cụ thể: Mn (0.260ppm), Cu (0.905ppm), Mg (11.01ppm) và Ca (24ppm) Quá trình deacetyl được thực hiện trong dung dịch NaOH 40% ở nhiệt độ 110C, trong 6 giờ với tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch là 1/5 Chitosan thu được có màu trắng, có DD > 78% Trong nghiên cứu này, tác giả đã tiến hành quá trình khử khoáng bằng HCl Do đó, nó cũng dẫn đến cắt mạch chitin, tăng chi phí sản xuất Ngoài ra, quá trình deacetyl tiến hành ở nhiệt độ cao, chitosan thu được có độ deacetyl thấp cũng là các nhược điểm của phương pháp thu nhận

Youn và cộng sự (2012, 2013) đã có những nghiên cứu khá đầy đủ về thu nhận

chitin và chitosan từ mai mực Todarodes pacifica thu tại Hàn Quốc Điều kiện tối ưu

cho quá trình thu nhận chitin: khử protein trong dung dịch NaOH 3%, thời gian 30 phút, nhiệt độ 121oC, áp suất 15 psi, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10; khử khoáng trong dung dịch HCl 1N, thời gian 30 phút, nhiệt độ phòng, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10 Chitin thu được có hàm lượng protein (6,29% Nitơ) và khoáng thấp (0,25%) Điều kiện deacteyl thu nhận chitosan: dung dịch NaOH 35-45%, thời gian 15-60 phút, nhiệt độ 121oC, áp suất 15 psi, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10 Độ deacetyl của chitosan thu được là 87,1-96,2% Mặc dù, sản phẩm thu được có chất lượng tốt nhưng do quá trình xử lý ở nhiệt độ (121oC) và áp suất cao (15 psi), có khử khoáng bằng HCl sẽ dễ dẫn đến cắt mạch chitin và chitosan, đồng thời khó khắn khi áp dụng sản xuất ở qui mô công nghiệp

Jung và cộng sự (2011, 2012, 2013) có những nghiên cứu hệ thống và tương đối

đầy đủ về thu nhận, đánh giá tính chất của chitin và chitosan từ mai mực Dosidicus

gigas thu tại công ty chế biến của Hoa Kỳ (Dosidicus LLC) Điều kiện tối ưu cho quá

trình thu nhận chitin: khử protein trong dung dịch NaOH 5%, thời gian 72 giờ, nhiệt

độ phòng, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10; bỏ qua quá trình khử khoáng Quá trình deacteyl thu nhận chitosan tiến hành theo hai phương pháp: (1) dung dịch NaOH 50%, thời gian 6 giờ, nhiệt độ 90oC thu được chitosan có độ deactyl 97%, (2) dung dịch NaOH 40%, thời gian 4 giờ, nhiệt độ 90oC thu được chitosan có độ deactyl 86% Sản phẩm chitin và chitosan có chất lượng tốt Các tính chất hóa lý đã được đánh giá và

hoạt tính sinh học của chitosan thu được gồm hoạt tính kháng khuẩn (E Coli và L

innocua) và tính chất chống oxy hóa đã được khảo sát Tuy nhiên, các nghiên cứu này

chỉ tập trung vào một đối tượng mai mực (Dosidicus gigas), các nghiên cứu hoạt tính sinh học mới chỉ dừng lại ở nghiên cứu in vitro

1.2 TỔNG QUAN VỀ β-CHITIN VÀ CHITOSAN

1.2.1 Cấu tr c hóa học, nguồn gốc tự nhi n và tính chất của c c dạng chitin

Chitin là thành phần chính trong cấu trúc lớp vỏ của động vật chân đốt như vỏ tôm, cua, ghẹ; trong xương của động vật thân mềm như mai mực, trong tảo và trong thành vách tế bào nấm, nấm men [47, 93, 109] Chitin được cấu tạo từ các đơn vị N-acetyl-D-glucosamine (NADG) liên kết với nhau bằng các liên kết β-1,4-glucozid được mô tả ở Hình 1.7

Hình 1.7 Cấu tr c hóa học ph n tử chitin [176]

Dựa trên nguồn gốc và cấu trúc hóa học, chitin được chia làm 3 dạng: Dạng chitin đã được thương mại hóa và có nguồn thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ Trong khi dạng β-chitin thu nhận từ mai mực và dạng γ-chitin thu nhận từ vách tế bào nấm, nấm men [10, 36, 57, 80, 85, 95] Ba dạng chitin này khác nhau về số mạch chitin, sự sắp xếp các mạch này và kích thước của chúng trong mỗi đơn vị cấu trúc (Hình 1.8)

α-Cụ thể, α-chitin gồm các mạch chitin sắp xếp song song ngược chiều nhau (Hình 1.8a)

và được thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua và vỏ ghẹ Còn β-chitin gồm các mạch chitin sắp xếp song song cùng chiều (Hình 1.8b), có tính hydrat hóa cao và được thu nhận chủ yếu từ mai mực ống Trong khi, γ-chitin là sự kết hợp của 2 dạng α và β (Hình 1.8c) và thường được thu nhận từ vách tế bào nấm và vách tế bào vi khuẩn Các cấu trúc khác nhau dẫn đến tính chất cũng khác nhau Cụ thể, α-chitin có độ rắn tinh thể (CrI) cao nhất, còn β-chitin thì có độ rắn thấp nhất

Hình 1.8 Sự sắp xếp của chuỗi chitin: (a) α-chitin, ( ) β-chitin, (c) γ-chitin [57]

Sự khác biệt này ảnh hưởng đến đến tính hydrat hóa, độ rắn tinh thể của từng dạng chitin, do đó ảnh hưởng đến khả năng khử gốc acetyl và dạng cấu trúc mạch tinh thể trong dung môi hòa tan, điều này quyết định các tính chất chức năng sinh học đặc biệt là khả năng kháng khuẩn của chúng [36, 93, 169]

Cấu trúc phân tử và các liên kết chính của hai dạng -chitin và β-chitin được biểu diễn trong Hình 1.9 Từ cấu trúc phân tử có thể thấy chitin có cấu trúc chặt chẽ nên rất khó bị hòa tan trong các dung môi khác nhau Thực tế, chitin chỉ hòa tan được trong một số dung dịch acid đậm đặc như HCl, H3PO4 và dimethylacetamide (DMAc) chứa 5% lithium chloride

Hình 1.9 Cấu tr c ph n tử (a) α-chitin ( ) β-chitin [21, 57]

Đặc biệt, các liên kết hydro nội phân tử giữa các nhóm hydroxyl và acetamide được mô tả cụ thể hơn trong Hình 1.10 Trong đó cho thấy, các chuỗi chitin là tổ chức

ở dạng tấm sắp xếp song song và chúng được liên kết chặt chẽ với nhau thông qua các liên kết hydro nội phân tử của các nhóm amin và carbonyl (C-O ··· NH) chạy dọc theo một trục và có khoảng cách khoảng 0,47 nm Đáng lưu ý là trong cấu trúc của α-chitin

có một số liên kết hydro giữa các tấm dọc theo trục b của các mạch đơn vị do các nhóm hydroxymethyl của chuỗi liền kề, tính năng đặc biệt này không được tìm thấy trong cấu trúc của β-chitin [94,100,106] Điều này đã tạo ra sự khác biệt về cả tính chất hóa lý và hoạt tính sinh học của các dạng α-chitin và β-chitin Nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng β-chitin có tính trương nở với nước cao hơn so với α-chitin [53]

Hình 1.10 Cấu tr c α-chitin và -chitin [134]

Chitin tự nhiên có độ deacetyl dao động trong khoảng từ 8-12%, phân tử lƣợng trung bình lớn hơn 1 triệu dalton Tuy nhiên, chitin chiết rút từ vi sinh vật thì có phân

tử lƣợng thấp, chỉ khoảng vài chục ngàn dalton Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc thì chitin bị khử gốc acetyl tạo thành chitosan Khi đun nóng chitin trong dung dịch HCl đặc thì chitin sẽ bị thủy phân tạo thành các phân tử glucosamine có hoạt tính sinh học cao

Hình 1.11 Phổ XRD của α-chitin và β-chitin [95]

Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) trong Hình 1.11 cho thấy độ kết tinh của của α-chitin (85%) từ vỏ ghẹ cao hơn nhiều so với độ kết tinh của β-chitin (72%) từ mai mực ống [95] Các nghiên cứu đã chứng minh độ kết tinh, kích thước của tinh thể và mức độ định hướng của các mạch có ảnh hưởng rất lớn đến lượng nước hấp thụ trong mạng lưới polyme cũng như độ tan của chúng [68, 79, 95, 112, 123] Vì vậy, nó sẽ ảnh hưởng đến những ứng dụng tiềm năng của chitin như trong hệ dẫn thuốc, màng chữa lành vết thương nơi mà ái lực với nước đóng vai trò rất quan trọng Hơn nữa, sự khác biệt giữa -chitin và β-chitin dẫn đến sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chitosan thu được khi tiến hành quá trình deacetyl Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chitosan thu được từ β-chitin có độ rắn thấp và độ xốp cao được nghiên cứu và ứng dụng trong nuôi cấy mô, cố định tế bào và enzyme [76, 87, 89] Hoạt tính kháng khuẩn

và kháng nấm của β-chitosan cũng được chứng minh tốt hơn -chitosan [42, 79, 148] Ngoài ra, khi sản xuất chitosan mạch ngắn để tăng độ kháng nấm, kháng khuẩn thì nguyên liệu β-chitin dễ thực hiện cắt mạch hơn vì tính xốp cao, độ rắn thấp, độ trương cao

1.2.2 Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan

Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl khỏi mạch chitin còn gọi là quá trình deacetyl hoá, vì vậy chitosan là polyme chứa rất nhiều các đơn vị Glucosamine nên có rất nhiều nhóm amin So sánh cấu trúc hóa học phân tử của chitin và chitosan được trình bày trong Hình 1.12 Công thức cấu tạo của chitosan gần giống như chitin và cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở cacbon vi trí thứ 2

Hình 1.12 Cấu tr c hóa học của chitosan

Không giống như chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ thông thường như acid formic, acid acetic, acid propionic, acid citric, acid lactic

Hằng số phân li acid (pKa) của chitosan có giá trị từ 6,2 đến 6,8 nên khi hoà tan trong môi trường acid loãng chitosan tạo thành dung dịch keo dương, đây là một điểm rất đặc biệt vì đa số các keo polysaccharit tự nhiên tích điện âm Trong khi chitosan tích điện dương nên có khả năng bám dính bề mặt trên các ion tích điện âm, có khả năng tạo phức với các ion kim loại và tương tác tốt với các polyme tích điện âm [6] Ngoài ra, loại dung môi acid cũng ảnh hưởng đến các hoạt tính sinh học của chitosan khi hòa tan Beverlya và cộng sự (2008) đã cho thấy chitosan trong dung môi axit acetic có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với acid lactic

Một số dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan được trình bày ở Bảng 1.4 Tuy nhiên cần chú ý là chitosan không hoà tan trong nước, trong dung dịch kiềm

Bảng 1.5 Tính chất của chitosan ảnh hưởng ởi độ deacet l [144]

Tính chất Chitosan với độ deacet l h c nhau

Độ deacetyl của chitin và chitosan (DD) là một thông số quan trọng, đặc trưng cho tỉ lệ liên kết giữa 2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose với 2-amin-2-deoxy-D-glucopyranose trong phân tử chitin và chitosan Chitin có độ deacetyl thấp còn chitosan thì có độ deacetyl cao, tức là chứa nhiều nhóm amin

Bảng 1.6 Thành phần và tính chất của một số loại chitosan thương mại [43] Sản

phẩm

Hàm lượng

nitơ (%)

Hàm lượng khoáng (%)

Độ deacetyl (%)

Mật độ khối (g/ml)

Độ nhớt (cP)

Dạng phân bố rời rạc (random) của phân tử chitosan:

D-D-A-D-D-A-D-D-D-D-A-D-D-A-D-D-A-D-D-D-A-D-D-D-D- Dạng phân bố dạng khối (block) của phân tử chitosan:

D-D-D-D-D-D-D-A-A-A-A-A-D-D-D-D-D-D-D-D-A-A-A-D-D- Trong đó: D: D-glucosamine, A: N-acetyl glucosamine

Khối lượng phân tử trung bình của chitosan (Mw) là một thông số cấu trúc quan trọng, nó quyết định tính chất của chitosan như khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật Chitosan có phân

tử lượng càng lớn thì có độ nhớt càng cao Thông thường, phân tử lượng của chitosan nằm trong khoảng từ 100.000 dalton đến 1.200.000 dalton [43] Phân tử lượng của chitosan phụ thuộc vào nguồn chitin, điều kiện deacetyl và thường thì rất khó kiểm

soát Chitosan có phân tử lượng thấp thường có hoạt tính sinh học cao hơn nên có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học Chitosan có phân tử lượng lớn

có khả năng tạo màng tốt và màng chitosan tạo thành có sức căng tốt Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào phân tử lượng Chitosan có phân tử lượng thấp có độ nhớt từ 30-

200 cps và chitosan có phân tử lượng lớn hơn 1 triệu dalton có độ nhớt lên đến 3000-4000 cps Ngoài ra, độ nhớt của chitosan còn phụ thuộc vào độ deacetyl, cường độ ion, pH, nhiệt độ

1.2.3 Phương ph p thu nhận chitin và chitosan

Trong nguyên liệu, chitin liên kết chặt chẽ với các thành phần như protein, khoáng, chất màu, lipid và các hợp chất khác dưới dạng các phức hợp với hàm lượng biến đổi tùy theo loại nguyên liệu Do đó để thu nhận chitin thì cần phải khử các hợp chất phi chitin này Hiện nay có 3 phương pháp thu nhận chitin và chitosan được sử dụng (Hình 1.13)

Khử ho ng

1 Dùng axit vô cơ

2 hoặc dùng axit hữu cơ

1 Dùng hóa chất: kiềm (NaOH, KOH)

2 Hoặc dùng enzyme (chitin deacetylase)

Phế liệu thủ sản

(Vỏ tôm, cua, ghẹ, mực)

Hình 1.13 Sơ đồ qu trình sản xuất chitin/chitosan từ phế liệu thủ sản

+ Các nghiên cứu đánh giá chi tiết về các phương pháp xử lý hóa học khác nhau

để thu nhận chitin từ phế thải động vật giáp xác, nhuyễn thể đã được thực hiện từ năm

1954 đến 1993 [113] Naznin và cộng sự (2005) đã khảo sát các điều kiện khác nhau cho quá trình khử khoáng (DM) và khử protein (DP) để thu chitin từ vỏ tôm

(Metapenaeus monoceros) và quá trình đánh giá cho thấy đầu tiên protein được tách ra

khỏi nguyên liệu bằng cách xử lý với natri hydroxit (NaOH) hoặc kali hydroxit (KOH)

ở nhiệt độ cao, nồng độ kiềm thường là từ 1% đến 10% với nhiệt độ từ 30°C đến 100°C, tiến hành khử protein độc lập với quá trình khử khoáng là tốt nhất Thời gian phản ứng thường được sử dụng khác nhau từ 30 phút đến 12 giờ [110] Shahidi và cộng sự (1991) và Synowiecki và cộng sự (2000) đã công bố điều kiện tối ưu cho quá trình khử protein (DP) vỏ cua và vỏ tôm là 1-2% KOH ở 90°C với tỷ lệ dung dịch kiềm là 1:20 (w/v), thời gian tối thiểu là 1 giờ, đây là thời gian cần thiết để loại bỏ 90% protein và sau 2 giờ khử sẽ loại bỏ hầu hết các protein trong nguyên liệu [141, 150]

Việc loại bỏ canxi cacbonat, canxi phosphat và các muối khoáng khác trong vỏ phế thải thủy sản thường được thực hiện trong môi trường acid HCl loãng, ở nhiệt độ phòng trong thời gian từ 2-3 giờ [113] Để giảm thiểu những biến đổi của chitin trong quá trình thu nhận, sử dụng ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) cho DM hoặc kết hợp

DP và DM đã được Foster, Hackman (1957) và Austin (1981) nghiên cứu [17, 61]

1.2.3.2 Phương ph p sinh học

+ Nguyên tắc: Sử dụng các enzyme hoặc acid hữu cơ từ visinh vật trong các bước khử khoáng, khử protein và deacetyl thu nhận chitin và chitosan

Ưu và nhược điểm: Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng enzyme hoặc

vi sinh vật lên men khi để thủy phân, loại protein thì sản phẩm chitin, chitosan thu

được có phân tử lượng lớn và độ nhớt cao hơn so với sản phẩm thu được từ quy trình

xử lý hóa học Tuy nhiên, các quy trình thủy phân protein bằng enzym hoặc sử dụng quá trình lên men đều có nhược điểm là không tách triệt để protein, thông thường lượng protein còn lại trong chitin tương đối cao từ 6-12% Ngoài ra, chi phí xử lý bằng enzym cao hơn xử lý bằng phương pháp hoá học, mặc khác quá trình lên men thì cần nhiều thời gian từ 5-14 ngày Đây chính là một số khó khăn chính khi triển khai ở quy

mô lớn trong quá trình sản xuất chitin Tổng hợp các nghiên cứu cho thấy, từ những năm 1960, một số nghiên cứu đã ứng dụng enzym protease để thủy phân protein trong phế liệu giáp xác đã được thực hiện bởi Takeda và Abe (1962), Takeda và Katsuura (1964) [113] Những năm tiếp theo và gần đây, sử dụng enzyme càng được quan tâm, thể hiện qua các nghiên cứu của Shimahara và Takiguchi (1988) đã dùng enzym

protease vi sinh vật từ Pseudomonas maltophilia để khử protein trong vỏ tôm, cua

Enzym proteinase từ cá ngừ tại pH 8,6 và 37,5oC, papain tại pH 5,5 – 6,0 và 37,5oC, hoặc proteinase vi sinh ở pH 7,0 và 60oC trên 60 giờ cũng đã được nghiên cứu thủy phân protein trong quá trình sản xuất chitin Sau khi xử lý với enzym, hàm lượng protein còn lại trong chitin khoảng 5% [92] Nellie Gagne và cộng sự (1993) đã dùng hai enzym protease là chymotrypsin và papain để thủy phân protein trong phế liệu tôm

đã được khử khoáng để thu hồi chitin Các điều kiện tối ưu cho công đoạn khử protein bằng chymotrypsin là nhiệt độ trong khoảng 40oC, pH 8,0 và tỷ lệ enzym với phế liệu tôm (E/W) là 7:1000 (w/w) Với papain, nhiệt độ là 38oC, pH 8,7 và E/W là 10:1000 (w/w) Lượng protein còn lại trong phế liệu tôm sau khi khử protein là khá thấp, cụ thể

là 1,3 và 2,8% đối với các mẫu xử lý chymotripsin và papain [62] Synowiecki và cộng

sự 2000 dùng enzym alcalase để thủy phân protein từ phế liệu tôm Crangon, thu hồi được 64,3% protein Sử dụng protease để thay thế cho NaOH khắc phục được các hạn chế của việc sử dụng hóa chất [150]

Một số nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm quá trình khử khoáng bằng lên men lactic hoặc sử dụng các axit hữu cơ như axit lactic, axit acetic thu nhận từ các quá trình sinh học Charoenvuttiham và cộng sự 2006 đã sử dụng hỗn hợp axit hữu cơ (0,25M HCOOH và 0,25M C6H8O7 theo tỷ lệ 1:2, v/v) là 1:28 (w/v) để tách khoáng đạt được độ tinh sạch của chitin thu được là 88,11,8% Mahmoud và Ghaly (2006)

đã dùng các axit hữu cơ (lactic axit và acetic axit ) từ quá trình lên men nước váng

sữa để khử khoáng của vỏ tôm, cua Kết quả cho thấy hiệu quả của việc dùng lactic axit hoặc axit acetic để khử khoáng tương đối cao, tuy có thấp hơn khi khử khoáng bằng HCl Điều kiện thích hợp để khử khoáng bằng axit hữu cơ: tỷ lệ nguyên liệu và axit là 1:20, nhiệt độ 24oC, thời gian 2 giờ Với điều kiện trên, khoáng được khử khỏi

vỏ tôm đạt 97,4% đối với lactic axit , 86,4% đối với axit acetic [65]

Ngoài ra, phương pháp lên men axit lactic là một trong những phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất chitin [82, 129, 131, 162] Quá trình chiết rút chitin từ phế liệu tôm dùng vi sinh vật để tạo axit và enzym protease trong các công đoạn khử khoáng và khử protein từ vỏ tôm Axit lactic được sinh ra từ glucose, tạo môi trường pH thấp trong quá trình ủ xilô để ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây

hư hỏng phế liệu [142] Axit lactic phản ứng với các hợp chất calcium carbonate trong

vỏ giáp xác, hình thành kết tủa calcium lactate, bị loại ra sau khi rửa, giúp loại bỏ khoáng khỏi vỏ Quá trình khử protein xảy ra chủ yếu do các enzym protease được tạo

ra từ các chủng vi sinh vật Lactobacillus cấy vào và từ hệ enzym tồn tại trong phế liệu

tôm, cua [26, 46, 142] Một số loại vi sinh vật đã được nghiên cứu gồm có

Lactobacillus plantarum [130], Pseudomonas aeruginosa và Pseudomonas maltophilia [162], Bacillus subtilis [171], Lactobacillus paracasei [142], Lecanicillium fungicola [128] và Penicillium chrysogenum [119]

Hiệu quả của quá trình lên men dùng vi khuẩn sinh axit lactic phụ thuộc vào những yếu tố như lượng vi sinh vật cho vào, nồng độ glucose bổ sung vào, pH ban đầu

và pH trong quá trình nuôi cấy, nồng độ và loại axit được dùng và thời gian lên men Tất cả các yếu tố trên đã được Rao và cộng sự (2000) nghiên cứu trong quá trình sản xuất chitin bằng phương pháp lên men vi sinh [130] Kết quả cho thấy, bổ sung 5% glucose vào phế liệu tôm đã thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn lactic và quá trình lên men tốt hơn Trong 4 loại axit dùng để điều chỉnh độ pH từ thời điểm bắt đầu lên men

và trong suốt quá trình lên men, axit acetic và axit citric có hiệu quả nhất Phế liệu tôm

được lên men với 10% Lactobacillus plantarum cấy vào, bổ sung 5% glucose, pH 6,5

điều chỉnh bằng axit acetic, hiệu suất khử protein là 75%, khử khoáng được 86% Nếu thay thế axit acetic bằng axit citric thì hiệu suất khử protein là 88% và khử khoáng là 90% Trong quá trình lên men này, hiệu suất khử khoáng và chất lượng của các sản phẩm thu được rất cao và nếu bổ sung protease thương mại có thể nâng cao hiệu suất