Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)

Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HOÀNG NGỌC CƯƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP GÂY BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ MAI MỰC ỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT KHÁNH HÒA - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HOÀNG NGỌC CƯƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP GÂY BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ MAI MỰC ỐNG NGÀNH ĐÀO TẠO : CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN MÃ SỐ : 62540105 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRANG SĨ TRUNG PGS.TS NGUYỄN ANH TUẤN KHÁNH HÒA - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình thực Các số liệu, kết luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm lời cam đoan Nha Trang, ngày tháng Tác giả luận án Hồng Ngọc Cương i năm 2017 LỜI CẢM ƠN Luận án hồn thành nhờ có nhà trường, tổ chức có liên quan tạo điều kiện; thầy cơ, bạn bè, gia đình giúp đỡ hỗ trợ Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS TS Trang Sĩ Trung PGS TS Nguyễn Anh Tuấn định hướng, dẫn động viên suốt trình học tập nghiên cứu luận án Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Phòng, Ban, Khoa, Viện liên quan cho phép tạo điều kiện thuận lợi trình thực luận án Ban giám hiệu Trường Đại học Bình Dương, Lãnh đạo Khoa Cơng nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi q trình thực luận án TS Nguyễn Văn Hòa, Ths Nguyễn Cơng Minh tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi trình thực luận án TS Huỳnh Thanh Tùng, PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, TS Khổng Trung Thắng giúp đỡ, chia sẻ nhiều kinh nghiệm quí báu Các cán kỹ thuật Viện Công nghệ Sinh học Mơi trường, Trung tâm Thí nghiệm Thực hành – Trường Đại học Nha Trang giúp đỡ tạo điều kiện trọng trình tiến hành nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lòng ân tình tới gia đình, người thân yêu nguồn động viên chia sẻ khó khăn để luận án hồn thành Nha Trang, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Hoàng Ngọc Cương ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH viii ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xii PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP ĐỂ THU NHẬN -CHITIN 1.1.1 Giới thiệu nguyên liệu mực ống Loligo sp phế liệu từ mực sau chế biến 1.1.2 Cấu trúc thành phần hóa học nguyên liệu mai mực ống Loligo sp 1.2 TỔNG QUAN VỀ β-CHITIN VÀ CHITOSAN 16 1.2.1 Cấu trúc hóa học, nguồn gốc tự nhiên tính chất dạng chitin 16 1.2.2 Cấu trúc hóa học tính chất chitosan 20 1.2.3 Phương pháp thu nhận chitin chitosan 23 1.2.4 Đặc tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn chitosan 36 1.3 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH 39 1.3.1 Giới thiệu chung nguồn nguyên liệu cà chua sau thu hoạch 39 1.3.2 Tổng quan bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại cà chua sau thu hoạch 41 1.3.3 Giới thiệu chủng vi khuẩn Erwinia spp gây bệnh thối nhũn 42 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.1 VẬT LIỆU 45 2.1.1 Mai mực ống Loligo sp 45 2.1.2 Trái cà chua Lycopersicon esculetum 45 2.1.3 Hóa chất dùng nghiên cứu 46 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 46 2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thu nhận β-chitin 49 iii 2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện deacetyl β-chitin thu nhận chitosan 55 2.2.4 Bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn 62 2.2.5 Bố trí thí nghiệm tổng quát đánh giá khả kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trái cà chua sau thu hoạch β-chitosan điều kiện in vitro in vivo 64 2.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU 71 2.3.1 Phương pháp xác định thành phần hóa học 71 2.3.2 Phương pháp xác định thành phần acid amin thành phần khoáng 71 2.3.3 Phương pháp xác định tính chất -chitin chitosan 71 2.3.4 Phương pháp cắt mạch chitosan 72 2.3.5 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn 73 2.3.6 Phương pháp chuẩn bị mẫu dịch vi khuẩn Erwinia carotovora 74 2.3.7 Phương pháp gây bệnh nhân tạo 75 2.3.8 Phương pháp đánh giá hiệu kháng khuẩn β-chitosan điều kiện in vitro75 2.3.9 Phương pháp đánh giá hiệu kháng khuẩn β-chitosan điều kiện in vivo 75 2.3.10 Phương pháp xác định tổng hàm lượng phenol tổng số trái cà chua 76 2.3.11 Phương pháp xử lý số liệu 76 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 77 3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MAI MỰC LOLIGO SP 77 3.1.1 Thành phần hóa học 77 3.1.2 Thành phần khoáng 79 3.1.3 Thành phần acid amin 80 3.2 XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT -CHITIN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP 82 3.2.1 Đánh giá sơ ảnh hưởng nhiệt độ, nồng độ NaOH thời gian đến trình khử protein mai mực Loligo sp 82 3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng chi tiết yếu tố nhiệt độ, thời gian nồng độ NaOH đến hiệu khử protein cắt mạch sản phẩm β-chitin 84 3.2.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu khử protein khối lượng phân tử sản phẩm β-chitin 85 3.2.2.2 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu khử protein khối lượng phân tử sản phẩm β-chitin 88 iv 3.2.2.3 Ảnh hưởng nồng độ NaOH đến hiệu khử protein khối lượng phân tử sản phẩm β-chitin 90 3.2.3 Tính chất sản phẩm β-chitin từ mai mực ống 92 3.3 ĐIỀU KIỆN DEACETYL -CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP 101 3.3.1 Đánh giá sơ ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH thời gian đến hiệu deacetyl -chitin .101 3.3.2 Ảnh hưởng chi tiết yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH thời gian đến hiệu deacetyl chitin cắt mạch chitosan 104 3.3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu deacetyl chitin cắt mạch chitosan .104 3.3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ NaOH đến hiệu deacetyl β-chitin cắt mạch chitosan 107 3.3.2.3 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu deacetyl chitin cắt mạch chitosan 108 3.3.3 Điều kiện deacetyl lần .110 3.3.4 Hiệu suất thu nhận tính chất sản phẩm chitosan 111 3.3.5 Đề xuất quy trình thu nhận chitin, chitosan từ mai mực ống Loligo sp 119 3.4 KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN 120 3.4.1 Nghiên cứu phân lập, khẳng định chủng Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trái cà chua sau thu hoạch 120 3.4.2 Khả kháng khuẩn β-chitosan điều kiện in vitro 127 3.4.3 Khả kháng khuẩn β-chitosan điều kiện in vivo 131 3.4.4 Đề xuất quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch dung dịch chitosan từ mai mực Loligo sp 139 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 141 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ .143 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 144 PHỤ LỤC 158 v DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AAS Atomic absorption spectrophotometric Phương pháp phổ hấp thu nguyên tử AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội nhà hoá phân tích thống ANOVA Analysis of Variance Phân tích phương sai -chitosan Chitosan from β-chitin Chitosan từ β-chitin χcr Degree of crystallinity Độ kết tinh C95 Tomato C95 Giống cà chua C95 CrI Crystalline Index Chỉ số kết tinh DA Degree of acetyl Độ acetyl DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DD Degree of deacetyl Độ deacetyl DP Deproteinization Quá trình khử protein DM Demineralization Q trình khử khống DC Decolorization Quá trình khử màu Ecc Erwinia carotovora subsp carotovora Erwinia carotovora subsp carotovora Eca Erwinia carotovora subsp atroseptica Erwinia carotovora subsp atroseptica Echr Erwinia chrysanthemi Erwinia chrysanthemi EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Ethylenediaminetetraacetic axit FTIR Fourier Transform Infrared Quang phổ hấp thụ hồng ngoại GlcN D-glucosamine D-glucosamine GlcNAc N-acetyl glucosamine N-acetyl glucosamine MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MHS Mark-Houwink-Sakurada equation Phương trình Mark-HouwinkSakurada Mw The average molecular weight Khối lượng phân tử trung bình NL/DM Material / solvent Nguyên liệu / dung môi vi Nd Not detected Không phát NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân OD Optical density Độ hấp phụ quang học Pl Pectate lyases Enzyme phân giải pectin Pnl Pectin lyases Enzyme phân giải pectin Pme Pectin methylesterases Enzyme phân giải pectin PA Polyamide Bao nylon PG Potato glucose Môi trường potato glucose PCR Polymerase chain reaction Phương pháp khuếch đại gen PDA Potato dextrose agar Môi trường thạch khoai tây rARN Ribosomal ribonucleic ARN riboxom SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét Size-exclusion chromatographySEC-MALLS Multi-angle static light scattering Phương pháp sắc ký loại trừ kết hợp với phân tán ánh sáng tĩnh đa góc sp Species Loài spp Species pluriel Nhiều loài subsp Subspecies Phân loài SPSS Statistical Package for the Social Sciences Phần mềm thống kê SS Sum of Squares Tổng bình phương độ lệch TEM Transmission Electron Microscope Kính hiển vi điện tử truyền qua TpHCM Ho Chi Minh City Thành phố Hồ Chí Minh TLTK References Tài liệu tham khảo VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers Hiệp hội chế biến xuất Thuỷ sản Việt Nam VNF Viet Nam Food Công ty Cp Việt Nam Food XRD X-ray powder diffraction Phổ nhiễu xạ tia X wt.% Weight percent Phần trăm theo khối lượng vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học nguyên liệu số loại phế liệu thủy sản thông dụng để sản xuất chitin Bảng 1.2 Thành phần hóa học số mai mực Bảng 1.3 Thành phần khoáng nguyên liệu mai mực Bảng 1.4 Các dung mơi thường sử dụng để hòa tan chitosan 21 Bảng 1.5 Tính chất chitosan ảnh hưởng độ deacetyl 22 Bảng 1.6 Thành phần tính chất số loại chitosan thương mại 22 Bảng 1.7 Điều kiện khử protein trình sản xuất chitin từ nguyên liệu khác 30 Bảng 1.8 Nguồn nguyên liệu thủy sản, điều kiện xử lý loại chitin 32 Bảng 1.9 Điều kiện deacetyl thu nhận chitosan từ nguồn chitin khác 34 Bảng 1.10 Khối lượng phân tử trung bình (Mw) chitosan điều kiện deacetyl khác 36 Bảng 1.11 Bảng tổng hợp chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn (soft rot) 43 Bảng 3.1 Thành phần hóa học mai mực ống Loligo sp 77 Bảng 3.2 Thành phần khoáng mai mực Loligo sp., loại mực khác vỏ tôm 79 Bảng 3.3 So sánh thành phần acid amin mai mực ống Loligo sp kết tham khảo 80 Bảng 3.4 Tính chất mai mực ống sản phẩm β-chitin 94 Bảng 3.5 Thành phần khoáng mai mực sản phẩm β-chitin 95 Bảng 3.6 Hàm lượng acid amin mai mực sản phẩm β-chitin 95 Bảng 3.7 Độ dịch chuyển hóa học proton DCl/D2O 25oC β-chitin 100 Bảng 3.8 Hiệu suất thu hồi chitin chitosan 112 Bảng 3.9 So sánh chất lượng thương mại chitosan β-chitosan 113 Bảng 3.10 Hàm lượng acid amin lại β-chitin β-chitosan 114 Bảng 3.11 Thành phần khoáng kim loại mai mực, β-chitin β-chitosan 115 Bảng 3.12 Độ dịch chuyển hóa học proton DCl/D2O 70oC β-chitosan 118 Bảng 3.13 Mẫu cà chua thu nhận từ chợ nông sản 121 Bảng 3.14 Kết đánh giá đặc tính sinh hóa sinh lý dòng vi khuẩn 123 Bảng 3.15 Khả kháng khuẩn Erwinia carotovora chitosan với khối lượng phân tử khác chitosan thương mại (C-120) 128 viii ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HOÀNG NGỌC CƯƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP GÂY BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ MAI. .. luận án: Nghiên cứu thu nhận đánh giá khả kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn cà chua sau thu hoạch chitosan từ mai mực ống Ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số: 62540105 Nghiên cứu. .. nhũn trái cà chua Từ vấn đề thực tế nêu, luận án tiến hành nội dung Nghiên cứu thu nhận đánh giá khả kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn cà chua sau thu hoạch chitosan từ mai mực ống Đây